專利名稱：于感染性與惡性疾病的治療中提升免疫反應的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療感染性與惡性疾病的新穎方法。
背景技術：
細胞毒T 淋巴細胞抗原 4 (Cytotoxic T-Iymphocyte antigen-4,CTLA-4)于 1987年被發(fā)現(xiàn)為免疫球蛋白超家族中的一新成員，其特征在于其亦具有變異(V)或恒定(C)免疫球蛋白區(qū)的重要結構性特征(Brunet et al. , Nature 328,267-270)。報導指出CTLA-4對于調節(jié)免疫系統(tǒng)亦扮演一重要的角色(Keilholz, U.，J Immunother 31,431-439)。CTLA-4被報導可通過與⑶28競爭⑶80/⑶86的結合位置以降低T細胞的活化(Rudd etal. , Immunol Rev 229,12-26)。雖然CTLA-4可保護個體免于罹患自體免疫性疾病，但它 亦會抑制抗癌的免疫力。為了避免CTLA-4于癌癥治療中可能造成的不良的免疫反應，已有許多方法在探討如何操控T細胞的共刺激路徑，以提升抗癌免疫反應。標靶CTLA-4療法為眾多先進的方法中的一種，且此方法已于后期的臨床試驗中顯示出具潛力的結果(Hodi et al. ,N Engl J Med 363, 711-723;Hodi, F. S. ,Asia Pac J Clin Oncol 6 SupplI, S16-23;ffeber, J. , Oncologist 13 Suppl 4，16-25;及 Ribas, A.，Oncologist 13 Suppl4，10-15)?？笴TLA-4的一種單株抗體，ipilimumab，已于2011年三月被FDA核準用以治療轉移性黑色素瘤。除了轉移性黑色素瘤外，目前CTLA-4抗體于眾多的臨床試驗中用于治療惡性腫瘤，包括胰臟癌、大腸直腸癌、肝細胞癌、淋巴癌、激素抗拒性前列腺癌、卵巢癌、及急性骨髓性白血病。計劃性死亡-I (Program death-1, PD-1)為0)28超家族中的一員，當與其的配體，計劃性死亡配體I及2 (PD-L1及PD-L2)，結合時可觸發(fā)負向的訊號路徑(Riley，J.L. ,Immunol Rev 229,114-125)。I3D-I與其配體間的交互作用會抑制增生、細胞激素的生成、及T細胞的細胞溶解功能，從而耗盡T細胞，并抑制其免疫反應。PD-1/PD-L路徑對于耐受性及免疫力十分重要。此路徑保護組織及器官免受免疫調控的傷害。然而，此路徑已知會被慢性感染的病原菌及腫瘤所利用，以抑制抗微生物性及抗癌的免疫力。為了調控ro-i/ro-L路徑的免疫調控活性，已有標靶此路徑的療法被發(fā)展，以用于治療包含感染、自體免疫、乃至癌癥等疾病(Weber, J.，Semin Oncol 37,430-439)。雖然已有許多方法可通過標靶CTLA-4、ro-l/PD-L 1/TO-L2、及其它免疫調控蛋白，以調控免疫反應來對抗感染性及惡性疾??；然而仍需一種可通過提升免疫力且同時避免抑制免疫反應的新穎方法，以用于抗癌及抗感染的治療中。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，可于治療感染性或惡性疾病時，提升受治療個體的免疫反應，該醫(yī)藥組合物包含一與表達載體結合的DNA構筑體，及醫(yī)藥可接受的載劑，其中該DNA構筑體包含一多核苷酸序列，該多核苷酸編碼選自由細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、計劃性死亡-I (PD-I)、計劃性細胞死亡I配體I (H)-Ll)、其片段或其功能性變異體、及其組合所組成的群組中任一者。在另一方面中，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，可于治療感染性或惡性疾病時，提升受治療個體的免疫反應，該醫(yī)藥組合物包含一重組多勝肽及一醫(yī)藥可接受的載劑，其中該重組多勝肽包含一多勝肽序列，該多勝肽序列選自由CTLA-4、PD-l、ro-Ll、其片段或其功能性變異體、及其組合的多勝肽序列所組成的群組。


于附圖所示的具體實施例，其目的用于闡述本發(fā)明。然而，應明了的是，本發(fā)明并不局限于所示的較佳具體實施例。于附圖中圖Ia 提供 pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4_PLAP 的 DNA 及氨基酸序列。 圖Ib 提供 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-PLAP 的 DNA 及氨基酸序列。圖2a顯示經pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，其產生的抗人類及鼠的CTLA-4抗體的結果。圖2b 提供經 pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4-PLAP 免疫的小鼠，于稀釋 1:50、1:100、1:200、1:400、及1:800倍時，所產生的抗體的效價標準曲線。圖3顯示經以pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠，小鼠的B16黑色素瘤(B16F10腫瘤細胞)生長被抑制的結果。圖4提供經以pVAC-l-IL2ss-hCTLA_4免疫的小鼠及施以pVAC_l載體的對照組小鼠的體重比較結果，結果顯示兩組的間無差異。圖5a提供B16F10細胞數(shù)目與熒光酵素活性的關連性；其中該B16F10細胞可穩(wěn)定表達熒光酵素(B16F10-luc)。圖5b結果顯示源自pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠的脾細胞，其細胞毒殺能力被提升，使得B16F10-1UC細胞存活率減少(于效應因子(脾細胞)腫瘤細胞(B16F10-luc)為 100:1 及 30:1 的比例)。圖6 提供經以 pVAC-l-IL2ss-hCTLA-4-PLAP 免疫的小鼠，經由 B16F10_luc 的刺激，提升脾細胞的干擾素Y的分泌量。圖7a顯示以未與陽離子微脂體(即”裸露的DNA”)結合的pVAC-l-mCTLA_4-PLAP免疫小鼠，于1:50稀釋的血清中無顯著的抗鼠CTLA-4的抗體效價被誘發(fā)。圖7b及圖7c提供相較于以裸露DNA對照組所免疫的小鼠，以與微脂體結合的pVAC-l-mCTLA-4-PLAP免疫小鼠，可產生抗人類及鼠的CTLA-4抗體的結果。圖8提供以pVAC-l-mCTLA-4DNA-微脂體復合物免疫的小鼠，其抑制RENCA腫瘤生長的結果。圖9a-圖9n提供純化的hCTLA-4及其受器B7. I及B7. 2間的交互作用；該受器B7. I及B7. 2分別穩(wěn)定地在CH0-B7. I及CH0-B7. 2上表達。該交互作用會被經以P VAC-1 -1L2 s s-hCTLA-4-PLAP免疫的小鼠的血清抑制。圖10提供標靶免疫調控蛋白的疫苗選殖策略，這些蛋白可為膜連結的蛋白(a)、或分泌的蛋白(b),其可分別具有或不具有胎盤堿性磷酸酶(placental alkalinephosphatase, PLAP)的穿膜區(qū)域序列。于圖10所示的A及B區(qū)域的DNA序列可編碼選自由CTLA-4、PD-1、ro-Ll、其片段或其功能性變異體、及其組合所組成的群組中任一者。圖Ila-圖Ilh提供部分具體實施例的DNA及氨基酸序列，分別標靶根據(jù)本發(fā)明的人類蛋白，包括以下載體圖 Ila pVACl-IL2ss-hPD-l(21-170aa)-PLAP(4167bp)、圖 IlbpVACl-IL2ss-hPD-l (21_170aa) (4171bp)、圖 llcpVACl-IL2ss-hPD_Ll (19_238aa) -PLAP (4377bp)、圖 lid pVACl-IL2ss-hPD-Ll(19-238aa)(4381bp)、圖 lie pVACI-1L2ss-hCTLA4-hPD-I (21-170aa)-PLAP(4545bp)、圖 llfpVACl-IL2ss-hCTLA4-hPD_l (21_170aa) (4443bp)、圖11 gp VAC I -1L2 s s-hCTLA4-hPD-L I (19_238aa)-PLAP (4752bp)、及圖 llhpVACl-IL2ss_hCTLA4-hPD-Ll(19-238aa)(4650bp)。圖12a-圖12h提供部分具體實施例的DNA及氨基酸序列，分別標靶根據(jù)本發(fā)明的鼠蛋白，包括以下載體圖 12a pVACl-IL2ss-mPD-l (21-170aa)-PLAP(4173bp)、圖 12bpVACl-IL2ss-mPD-l (21_170aa) (4177bp)、圖 12cpVACl-IL2ss-mPD_Ll (19_127aa)-PLAP (4053bp)、圖 12dpVACl-IL2ss-mPD-Ll(19-127aa) (4057bp)、圖 12e pVACI-1L2ss-mCTLA4-mPD-I(21-170aa)-PLAP(4560bp)、圖 12f pVACI-1L2ss-mCTLA4-mPD-1(21_170aa) (4458bp)、圖12g pVACl-IL2ss-mCTLA4-mPD-Ll(19-127aa)-PLAP(4440bp)、及圖 12h pVACl-IL2ss_mCTLA4-mPD-Ll(19_127aa)(4338bp)?！D13a-圖13d提供部分具體實施例的DNA及氨基酸序列，分別標靶根據(jù)本發(fā)明的人類蛋白，包括以下載體圖 13apVACl-IL2ss-hCTLA4-hPDl(31-147aa)-hPDLl(19-127aa)、圖13b pVACI-1L2ss-hCTLA4-hPDI(31_147aa)-hPDLl(19_238aa)、圖13c pVACl_IL2ss_mCTLA4-mPDl (31_147aa)-mPDLl (19_127aa)、及圖 13d p VAC I -1L2 s s-mCTLA4-mPD I (31_147aa)-mPDLl(19_237aa)。圖14a-圖 14b 提供經以 p V A C - I - I L 2 s s _mP D - L I - P L A P、pVAC-l-IL2ss-GM-CSF-mPD-Ll-PLAP、 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-Ll_PLAP、pVAC-l-IL2ss-mPD-Ll-mCTLA4-PLAP、及pVAC_l對照組載體免疫小鼠的結果。相較于對照組的pVAC-Ι載體，DNA疫苗所誘發(fā)的抗mPD-Ll (圖14a)及mCTLA_4 (圖14b)兩者的抗體效價如圖所示。圖 15a-圖 15c 提供經以 pVAC-卜IL2ss-mCTLA4-mPD_L卜PLAP、pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-l-PLAP、pVAC-I-I L2ss-mCTLA4_mPD-L I、pVAC-l-IL2SS-mCTLA4-mPD-l、及pVAC-1載體對照組免疫小鼠的結果。相較于對照組的PVAC-1載體，DNA疫苗所誘發(fā)的抗mCTLA-4、PD-I及mPD_Ll的抗體效價如圖所示。圖 16 提供經以 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-Ll-PLAP、pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-l-PLAP, pVAC-I-IL2ss-mCTLA4-mPD_LI、及p VAC-1 -1L2 s s-mCTLA4-mPD-1免疫小鼠的結果，其可抑制RENCA腫瘤的生長。圖 17 提供經以 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-Ll-PLAP、pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-l-PLAP, pVAC-I-IL2ss-mCTLA4-mPD_LI、及pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-l，并與GM-CSF DNA結合以免疫小鼠的結果。結果顯示可抑制RENCA腫瘤的生長。圖 18 提供經以 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD-Ll 及 pVAC-l-IL2ss-mCTLA4-mPD_l 免疫小鼠的結果，其可抑制CT26腫瘤的生長。
具體實施例方式除非另有定義，所有于此處所使用的技術性及科學性術語具有的意義，對于屬于本發(fā)明的技術領域中技術人員為常識。當于此處使用時，以下術語具有其所屬的意義，除非另有特別定義。于此處使用到“一”時，是指一個或一個以上(如至少一者)的文述的物體。例如，“一組件”意指一個組件或一個以上的組件?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷币辉~指由核苷酸單元組成的聚合體。多核苷酸包括自然存在的核酸，像是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)、及核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，以及核酸類似物，包括這些具有非天然存在的核苷酸，像是重組多核苷酸。多核苷酸可被合成，如可使用一自動化DNA合成儀合成的?！昂怂帷币辉~典型地指大的多核苷酸。當核苷酸序列以DNA序列(如A、T、G、C)代表時，應可了解的是亦包括RNA序列(如A、U、G、C);其中“U”取代“T”?！癱DNA” 一詞指一 DNA與mRNA成互補或與mRNA相同，且該 cDNA可為單股或雙股形式。“編碼” 一詞是指于多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)中的核苷酸的特定序列的固有功能，該序列可作為模板，用以合成生物反應中的其它聚合物及巨分子，這些聚合物及巨分子具有一定義的核苷酸序列(如rRNA、tRNA及mRNA)、或可為一定義的氨基酸序列，藉此以得到生物活性。因此，若由基因所產生的mRNA經過轉錄及轉譯而于細胞或其它生物系統(tǒng)生成一蛋白，則稱該基因編碼該蛋白。應可為本技術領域的技術人員所理解的是，因遺傳密碼的簡并性，多種不同的多核苷酸及核酸可編碼相同的多勝肽。對于本技術領域的技術人員亦可理解的是，使用常規(guī)技術使核苷酸進行替換，且不會改變所述的多核苷酸所編碼的多勝肽序列，以對應任何特定宿主生物體所需使用的密碼子，以于該宿主生物體中表達該多勝肽。因此，除非另有特別所指，“多核苷酸編碼一氨基酸序列”包括所有多核苷酸，其可互為簡并形式，且其編碼相同的氨基酸序列。多核苷酸編碼蛋白質及RNA，可能包括內含子?！爸亟M多核苷酸”一詞指一多核苷酸具有非天然連結成的序列。一重組多核苷酸可以一載體形式存在。“載體”可包含特定的感興趣核苷酸序列，及一調控序列；載體可被用以表達該特定的核苷酸序列、或用以維持該核苷酸序列以供復制、操控、或于不同位置間進行轉移(如不同生物體間)。載體可被引入一適當宿主細胞，以進行前述的目的。載體的例子包含,但不限于質體、黏質體、曬菌體、YACs、或PACs。典型地,于載體中，特定的核苷酸序列可與調控序列連結，像是當該載體被引入一宿主細胞內時，該特定的核苷酸序列可經由調控序列的控制，于該宿主細胞內表達。該調控序列可包含，例如但非局限，啟動子序列、起始密碼子、復制子、增強子、操控子序列、分泌信號序列(如IL2信號勝肽)、及其它控制序列。較佳地，載體可進一步含有標記子序列(如抗生素抗性的標記子序列)，供后續(xù)篩選步驟所用?！岸鄤匐摹币辉~指分子或多分子，由氨基酸殘基透過勝肽鍵連結所組成。多勝肽可被合成，例如，使用一自動化多勝肽合成儀?！暗鞍住币辉~典型地指大型的多勝肽?！皠匐摹币辉~典型地指短的多勝肽。氨基酸可通過三個字母或一個字母所表示。表I所列為標準氨基酸縮寫。表I :標準氨基酸縮寫
權利要求
1.一種醫(yī)藥組合物，可于治療感染性或惡性疾病時，提升受治療個體的免疫反應，該醫(yī)藥組合物包含一與表達載體結合的DNA構筑體，及醫(yī)藥可接受的載劑，其中該構筑體包含一多核苷酸序列，該多核苷酸編碼選自由細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、計劃性死亡-I (ro-i)、計劃性細胞死亡配體I (ro-Li)、其片段或其功能性變異體、及其組合所組成的群組中任一者。
2.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該DNA構筑體包含編碼CTLA-4、其片段或其功能性變異體的多核苷酸序列。
3.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該DNA構筑體包含編碼(i)CTLA-4、其片段、或其功能性變異體，及(ii)PD-l、其片段、或其功能性變異體結合的多核苷酸序列。
4.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該DNA構筑體包含編碼(i)CTLA-4、其片段、或其功能性變異體，及(ii)ro-Li、其片段、或其功能性變異體的結合的多核苷酸序列。
5.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該表達載體為pVAC-1。
6.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，進一步包含佐劑。
7.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該DNA構筑體與微脂體結合。
8.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該個體罹患感染性或惡性疾病，且以抗感染性或抗癌藥物治療，造成該個體的免疫反應受到刺激。
9.如權利要求I所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該惡性疾病選自由轉移性黑色素瘤、胰臟癌、大腸直腸癌、肝細胞癌、淋巴癌、激素抗拒性前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓性白血病、及非小細胞肺癌所組成的群組。
10.一種醫(yī)藥組合物，可于治療感染性或惡性疾病時，提升受治療個體的免疫反應，該醫(yī)藥組合物包含一重組多勝肽及一醫(yī)藥可接受的載劑，其特征在于，該重組多勝肽包含一多勝肽序列，該多勝肽序列選自由CTLA-4、PD-U ro-Ll、片段或其功能性變異體、及其組合的多勝肽序列所組成的群組。
11.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該重組多勝肽包含CTLA-4、其片段、或其功能性變異體的多勝肽序列。
12.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該重組多勝肽包含(i)CTLA-4、其片段、或其功能性變異體，及(ii)PD-l、其片段、或其功能性變異體結合的多勝肽序列。
13.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該重組多勝肽包含(i)CTLA-4、其片段、或其功能性變異體，及(ii)ro-Li、其片段、或其功能性變異體的結合的多勝肽序列。
14.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其進一步包含佐劑。
15.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該個體罹患感染性或惡性疾病，且以抗感染性或抗癌藥物治療后，造成該個體的免疫反應受到刺激。
16.如權利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，該惡性疾病選自由轉移性黑色素瘤、胰臟癌、大腸直腸癌、肝細胞癌、淋巴癌、激素抗拒性前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓性白血病、及非小細胞肺癌所組成的群組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療感染性及惡性疾病的新穎方法。本發(fā)明提供新穎DNA及蛋白疫苗，通過提升免疫反應，以治療感染性及惡性疾病。
文檔編號A61K48/00GK102836441SQ201210210339
公開日2012年12月26日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權日2011年6月24日
發(fā)明者藍耿立, 施易升, 藍耿欣 申請人:臺北榮民總醫(yī)院