痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的應(yīng)用，具體講，涉及痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在制備預(yù)防和治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑藥物中的應(yīng)用。所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑是由粉刺丙酸桿菌經(jīng)破碎后提取有效組份制備的無細(xì)胞制劑，粒度為10～1000nm，優(yōu)選10～800nm，更優(yōu)選10～500nm，所述粉刺丙酸桿菌的菌號為76-27、H-84或77-1，優(yōu)選77-1。所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的熱原小于320EU/ml，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量為6～60％，核酸的質(zhì)量百分比含量為4～40％，其余為多糖。本發(fā)明的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑中取得了良好的效果。
【專利說明】痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種痤瘡丙酸桿菌的應(yīng)用，具體講，涉及痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在治療制備預(yù)防和治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]痤瘡丙酸桿菌(propionibacterium acnes,PA)來源于健康人的骨髓，為一種革蘭氏陽性厭氧桿菌，前發(fā)現(xiàn)，該菌只存于健康人體，而免疫力低下如腫瘤患者往往分離不到該菌。即使上述人群分離到該菌，其對人體有益的免疫功能幾乎缺失。通過超高壓技術(shù)將細(xì)菌進(jìn)行處理后去除無效組分提取有效組分而獲得的一種新型痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑，作為一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，在動物實(shí)驗(yàn)研究中，效果明顯，通過對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)強(qiáng)大而持久的刺激作用，提高機(jī)體非特異性和特異性免疫反應(yīng)，使巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞殺滅微生物和抗腫瘤作用增強(qiáng)，從而殺滅微生物或惡性腫瘤細(xì)胞。
[0003]痤瘡丙酸桿菌制劑(propionibacterium acnes Product, PAP),是經(jīng)甲醒滅活后制成的死菌苗制劑，其制備過程公開在1995版及2000版《中國生物制品規(guī)程》。目前應(yīng)用的該制劑還有法國Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；英國Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗等。[0004]PAP促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)和抗腫瘤療效已被許多實(shí)驗(yàn)及臨床研究所證實(shí)，尤其在消退癌性胸水方面具有獨(dú)特療效。PAP抗腫瘤作及抗病原微生物用主要是通過對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)強(qiáng)大而持久的刺激，引起巨噬細(xì)胞(ΜΦ)增生、活化、吞噬功能增強(qiáng)、誘導(dǎo)分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-gamma)、白細(xì)胞介素(IL-2)、活性氧(Η202、Ν0)等癌細(xì)胞殺傷因子及增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性，達(dá)到抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞及病原微生物的目的，且可通過促進(jìn)造血多能干細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)動機(jī)體免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏抗癌、殺菌潛力。免疫學(xué)的進(jìn)展加深了人們對免疫系統(tǒng)抗腫瘤功能及免疫治療作用重要性的認(rèn)識。
[0005]目前，PAP可以說是激活MΦ活性最好的制劑之一，但由于PAP為全菌體，體積大，不易進(jìn)入毛細(xì)血管，使其難以發(fā)揮全身作用，而且全菌體含大量異種蛋白等致使產(chǎn)品在使用過程中發(fā)熱，寒戰(zhàn)等不良反應(yīng)多見，部分患者可出現(xiàn)較重的肝腎毒性，因此大大限制了其臨床應(yīng)用。
[0006]現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥物加工到納米水平之后，可顯著提高吸收度、擴(kuò)散度，有利于降低藥物的某些副作用，提高藥效。通常微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)為機(jī)械法、非機(jī)械法兩種。機(jī)械法包括:高壓勻漿器、高速珠磨機(jī)、超聲波震蕩器，非機(jī)械法包括化學(xué)法、酶解法、滲透壓沖擊法、凍融法和干燥法。雖然細(xì)胞破碎的方法很多，但都難以將細(xì)胞破碎到粒度均一的納米水平。將藥物加工到其粒度絕大部分都小于IOOnm從技術(shù)角度講難于實(shí)現(xiàn)的，并且研究表明，納米級藥物尚存在著用目前的技術(shù)難以準(zhǔn)確評估的安全性患。
[0007]本發(fā)明繼續(xù)對痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的功效做了研究，發(fā)現(xiàn)了其新的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑(non-cellpropionibacterium acnes Product, SPAP)的新用途。
[0009]本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供該痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法。
[0010]本發(fā)明涉及一種痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在制備預(yù)防和治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑藥物中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑是由粉刺丙酸桿菌經(jīng)滅活破碎后制備的無細(xì)胞制劑。
[0012]本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑是由粉刺丙酸桿菌經(jīng)后制備的無細(xì)胞制劑，粒度為10~1000nm,優(yōu)選10~800nm,更優(yōu)選10~500nm。
[0013]本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為所述粉刺丙酸桿菌的菌號為76-27、H-84或77_1，優(yōu)選77-1。
[0014]本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的熱原小于320EU/ml，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量為6~60 %，核酸的質(zhì)量百分比含量為4~40 %，其余為多糖；優(yōu)選所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑熱原小于120EU/ml，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量為20~40%，核酸的 質(zhì)量百分比含量為4~20%，其余為多糖。
[0015]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為，所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟:
[0016](I)粉刺丙酸桿菌工作種子批菌種連續(xù)2~4次傳代后接種于大瓶或培養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~10天:
[0017](2)收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15~60分鐘得到滅活菌液；
[0018](3)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，在無菌條件下用破碎裝置破碎菌體；
[0019](4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；
[0020](5)將懸液分裝后加熱滅菌，得到痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑。
[0021]本發(fā)明第二發(fā)明目的第一優(yōu)選技術(shù)方案為:步驟(1)中，所述的粉刺丙酸桿菌的菌號為76-27、H-84或77-1，培養(yǎng)基選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，優(yōu)選不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；步驟(1)中的培養(yǎng)條件為36~37°C。
[0022]本發(fā)明第二發(fā)明目的第二優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(3)中，所述的破碎裝置為超高壓射流對撞機(jī)，壓力為500~lOOOkgf/cm2，破碎至少I次，將菌體破碎到粒度小于lOOOnm、優(yōu)選粒度10~800nm。
[0023]本發(fā)明第二發(fā)明目的第三優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(3)中，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；在步驟(4)中，菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C~室溫下，6000~20000rpm離心30~150分鐘；所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌I~5次；在步驟(5)中，所述的加熱為在60~65°C加熱0.5~2小時。
[0024]本發(fā)明第二發(fā)明目的第四優(yōu)選技術(shù)方案為:進(jìn)一步包括將步驟(5)得到的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
[0025]本發(fā)明第二發(fā)明目的第五優(yōu)選技術(shù)方案為:所述的培養(yǎng)基為或0.45 μ m膜過濾的培養(yǎng)基。
[0026]根據(jù)需要，本發(fā)明的SPAP可以制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1.0mg/ml或2.0mg/ml,也可以制成凍干粉針或適合藥用的其他劑型。[0027]本發(fā)明的SPAP或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如靜脈注射、肌肉注射、皮下注射或局部涂抹等。本發(fā)明的SPAP在預(yù)防和治療附件炎時優(yōu)選肌肉注射的給藥方式，在治療子宮頸糜爛優(yōu)選局部涂抹的給藥方式，在治療尖銳濕疣優(yōu)選疣內(nèi)或局部皮下注射給藥的給藥方式，外陰白斑時優(yōu)選局部皮下或皮內(nèi)多點(diǎn)注射的給藥方式。[0028]給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
[0029]本發(fā)明SPAP可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種
微粒給藥系統(tǒng)。
[0030]這些制劑是按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備的。為制造片劑、膠囊劑、包衣劑所用的輔料是常規(guī)用的助劑，例如淀粉，明膠，阿拉伯膠，硅石，聚乙二醇，液體劑型所用的溶劑例如有水，乙醇,丙二醇,植物油類如玉米油,花生油,橄欖油等。含有本發(fā)明化合物的制劑中還可有其他助劑，例如表面活性劑，潤滑劑，崩解劑，防腐劑，矯味劑，色素等。
[0031]為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
[0032]還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
[0033]為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。
[0034]為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、PH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；ΡΗ調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
[0035]此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。[0036]為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
[0037]本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.2~3mg/天，優(yōu)選為0.2~2/天。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
[0038]本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。
[0039]本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑中的效果尤為突出。經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)，采用本發(fā)明的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在治療上述四種疾病中，其治療效果與現(xiàn)有的治療手段比較，本發(fā)明的SPAP取得了更好的治療效果。
[0040]本發(fā)明的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑(SPAP)，與現(xiàn)有技術(shù)中的全菌PAP相比，由于對該制劑生產(chǎn)工藝進(jìn)行了創(chuàng)新性改進(jìn)，提取了有效組份，由此增加了新的適應(yīng)癥，治療效果明顯提高，而毒副反應(yīng)大大降低:
[0041]I)治療效果:由于SPAP為全菌體，體積大，不易進(jìn)入毛細(xì)血管，使其難以發(fā)揮全身作用，主要用于局部治療:如黑色素瘤瘤內(nèi)注射，效果明顯。而SPAP由于采用納米技術(shù)處理，提取有效組份后，極容易進(jìn)入毛細(xì)血管，故可以迅速產(chǎn)生全身作用，更好地發(fā)揮免疫治療作用，并且，與SPAP相 比，可以產(chǎn)生很多新的適應(yīng)癥。
[0042]2)毒副作用:從全身反應(yīng)來看，首先SPAP為全菌體，異種蛋白等熱源含量高致使產(chǎn)品在使用過程中發(fā)熱，寒戰(zhàn)等全身反應(yīng)多見，部分患者可出現(xiàn)較重的肝腎毒性，如肝細(xì)胞壞死或腎臟免疫復(fù)合物沉積。而SPAP經(jīng)過納米技術(shù)處理提取后，幾乎無熱源，發(fā)熱和肝腎毒性等副作用大大減輕；從局部反應(yīng)來看，由于SPAP為全菌體，不易進(jìn)入毛細(xì)血管，易形成局部疼痛，腫脹，部分患者出現(xiàn)硬結(jié)、紅斑，病人接受程度差，大大限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用，而SPAP經(jīng)過納米技術(shù)處理提取后，可迅速進(jìn)入毛細(xì)血管，大為減輕或消除局部疼痛、腫脹、硬結(jié)和紅斑等副作用。
[0043]本發(fā)明的有益效果為:
[0044]1.本發(fā)明提供了 SPAP新的醫(yī)藥用途，對治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑提供了新的途徑。
[0045]2.本發(fā)明的SPAP制劑具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米水平，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用，是一種有前途的免疫制劑。
[0046]3.本發(fā)明的制備工藝簡單，可作成注射液、片劑、涂抹劑等劑型，使用方便。
[0047]4.經(jīng)藥效研究表明，本發(fā)明的SPAP制劑克服了化學(xué)藥物治療時產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】僅是對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作出的進(jìn)一步的解釋和說明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容作出限制。
[0049]實(shí)施例1
[0050]參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
[0051]本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基為北京路橋科技開發(fā)公司出品的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，成分為:胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸鈉0.5g/l。使用前將培養(yǎng)基用0.22 μ m膜過濾。
[0052]啟開PA(學(xué)名粉刺丙酸桿菌,propionibacterium acnes) 77-1 (見《中國生物制品規(guī)程》)菌種管，每管含菌60億，用毛細(xì)管吸取約0.2~0.3ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，加在菌種管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培養(yǎng)基8~IOml混合，置37°C培養(yǎng)2天。取菌液用上述培養(yǎng)基(菌液:培養(yǎng)基體積比=I: 9)混合，置37°C培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)的菌液用上述培養(yǎng)基(按1: 9)混合，置37°C培養(yǎng)3天，收獲菌液。逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之。合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸15分鐘，用超高壓射流對撞擊(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號NMG-75-200)在1000kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；破碎后的懸液在室溫、6000rpm離心90分鐘，收集沉淀，用無菌生理鹽水洗滌沉淀3次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為0.5mg/ml的懸液，60°C加熱I小時，得到SPAP。
[0053]其中PA，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌65103 (77-1)或771。
[0054]經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量lmg/ml)，本發(fā)明的SPAP熱原20EU/ml ;考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量25% (g/g);紫外法(2000版`《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量10% (g/g);蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為10% (g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測出。電鏡測定粒度為50~500nm。
[0055]分裝后，安瓿在60+2 V加熱20分鐘。
[0056]實(shí)施例2
[0057]參照實(shí)施例1的方法，將PA(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacteriumacnes) 65101 (76-27)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)(使用前將培養(yǎng)基用0.4511111膜過濾)中，36-37°C培養(yǎng)6天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸60分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)在2000kgf/cm2壓力下破碎菌體2次；破碎后的懸液8000rpm離心I小時，用無菌生理鹽水洗滌沉淀5次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為2.0mg/ml的懸液，65°C加熱60分鐘，得到SPAP。
[0058]經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量lmg/ml)，SPAP熱原160EU/ml ;考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量40% (g/g);紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量5% (g/g)；蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為20% (g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖可能未測出。電鏡檢測粒度為10~500nm。分裝后，安瓿在60±2°C加熱30分鐘。
[0059]實(shí)施例3[0060]參照實(shí)施例1的方法，將PA(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacteriumacnes) 65102 (H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36_37°C培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號AQUA300) 2000kgf/cm2壓力下破碎菌體3次；破碎后的懸液12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中華人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為1.0mg/ml的懸液，65°C加熱100分鐘，得到SPAP。
[0061]經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量lmg/ml) SPAP熱原60EU/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量12% (g/g)，紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量25% (g/g)，蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為16% (g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測出。電鏡檢測平均粒度為40-80nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60±2°C加熱30分鐘。
[0062]實(shí)施例4
[0063]其他同實(shí)施例1，不同之處在于破碎后的懸液在8000rpm離心I小時后，用凍干機(jī)凍干，得到粉針劑。
[0064]比較例I
[0065]采用2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法將PA(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes) 77-1連續(xù)3次傳代后接種于營養(yǎng)罐,在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)中36~37°C培養(yǎng)5天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體分別加熱煮沸30、60分鐘進(jìn)行無菌試驗(yàn)，無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心后，用新鮮無菌生理鹽水溶液洗滌沉淀3次并制成懸液，60-65°C加熱I小時，無菌檢測合格后分裝，安瓿在60±2°C加熱30分鐘，經(jīng)檢測兩種樣品每瓶含菌為6.0X109。
[0066]比較例2
[0067]其他同實(shí)施例5，不同之處在于采集之無雜菌污染的菌體加入甲醛溶液至最終濃度約為0.5% (ml/ml)殺菌48小時，經(jīng)檢測每瓶含菌為6.0X 109，游離甲醛含量為0.06g/L0
[0068]實(shí)驗(yàn)例I
[0069]由比較例2看出，PAP中殘留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白質(zhì)，殺死細(xì)菌，但對機(jī)體具有較強(qiáng)的刺激性。PAP中甲醛殘留量雖然很少(應(yīng)不高于0.06g/l)，但仍會對人體，尤其是對敏感的胸膜產(chǎn)生刺激性。
[0070]本發(fā)明中按照2000版《中國生物制品規(guī)程》中第240~241頁中SPAP制造及檢定規(guī)程中規(guī)定的方法對比較例1、2制備的PAP的脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見表1。
[0071]同時，本發(fā)明中按照下述方法對本發(fā)明實(shí)施例1~4的SPAP脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見表1。
[0072]脾激活試驗(yàn):用體重18~20g純種小鼠(C3H、615或C57BL)，試驗(yàn)組及對照組各10只，雌雄各半。試驗(yàn)組每只小鼠腹腔分別注射PAP 0.5ml (含菌1.5X IO9)及實(shí)施例1~3的SPAP制劑0.5ml (實(shí)施例1~3的SPAP固體含量都調(diào)整到lmg/ml)，對照組注射同量生理氯化鈉溶液。14天處死小鼠，分別稱體重、脾重、計(jì)算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。
[0073]
脾指數(shù)= 試驗(yàn)組總脾重(mg) /總體重(g)

對照組總脾重(mg) /總體重(g)
[0074]抑瘤實(shí)驗(yàn)(艾氏腹水瘤):用體重18~20g純種小鼠(C3H、615、C57BU K-LACA或昆明鼠)，試驗(yàn)組及對照組各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤細(xì)胞(5.0X106/ml) 0.2ml (用傳代5~8天非血性腹水)。試驗(yàn)組于注射瘤細(xì)胞前I天及注射后次日起，連續(xù)腹腔分別注射PAP 0.25ml (含菌1.5 X IO9)及實(shí)施例1~3的SPAP 0.25ml (實(shí)施例1~3的SPAP固體含量調(diào)整到2mg/ml)5次，每次間隔I天。對照組注射同量生理氯化鈉溶液。對照組小鼠全部因癌性腹水死亡為起點(diǎn)計(jì)算試驗(yàn)組小鼠存活率，觀察期30天，其存活率應(yīng)不低于70%。
[0075]表1
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑在制備預(yù)防和治療附件炎、子宮頸糜爛、尖銳濕疣、外陰白斑藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑是由粉刺丙酸桿菌經(jīng)滅活破碎后提取有效組份制備的無細(xì)胞制劑，粒度為10~lOOOnm，優(yōu)選10~800nm,更優(yōu)選 10 ~500nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述粉刺丙酸桿菌的菌號為76-27、H-84或 77-1，優(yōu)選 77-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的熱原小于320EU/ml，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量為6~60 %，核酸的質(zhì)量百分比含量為4_40 %，其余為多糖；優(yōu)選所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑熱原小于120EU/ml，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比含量為20~40%，核酸的質(zhì)量百分比含量為4~20%，其余為多糖。
5.—種權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法,包括以下步驟: (1)粉刺丙酸桿菌工作種子批菌種連續(xù)2~4次傳代后接種于大瓶或培養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~10天: (2)收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15~60分鐘得到滅活菌液； (3)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，在無菌條件下用破碎裝置破碎菌體； (4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液； (5)將懸液分裝后加熱滅菌，得到痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑。`
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的粉刺丙酸桿菌的菌號為76-27、H-84或77_1，培養(yǎng)基選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，優(yōu)選不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；步驟(1)中的培養(yǎng)條件為36~37°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述的破碎裝置為超高壓射流對撞機(jī)，壓力為500~lOOOkgf/cm2，破碎至少I次，將菌體破碎到粒度小于lOOOnm、優(yōu)選粒度10~800nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；在步驟(4)中，菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C~室溫下，6000~20000rpm離心30~150分鐘；所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌I~5次；在步驟(5)中，所述的加熱為在60~65°C加熱0.5~2小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括將步驟(5)得到的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑分裝后，西林瓶在60±2°C加熱30分鐘或121°C加熱15~30分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的痤瘡丙酸桿菌無細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為經(jīng)過膜孔徑2萬分子量超濾或0.22 μ m膜過濾的培養(yǎng)基。
【文檔編號】A61K35/74GK103505475SQ201210203125
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月19日
【發(fā)明者】熊慧 申請人:熊慧