專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的多肽和攜帶此多肽的納米顆粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域，特別涉及一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的多肽和攜帶此多肽的納米顆粒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，它極易侵犯顱底等重要結(jié)構(gòu)，并能較早地發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由于鼻咽癌惡性程度高，發(fā)病部位比較特殊，使其手術(shù)治療較難實(shí)施。因此，臨床上的鼻咽癌治療主要以放射治療為主并配合全身化學(xué)藥物治療。然而，傳統(tǒng)的放療與化療均具有較為嚴(yán)重的毒副作用，且放療僅適用于腫瘤原發(fā)灶及其前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療，而不適合遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的治療。由于治療手段的局限性，致使鼻咽癌總的五年生存率一直徘徊在60%左右。 單克隆抗體藥物在腫瘤治療方面已經(jīng)展示了良好的臨床應(yīng)用前景。單克隆抗體與放射性核素、藥物或毒素形成的偶聯(lián)物，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向的特異性殺傷作用。此外，一些腫瘤標(biāo)志物特異性的單克隆抗體本身也具有顯著的腫瘤治療作用，例如作用于腫瘤細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子HER-2/neu抗體Herceptin，它作為靶向藥物治療HER-2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移乳腺癌已取得了很好的療效。然而，單克隆抗體在實(shí)際臨床應(yīng)用中尚存在以下幾個(gè)缺陷臨床研究的單抗藥物多數(shù)使用小鼠制備，存在免疫原性問(wèn)題；抗體分子量大，對(duì)腫瘤的穿透力低，使得大體積實(shí)體腫瘤的治療效果仍不十分理想；腫瘤治療所需的抗體量很大，產(chǎn)品純度要求高，因此生產(chǎn)成本極高；由于腫瘤的異質(zhì)性，使用單克隆抗體單一地通過(guò)抑制或殺死表達(dá)某種受體的腫瘤細(xì)胞，并不代表著腫瘤的治愈。由此可知，治療高惡性度的鼻咽癌，單純使用單克隆抗體作為靶向分子，很難獲得理想的效果。多肽作為腫瘤標(biāo)志物分子的特異性配體，一直是研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。相對(duì)于單克隆抗體，多肽具有尺寸小、組織穿透性好、低免疫原性和造價(jià)低等優(yōu)點(diǎn)，可以很大程度上克服抗體制劑的缺陷。然而，相對(duì)較弱的腫瘤親和力和短的半衰期，限制了靶向肽在生物活體內(nèi)的應(yīng)用?；诩{米技術(shù)的多價(jià)策略，可明顯延長(zhǎng)靶向肽的體內(nèi)有效循環(huán)時(shí)間，并大大提高其與特異受體結(jié)合的親合力，從而達(dá)到顯著增強(qiáng)多肽的生物學(xué)效應(yīng)的目的。為此，我們使用前期工作中發(fā)明的一種具有多價(jià)效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法，制備了基于四聚體遠(yuǎn)紅熒光蛋白的八價(jià)多肽納米熒光探針。通過(guò)此方法可快速準(zhǔn)確地篩選與鑒定多肽的腫瘤靶向性及其抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。然而，由于遠(yuǎn)紅色熒光蛋白為外源蛋白，其免疫原性限制了它的臨床使用。因此，迫切需要發(fā)展一種能有效運(yùn)輸靶向肽的納米載體，而又不影響其靶向性與治療效果。鼻咽癌是由環(huán)境因素與宿主遺傳基因等因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的復(fù)雜性疾病。放療和輔助化療綜合治療的臨床研究表明，鼻咽癌是一種對(duì)化療相對(duì)敏感的腫瘤，多種抗癌藥物單用或聯(lián)合使用均有一定的療效。以順鉬和5-氟尿嘧啶(5-FU)等為主要的水溶性化療藥物能顯著改善患者的預(yù)后。但是不管單獨(dú)給藥還是聯(lián)合給藥方案，靜脈給藥的順鉬和5-FU都具有半衰期短、缺乏選擇性的缺點(diǎn)，從而增加了其毒副作用。姜黃素(Curcumin)和紫杉醇是兩種具有代表性的抗癌中藥。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，有著廣泛的藥理作用，眾多研究證實(shí)，姜黃素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。還可以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境NK細(xì)胞的招募，從而提高機(jī)體的免疫力。紫杉醇從1992年美國(guó)FDA批準(zhǔn)首次進(jìn)入臨床用于治療卵巢癌以來(lái),也被應(yīng)用于晚期鼻咽癌的治療。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇也具有增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境NK細(xì)胞的招募和激活樹(shù)突細(xì)胞的抗原提呈能力，從而提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫。由于姜黃素與紫杉醇都為脂溶性藥物，被動(dòng)運(yùn)輸方式很難直接被腫瘤組織細(xì)胞攝取，且有很強(qiáng)的靜脈毒副作用，導(dǎo)致其目前臨床應(yīng)用效果欠佳。目前，針對(duì)鼻咽癌靶向治療的納米藥物在國(guó)內(nèi)還是一片空白。納米載體是將成像對(duì)比劑和藥物靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤，實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性成像診斷與靶向治療的有效手段。已有研究者發(fā)明了一種仿高密度脂蛋白的多肽-脂質(zhì)納米顆粒(專(zhuān)利號(hào)(W0/2009073984)，它是利用具有α螺旋結(jié)構(gòu)的功能多肽R4F與磷脂和膽固醇脂相互作用而形成的，其粒徑小于30nm。這種納米顆粒主要是基于多肽的功能靶向B型清道夫受體(SR-Bl)高表達(dá)的細(xì)胞。然而，由于機(jī)體正常的組織細(xì)胞(如肝細(xì)胞)也高表達(dá)SR-B1，故此納米顆粒在腫瘤與正常組織之間分布的對(duì)比度不太理想，在運(yùn)輸化療藥物的時(shí)候可能具有 潛在的毒副作用。此外，該專(zhuān)利中的納米顆粒本身僅做為靶向運(yùn)輸?shù)墓ぷ?，而其本身并未涉及到腫瘤治療之功效。綜上所述，發(fā)展一種攜帶具有協(xié)同靶向與治療功能的多肽的超小粒徑(<40nm)納米顆粒，并同時(shí)裝載有成像對(duì)比劑和化療藥物分子，用于鼻咽癌的高特異性同步診斷與治療，將會(huì)成為極具臨床應(yīng)用潛力的鼻咽癌靶向納米藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述問(wèn)題而提供了一種具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽(LTVSPWYLTVSPWY)和一種具有協(xié)同靶向與治療鼻咽癌功能和控制脂質(zhì)納米顆粒尺寸功能的多肽(簡(jiǎn)稱(chēng)為dtTPNPC)，以及攜帶dtTPNPC多肽的納米顆粒(簡(jiǎn)稱(chēng)為dtDTNPNPC)，并展示了其應(yīng)用。上述多肽和納米顆粒能夠高效特異性地靶向鼻咽癌，并且顯著性地抑制鼻咽癌腫瘤的生長(zhǎng)，可以應(yīng)用于臨床治療。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是將一種具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽，與另一種具有α螺旋結(jié)構(gòu)的鼻咽癌靶向治療多肽(該α螺旋多肽具有靶向治療鼻咽癌作用并能與磷脂相互作用形成α螺旋結(jié)構(gòu)的多肽)，通過(guò)連接多肽以共價(jià)鍵的形式串連。它同時(shí)具有協(xié)同靶向與治療鼻咽癌的功能和控制脂質(zhì)納米顆粒尺寸的功能。一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWDGSGLTVSPWYLTVSPWY。優(yōu)選地，所述具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)TVSPWYLTVSPWY。一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，所述納米顆粒由三部分物質(zhì)組成1)多肽同時(shí)具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌的功能和控制脂質(zhì)納米顆粒尺寸的功能；2)磷脂和膽固醇脂組成納米顆粒的殼和維持穩(wěn)定的球形納米結(jié)構(gòu)；3)裝載物成像對(duì)比齊U、藥物分子或者兩者的結(jié)合，成像對(duì)比劑為膽固醇脂修飾的熒光染料分子(DiR-BOA和Fluo-BOA)、藥物分子為紫杉醇、姜黃素。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I)理化特性?xún)?yōu)良利用動(dòng)態(tài)激光光散射方法測(cè)得納米顆粒的平均粒徑為14. 6nm左右。納米顆粒的粒徑均一、分散性好、無(wú)聚集現(xiàn)象。2)生物相容性好制備該納米顆粒所使用的原料為磷脂、膽固醇脂和具有協(xié)同靶向與治療鼻咽癌功能的多肽等材料，這些原材料都已用于臨床試驗(yàn)，具有良好的生物相容性。3)制備工藝簡(jiǎn)單，便于規(guī)?；a(chǎn)。4)靶向效果好在細(xì)胞水平，本發(fā)明的納米顆粒也0了冊(cè)1^，相對(duì)應(yīng)肝癌、抱13等很多癌細(xì)胞，它能更容易被鼻咽癌(如5-8F細(xì)胞、SUNE-I細(xì)胞和H0NE-1細(xì)胞等)攝??；在體水平，本發(fā)明的dtDTNP-納米顆粒在尾靜脈注射鼻咽癌5-8F荷瘤裸鼠12h后，選擇性地靶向 和蓄積到腫瘤部位。5)治療效果好在細(xì)胞水平，本發(fā)明的納米顆粒與鼻咽癌5-8F細(xì)胞孵育Ih后，能顯著性地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的納米顆粒由于協(xié)同靶向效應(yīng)和實(shí)體瘤的 EPR 效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect),使其在鼻咽癌組織中的蓄積能力和被鼻咽癌細(xì)胞攝取的能力大大提高，從而對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有很好的抑制效果。6)毒副作用低動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，本發(fā)明的dtDTNPNrc納米顆粒在鼻咽癌
5-8F細(xì)胞皮下接種于裸鼠后的第三天，開(kāi)始隔天尾靜脈注射直至第14天，相對(duì)于PBS對(duì)照組，體重沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。7)功能可擴(kuò)展本發(fā)明的納米顆粒除了可以更換不同腫瘤靶向治療多肽用以針對(duì)不同的腫瘤進(jìn)行靶向治療外，還可以在其核心裝載用于疾病診療的染料分子(DiR-BOA)和脂溶性藥物分子(如紫杉醇和姜黃素等)，實(shí)現(xiàn)腫瘤協(xié)同靶向治療與免疫治療功效的完美結(jié)
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下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖I為實(shí)施例I中Octa-FNP熒光納米探針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞孵育3h后激光共聚焦成像結(jié)果；圖2為實(shí)施例I中Octa-FNP熒光納米探針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞孵育3h后FACS流式
定量結(jié)果；圖3為實(shí)施例2中FPLC系統(tǒng)純化2個(gè)合成單位核心裝載O. 4μ mol熒光染料DiR-BOA 的 dtDTNPNrc 納米顆粒[描述為0. 4 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC]時(shí)的雙波段吸收-洗脫體積曲線(xiàn)圖；圖4為實(shí)施例2中FPLC系統(tǒng)純化2個(gè)合成單位的0. 45 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒時(shí)的雙波段吸收-洗脫體積曲線(xiàn)圖；圖5為實(shí)施例2中FPLC系統(tǒng)純化2個(gè)合成單位0. 5 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒時(shí)的雙波段吸收-洗脫體積曲線(xiàn)圖；圖6為實(shí)施例2中FPLC系統(tǒng)純化I個(gè)合成單位核心裝載0. I μ mol膽固醇酯的dtDTNPNPC納米顆粒時(shí)的雙波段吸收-洗脫體積曲線(xiàn)圖7為實(shí)施例2中動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)系統(tǒng)測(cè)量dtDTNPNrc納米顆粒的納米粒徑分布圖；圖8為實(shí)施例2中圓二色譜儀對(duì)dtDTNPNrc納米顆粒中多肽α螺旋結(jié)構(gòu)的測(cè)定曲線(xiàn).
-^4 ，圖9為實(shí)施例3中(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與5-8F_mRFP和肺癌細(xì)胞LLC分別孵育Ih后的激光共聚焦成像結(jié)果；圖10為實(shí)施例3中(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5-8F細(xì)胞孵育Ih后流式細(xì)胞儀檢測(cè)的直方圖；
圖11為實(shí)施例3中(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5_8F細(xì)胞孵育Ih后，細(xì)胞攝取量的熒光定量結(jié)果。圖12為實(shí)施例3中(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5-8F細(xì)胞孵育Ih后，用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑鑒定細(xì)胞的死亡方式的激光共聚焦成像結(jié)果；圖13為實(shí)施例3中(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5-8F腫瘤孵育Ih后，用流式細(xì)胞儀和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑定量檢測(cè)細(xì)胞的死亡數(shù)量和鑒定死亡方式的
結(jié)果;圖14為實(shí)施例4中尾靜脈注射2. 5nmol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒后，分別于3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h后進(jìn)行整體熒光成像的結(jié)果；圖15為實(shí)施例4中尾靜脈注射2. 5nmol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒24h后各臟器的整體熒光成像結(jié)果；圖16為實(shí)施例5中在裸鼠皮下接種5-8F或LLC腫瘤細(xì)胞，第三天后隔天尾靜脈注射2. 5nmol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒或PBS直至14天，腫瘤體積變化的曲線(xiàn)圖；圖17為實(shí)施例5中在裸鼠皮下接種5-8F或LLC腫瘤細(xì)胞，第三天后隔天尾靜脈注射2. 5nmol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒或PBS直至14天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組荷瘤裸鼠體重變化的曲線(xiàn)圖。圖18為實(shí)施例7中鼻咽癌5-8F細(xì)胞與裝載有姜黃素(curcumin)的dtDTNPNrc，游離姜黃素孵育Ih后的細(xì)胞激光共聚焦成像結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本實(shí)施實(shí)例中我們使用前期工作中發(fā)明的一種具有多價(jià)效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法，制備了基于四聚體遠(yuǎn)紅熒光蛋白的多肽八價(jià)納米熒光探針。為了對(duì)多肽LTVSPWYLTVSPWY的腫瘤靶向性進(jìn)行篩選與鑒定，我們利用該探針對(duì)不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行檢驗(yàn)與篩選。結(jié)果如圖I所示，多肽LTVSPWYLTVSPWY不僅對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有很好的靶向性，而且能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。圖2為Octa-FNP熒光納米探針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞孵育3h后FACS流式定量結(jié)果，可以很明顯看到，相對(duì)應(yīng)肝癌和宮頸癌等很多癌細(xì)胞，基于LTVSPWYLTVSPWY多肽的八價(jià)納米熒光探針更容易被鼻咽癌(如5-8F細(xì)胞、SUNE-I細(xì)胞和H0NE-1細(xì)胞等)攝取。實(shí)施例2本實(shí)施例中，我們將具有鼻咽癌特異性靶向與治療功能的兩種多肽LTVSPWYLTVSPWY和FAEKFKEAVKDYFAKFWD通過(guò)GSG序列相連，形成一條具有協(xié)同靶向與治療鼻咽癌功能的新型多肽(簡(jiǎn)稱(chēng)為 dtTPNre, a dual-targeted therapeutic peptide forNasopharyngeal carcinoma)。其完整氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. I所述。利用dtTPNrc制備的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒(簡(jiǎn)稱(chēng)dtDTNPNrc，adual-_targeted diagnostic and therapeutic nano^article for Nasopharyngealparcinoma),其步驟為I)將 3ymolDMPC(I,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)>0. 225 μ molDiR-BOA (或0. I μ mol Cholesteryl oleate,簡(jiǎn)稱(chēng)C. 0)的氯仿溶液在玻璃試管中充分混合,并用封口膜將試管口封死；2)在穩(wěn)定的氮?dú)饬髦袑⒃嚬軆?nèi)的氯仿吹干，使步驟I)中的混合物能夠在試管底部 形成一層薄膜；3)將試管放入真空干燥器中真空干燥Ih ；4)向試管中加入Iml的磷酸緩沖液，利用渦旋震蕩儀稍稍振蕩；5)將試管在48° C水浴中超聲30_60min，以溶液變澄清為準(zhǔn)；6)使用注射器向密封的試管中加入含有0. 36 μ mol dtTPNPC多肽的PBS溶液，混勻后密封，4° C放置過(guò)夜；7)次日，使用FPLC系統(tǒng)純化，收集富含dtDTNPNrc納米顆粒的溶液，并濃縮備用；為了研究dtDTNPNrc納米顆粒的腫瘤特異祀向能力，選擇核心裝載突光染料DiR-BOA (一種經(jīng)過(guò)膽固醇酯修飾的近紅外熒光染料，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為748nm和780nm)，使得納米顆粒同時(shí)具有協(xié)同靶向診斷與治療鼻咽癌的功能。我們通過(guò)調(diào)整熒光染料D i R-BOA與多肽和磷脂之間的配比，獲得了合適粒徑并有一定裝載量的dtDTNPNrc納米顆粒。FPLC純化結(jié)果如圖3至圖4所示。圖3為FPLC系統(tǒng)純化2個(gè)合成單位
0.4 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒時(shí)的雙波段吸收-洗脫體積曲線(xiàn)圖，此合成比例在118min左右有非常多游離的多肽，并且熒光染料DiR-BOA的吸收峰值非常低，表明裝載熒光染料DiR-BOA的效率非常低。將2個(gè)納米顆粒合成單位核心裝載的熒光染料DiR-BOA摩爾量調(diào)整為0.45μπιΟ1時(shí)，得到結(jié)果如圖4所示。此合成比例，得到的納米顆粒大部分都在55. 52min出峰,盡管在42. 56min有一個(gè)極小的峰,但是相比較最佳納米顆粒出峰的積分面積來(lái)說(shuō)此比例是非常小的，而且?guī)缀鯖](méi)有游離多肽。如果將2個(gè)納米顆粒合成單位核心裝載的熒光染料DiR-BOA量調(diào)整為0.5 μ mol時(shí)，如圖5所示，納米顆粒最佳出峰時(shí)間由原來(lái)的55. 52min提前至Ij 50. 08min,原來(lái)在42. 56min時(shí)出小峰也變?yōu)樵?1. 60min時(shí)出大峰了，且在IlSmin時(shí)又出現(xiàn)了非常多的游離多肽。因此，此配比下所合成的納米顆粒效率大大降低。由此，合成具有合適粒徑的(DiR-BOA) dtDTNP-納米顆粒，其各組分最佳配比為6 μ mol DMPC>0. 45 μ mol DiR-BOA, O. 72 μ mol dtTPNPC 多妝。為了研究多肽協(xié)同靶向治療鼻咽癌的功能，使用膽固醇酯替代近紅外熒光染料DiR-BOA同樣可以得到合適粒徑的納米顆粒。FPLC純化結(jié)果如圖6，得到的納米顆粒出峰時(shí)間為59. 60min, IlSmin時(shí)僅有很少的游離多肽，這說(shuō)明上述優(yōu)化配比是適合膽固醇酯的。其原料配比為3ymolDMPC、0. Iymol C. 0,0. 36 μ mol dtTPNrc 多肽。使用動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)系統(tǒng)測(cè)量上述純化的dtDTNPNrc納米顆粒的粒徑，結(jié)果如圖7所示，平均粒徑為14.60±1.64nm，且粒徑均一、單分散性好。圖8為圓二色譜儀對(duì)dtDTNP-納米顆粒中多肽α螺旋結(jié)構(gòu)的測(cè)定，結(jié)果表明合成的dtDTNPNrc納米顆粒具有典型的α螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3實(shí)施例2中制備核心裝載熒光染料DiR-BOA的dtDTNPNrc納米顆粒，其腫瘤細(xì)胞的靶向性驗(yàn)證結(jié)果如圖9所示。2 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌細(xì)胞5-8F_mRFP和肺癌細(xì)胞LLC孵育Ih后進(jìn)行激光共聚焦成像。成像結(jié)果顯示，(DiR-BOA) dtDTNPNrc納米顆粒很容易被5-8F-mRFP細(xì)胞攝取，卻不能被LLC細(xì)胞攝取，說(shuō)明(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒具有鼻咽癌細(xì)胞的選擇性靶向能力。為了定量測(cè)定鼻咽癌細(xì)胞攝取(DiR-BOA) dtDTNPNrc納米顆粒的能力，含8 μ mol多肽的(DiR-BOA) -dtDTNPNPC納米顆粒與5-8F細(xì)胞孵育Ih后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。如圖10和圖11結(jié)果所示，相比對(duì)照組來(lái)說(shuō)，(DiR-BOA) dtDTNPNrc納米顆粒孵育的鼻咽癌5-8F細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度大大提高，是空白對(duì)照組的 120倍。
為了研究dtDTNPNrc納米顆粒是誘導(dǎo)鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡還是壞死，2 μ mol (DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5-8F細(xì)胞孵育Ih后，再用Annexin V-FITC/PI試劑定量檢測(cè)細(xì)胞的FITC/PI熒光信號(hào)。圖12為激光共聚焦成像檢測(cè)DiR-BOA、FITC和PI三種熒光信號(hào)的結(jié)果。DiR通道呈示出很強(qiáng)的熒光信號(hào)；同時(shí)，PI通道部分細(xì)胞也表現(xiàn)出強(qiáng)PI信號(hào)，標(biāo)志著部分細(xì)胞的死亡；而FITC通道的信號(hào)熒光較弱，由此初步判斷(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒誘導(dǎo)的是鼻咽癌5-8F細(xì)胞壞死。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步定量檢測(cè)(DiR-BOA) dtDTNP-納米顆粒作用的細(xì)胞在FITC和PI通道的熒光信號(hào)強(qiáng)度。圖13為含8 μ mol多肽的(DiR-BOA) -dtDTNPNPC納米顆粒與鼻咽癌5-8F細(xì)胞孵育lh，然后用Annexin V-FITC/PI試劑進(jìn)行復(fù)染，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC (FLl)/PI (FL3)通道的細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)判定凋亡或壞死的細(xì)胞數(shù)量。相對(duì)于對(duì)照組(DiR-BOA)-dtDTNPNrc納米顆粒孵育過(guò)的腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)Ll與FL3通道都有很強(qiáng)的信號(hào)，表明(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒主要是通過(guò)壞死機(jī)制來(lái)殺死鼻咽癌5-8F細(xì)胞的。實(shí)施例4實(shí)施例2中制備的(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒在體靶向性評(píng)價(jià)。將I X IO6個(gè)5-8F細(xì)胞接種到裸鼠皮下構(gòu)建鼻咽癌荷瘤裸鼠模型。當(dāng)5_8F腫瘤體積達(dá)到0. 5cm3時(shí)，對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行整體熒光成像，一般設(shè)定4個(gè)曝光時(shí)間點(diǎn)。然后尾靜脈注射 2. 5nmol (DiR-BOA) dtDTNPNPC 納米顆粒。尾靜脈注射后的 3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h進(jìn)行整體熒光成像，選擇的曝光時(shí)間與尾靜脈注射之前的相同。整體熒光成像系統(tǒng)使用的是氙燈光源，716/40nm的激發(fā)濾光片，接收濾光片為800FS40-25帶通濾光片。為了獲得更好的信噪比，使用685/40nm激發(fā)濾光片以采集來(lái)源于組織的自發(fā)熒光，并在后續(xù)的圖像處理中扣除自發(fā)熒光對(duì)熒光信號(hào)的干擾。如圖14所示，(DiR-BOA) dtDTNPNrc納米顆粒在尾靜脈注射24h時(shí)就能有效地蓄積于5-8F腫瘤，48h時(shí)5-8F腫瘤處的突光信號(hào)最強(qiáng)，而在72h后5-8F腫瘤與正常組織之間具有最佳的信噪比?；铙w動(dòng)態(tài)熒光成像結(jié)果充分證實(shí)了 dtDTNPNrc納米顆粒的腫瘤祀向標(biāo)記能力。圖15為圖14中所示荷瘤鼠在尾靜脈注射(DiR-BOA) dtDTNPNPC納米顆粒96h后各臟器的整體熒光成像結(jié)果，進(jìn)一步顯示，(DiR-BOA)dtDTNPNPC納米顆粒在腫瘤部位的靶向蓄積能力，僅在肝臟和脾臟部位有一定程度的富集。實(shí)施例5
實(shí)施例2中制備的dtDTNPNrc納米顆粒對(duì)鼻咽癌腫瘤治療效果的在體評(píng)價(jià)。構(gòu)建鼻咽癌5-8F和肺癌LLC的裸鼠皮下模型。LLC腫瘤作為dtDTNPNrc納米顆粒靶向的陰性對(duì)照組。消化5-8F和LLC細(xì)胞，使用滅菌的PBS漂洗兩次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，裸鼠接種5-8F細(xì)胞的數(shù)目為I X IO6個(gè)/只，接種后的荷瘤裸鼠隨機(jī)共分為PBS對(duì)照組和dtDTNPNPC納米顆粒5-8F腫瘤治療組；LLC腫瘤對(duì)照組的裸鼠皮下接種LLC細(xì)胞2 X IO6個(gè)/只。這三組荷瘤裸鼠每組的數(shù)量為5只。在腫瘤細(xì)胞皮下接種后第3天，即開(kāi)始尾靜脈注射dtDTNPNrc進(jìn)行治療，給藥頻率為隔天尾靜脈注射一次。PBS組為尾靜脈注射等體積的無(wú)菌PBS，即注射量為O. 25ml/只。5-8F腫瘤治療組和LLC腫瘤治療對(duì)照組的尾靜脈注射劑量為含IOnmol多肽的dtDTNPNPC納米顆粒。皮下接種腫瘤細(xì)胞的裸鼠，在第3天和第4天時(shí)腫瘤的體積都為零，第五天時(shí)腫瘤才開(kāi)始長(zhǎng)出來(lái)。腫瘤體積的計(jì)算公式為v=0. 5XLXHXH。 如圖16所示，經(jīng)過(guò)3輪的dtDTNPNrc給藥后，5_8F腫瘤治療組與PBS對(duì)照組相比，已表現(xiàn)出明顯的腫瘤生長(zhǎng)被抑制的現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)5輪的dtDTNPNrc給藥后，5-8F腫瘤的生長(zhǎng)依然處于被抑制狀態(tài)，而LLC腫瘤的體積已明顯增大。5-8F腫瘤治療組與PBS對(duì)照組和LLC腫瘤對(duì)照組之間具有顯著性的差異。在荷瘤裸鼠的體重變化方面，經(jīng)過(guò)6輪治療，5-8F腫瘤治療組與PBS對(duì)照組和LLC腫瘤對(duì)照組之間無(wú)明顯的差異(如圖17所示)，表明dtDTNPNrc納米顆粒對(duì)荷瘤裸鼠本身沒(méi)有明顯的毒副作用。實(shí)施例6將實(shí)施例2中制備dtDTNPNrc所用的膽固醇油酸酯，部分替換為脂溶性藥物紫杉醇(PTX-0L)。利用磷脂、dtTPNrc多肽與紫杉醇進(jìn)行混合，形成(PTX-OL) dtDTNPNPC納米顆粒，可實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的協(xié)同靶向聯(lián)合治療的效果。實(shí)施例7將實(shí)施例2中制備dtDTNPNrc所用的膽固醇油酸酯，部分替換為脂溶性藥物姜黃素(Curcumin)。利用磷脂、dtTPNrc多肽與姜黃素進(jìn)行混合形成(Curcumin) dtDTNPNrc納米顆粒，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有很好的殺傷效果。如圖18所示，含2 μ mol姜黃素的游離姜黃素和(Curcumin) dtDTNPNPC納米顆粒分別與5-8F_mRFP細(xì)胞孵育Ih后進(jìn)行共聚焦熒光成像，與游離姜黃素相比，(Curcumin) dtDTNPNPC更容易被5-8F_mRFP攝取，而且有更好的殺傷作用。
權(quán)利要求
1.一種具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽，其特征在于，所述多肽是由具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽、連接序列肽以及具有α螺旋結(jié)構(gòu)的鼻咽癌靶向治療多肽以共價(jià)鍵的形式串連而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為 FAEKFKEAVKDYFAKFWDGSGLTVSPWYLTVSPWY。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽，其特征在于，所述具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)TVSPWYLTVSPWY。
4.一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由權(quán)利要求I所述的具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽、磷脂、膽固醇脂或裝載物組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述裝載物為成像對(duì)比劑、藥物分子或者兩者的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述成像對(duì)比劑為膽固醇脂修飾的熒光染料分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述膽固醇脂修飾的熒光染料分子為DiR-BOA或Fluo-BOA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述藥物分子為紫杉醇、姜黃素。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒，其特征在于，所述憐脂優(yōu)先選擇 DMPC (I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。
10.一種具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于，所述納米顆粒能夠高效特異性地靶向鼻咽癌，并且極顯著性地抑制鼻咽癌腫瘤的生長(zhǎng)，可以應(yīng)用于臨床治療。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽、具有協(xié)同靶向診療鼻咽癌功能的納米顆粒及其應(yīng)用，屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域。該多肽由具有靶向治療鼻咽癌作用的多肽、連接序列肽以及具有α螺旋結(jié)構(gòu)的鼻咽癌靶向治療多肽以共價(jià)鍵的形式串連而成。該納米顆粒是由具有協(xié)同靶向治療鼻咽癌功能的多肽、磷脂、膽固醇脂或裝載物組成。該多肽和納米顆粒能夠高效特異性地靶向鼻咽癌，并且極顯著性地抑制鼻咽癌腫瘤的生長(zhǎng)，可以應(yīng)用于臨床治療。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102766215SQ201210185089
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者張智紅, 駱海明, 駱清銘 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)