專利名稱：一種微納米纖維骨修復(fù)支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織修復(fù)材料，具體涉及一種內(nèi)嵌復(fù)合顆粒的微納米纖維骨修復(fù)支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
因疾病和外傷造成的骨缺損是一種常見的骨科問(wèn)題。自體骨、異體骨和人造骨填充組織工程材料是骨修復(fù)手術(shù)中常采用三類材料。自體骨無(wú)排異具有很好的修復(fù)效果，但自體骨填充需要從健康的骨組中采集，存在損傷、骨量不足的缺點(diǎn)。特別是當(dāng)需要進(jìn)行大段骨填充時(shí)，很難采集到合適大小和形狀的自體骨?，F(xiàn)有技術(shù)中有采用天然牛骨或其它動(dòng)物骨為材料，通過(guò)脫細(xì)胞分別去除軟骨和骨的抗原性，采用冷凍-凍干法，制備適合骨組織生長(zhǎng)的支架。這種異體骨雖然可以克服骨量不足的問(wèn)題，但同時(shí)存在排異和感染的風(fēng)險(xiǎn)，如牛骨具有感染牛海綿狀腦病(瘋牛病)是的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，可以克服異體骨帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)的人 造骨填充材料在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。通常人們認(rèn)為好的骨填充材料需要具備如下各特性1、無(wú)組織危害性；2、高骨傳導(dǎo)性；3、能與骨置換；在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中、通常采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察骨填充材料的誘導(dǎo)性；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)良的骨填充材料應(yīng)具有以下特點(diǎn)炎癥反應(yīng)輕、誘導(dǎo)自體骨生長(zhǎng)、并取代填充材料降解后的縫隙。羥基磷灰石等無(wú)機(jī)骨修復(fù)材料具有較好的骨傳導(dǎo)性，研究人員對(duì)其作了很多開拓性工作。通常采用以下方法，化學(xué)合成羥基磷灰石粉末材料后，燒結(jié)羥基磷灰石粉末形成的燒結(jié)體作為骨填充材料，通過(guò)調(diào)整植入材料的降解時(shí)間、空隙度及硬度以達(dá)到較好的植入效果。在實(shí)際應(yīng)用中，羥基磷灰石燒結(jié)類陶瓷人體吸收性較差，仍然存在異物殘留等問(wèn)題，在臨床治療中，有長(zhǎng)期植入骨不成活病例的發(fā)生。由于磷酸類鈣鹽具有較好的骨傳導(dǎo)活性和骨置換性，為調(diào)整骨填充材料的降解速度及生物活性，研究人員仍在對(duì)各種磷酸類、碳酸類鈣鹽及其復(fù)合材料進(jìn)行廣泛研究。另外，創(chuàng)傷性骨缺損易感染，多不能一期手術(shù)植骨，需大量抗生素預(yù)防治療，增加了患者痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，雖然微納米仿生骨材料有良好的組織相容性，但若單純植入，仍不能避免感染發(fā)生，往往效果欠佳。并且雖然單純的微納米無(wú)機(jī)仿生骨材料對(duì)骨有一定的誘導(dǎo)作用，但誘導(dǎo)能力不足，不能證明其具有促進(jìn)骨生長(zhǎng)的作用。為彌補(bǔ)無(wú)機(jī)材料的不足，人們研究采用生物吸收性有機(jī)聚合物材料。在活體組織中，生物吸收性有機(jī)聚合物材料具有較好的降解可控性，并已經(jīng)在其它領(lǐng)域做了廣泛的研究。有機(jī)骨填充材料能夠改善仿生骨材料的韌性并增強(qiáng)力學(xué)性能以及其可吸收性和組織相容性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)骨組織的誘導(dǎo)再生，并且最終被人體吸收。有機(jī)聚合物骨填充材料的歷程經(jīng)歷了如下階段，從簡(jiǎn)單粉碎聚合物制備的顆粒狀骨填充材料到以先進(jìn)組織工程技術(shù)為基礎(chǔ)的新型骨填充材料。組織工程首先由Wofter于1984年提出，特指血管組織的體外構(gòu)建。1988年，美國(guó)科學(xué)基金會(huì)(NSF)專門作了以下界定“應(yīng)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物正常和病理組織與器官的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，并開發(fā)具有生物活性的人工替代物，以恢復(fù)、維持或改善組織、器官的功能”。骨組織工程中研究專注于可降解支架材料形成的多孔細(xì)胞支架上，活細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的作用下，修復(fù)組織缺損。近年開發(fā)了聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、殼聚糖(Chitosan)等各類有機(jī)材料體系。并開發(fā)出了電紡、臨界二氧化碳致孔、微粒鹽致孔等技術(shù)。靜電紡絲技術(shù)是利用靜電作用力對(duì)液體的吸引形成細(xì)流，經(jīng)拉伸、溶劑揮發(fā)形成纖維，可制備直徑幾納米到微米間的纖維。靜電紡絲制備的支架材料，在組織工程修復(fù)中得到了廣泛的應(yīng)用。CN200910153388. 8公開一種將羥基磷灰石納米顆粒配成懸浮液，然后添加聚(乳酸-羥基乙酸)，得到羥基磷灰石與聚(乳酸-羥基乙酸)的混合液，將混合液進(jìn)行靜電紡絲，獲得骨修復(fù)用聚(乳酸-羥基乙酸)/羥基磷灰石納米纖維復(fù)合膜支架，該技術(shù)提高了支架的誘導(dǎo)骨組織生長(zhǎng)的性能。但是這種支架中不含有生長(zhǎng)因子與藥物，創(chuàng)傷性骨缺損易感染，多不能一期手術(shù)植骨，雖然納米仿生骨材料有良好的組織相容性，但若單純植入，仍不能避 免感染發(fā)生，往往效果欠佳。組織工程技術(shù)應(yīng)用于人體組織修復(fù)存在以下問(wèn)題，當(dāng)周圍組織具備較高的活性，大量細(xì)胞吸附于支架上。然而如果周圍組織活性低，則需采用生長(zhǎng)因子療法。生長(zhǎng)因子療法是指在細(xì)胞增殖和分化的位點(diǎn)提供生長(zhǎng)因子。普遍認(rèn)為直接注射生長(zhǎng)因子無(wú)效，因?yàn)樯L(zhǎng)因子會(huì)很快的從這個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)散或被酶降解。因此必須解決生長(zhǎng)因子的緩釋問(wèn)題，如分子生物學(xué)采用的各類基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(腺病毒、電擊穿等)；如電紡技術(shù)中采用的復(fù)合夾心結(jié)構(gòu)等。將生長(zhǎng)因子制備成高分子緩釋顆粒，直接通過(guò)靜電紡絲制備骨修復(fù)材料的話，靜電紡絲過(guò)程會(huì)對(duì)高分子緩釋顆粒發(fā)生部分溶解，從而破壞緩釋效果。另外，電紡等工藝制備骨組織工程支架技術(shù)，經(jīng)歷了從單一成分的有機(jī)物支架，到加入鈣類化合物制備微觀仿生結(jié)構(gòu)支架，并進(jìn)一步調(diào)整加入顆粒的微觀結(jié)構(gòu)使組織工程支架具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)作用，如使用膠原與磷酸鈣制備的復(fù)合顆粒(浙江大學(xué)唐睿康教授課題組)。該類復(fù)合顆粒同樣存在靜電紡絲過(guò)程會(huì)對(duì)膠原部分溶解，削弱了復(fù)合顆粒的誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微納米纖維骨修復(fù)支架，這種微納米纖維骨修復(fù)支架中含有以醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽為殼的復(fù)合顆粒，復(fù)合顆粒嵌入并固定于纖維中，并且可加載生長(zhǎng)因子和/或藥物，可以提高骨修復(fù)材料的骨修復(fù)性能，另夕卜，通過(guò)包裹在單獨(dú)由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球外表面的醫(yī)用可降解無(wú)機(jī)鹽外殼，解決了由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球溶于電紡絲溶液從而造成修復(fù)效果下降的缺點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供所述微納米纖維骨修復(fù)支架的制備方法。本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種微納米纖維骨修復(fù)支架，所述微納米纖維骨修復(fù)支架是在用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物中添加復(fù)合顆粒，然后再制備成微納米纖維得到；所述復(fù)合顆粒具有核殼結(jié)構(gòu)，所述核為單獨(dú)由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球，所述殼為醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽；
所述微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球?yàn)橛筛叻肿硬牧吓c無(wú)機(jī)鹽組成。
作為一種優(yōu)選方案，所述復(fù)合顆粒的核還可以含有促進(jìn)骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子和/或藥物。這樣可以進(jìn)一步提高骨修復(fù)材料的修復(fù)性能。作為一種優(yōu)選方案，所述復(fù)合顆粒的粒徑范圍為l(Tl000iim。作為一種優(yōu)選方案，所述微納米纖維骨修復(fù)支架的纖維直徑為0. r200umo所述復(fù)合顆粒分散在微納米纖維骨修復(fù)支架的纖維上或分散在纖維的孔隙間。作為一種優(yōu)選方案，所述微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球優(yōu)選為具有插層結(jié)構(gòu)。
作為一種優(yōu)選方案，所述高分子材料為合成高分子材料或天然高分子材料，所述合成高分子材料為聚乳酸、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、殼聚糖或上述幾種物質(zhì)的共聚復(fù)合物；所述天然高分子材料為膠原、明膠、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸。作為一種優(yōu)選方案，所述醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選為磷酸鈣、硫酸鈣、碳酸鎂、氧化鋅或生物玻璃；
所述用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物優(yōu)選為聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物、膠原、聚乙二醇、殼聚糖、聚丙交酯或聚對(duì)二氧環(huán)己酮。所述生長(zhǎng)因子是指用于骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子，作為一種優(yōu)選方案，所述生長(zhǎng)因子優(yōu)選為骨形態(tài)生長(zhǎng)蛋白 BMP-I、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-P);生長(zhǎng)分化因子⑶F-5、⑶F-6、⑶F-7 ;胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF- I和IGF- II ;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，以及各類新型生長(zhǎng)因子基團(tuán)修飾類藥物；
所述活性藥物優(yōu)選為透明質(zhì)酸及其衍生物、硫酸軟骨素、抗生素及抗炎癥藥物、如治療骨結(jié)核的抗結(jié)核藥物、治療骨腫瘤的抗腫瘤藥物、治療骨髓炎的抗炎類藥物等。所述微納米纖維骨修復(fù)支架的制備方法，包括如下步驟
(1)制備復(fù)合顆粒的核；
(2)將步驟(I)所述核加入醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽的溶液中，靜置，使醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽在核的表面上沉積，得到一種以醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽為殼的復(fù)合顆粒；
(3)將用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物加入到有機(jī)溶劑中，得到質(zhì)量濃度為5 15%的溶液，將步驟(2)所得復(fù)合顆粒加入上述得到的溶液中，使復(fù)合顆粒在溶液中的質(zhì)量濃度為廣10%，震蕩分散，得到混合液；
(4)將步驟(3)所得混合液進(jìn)行紡絲，并將纖維收成膜，得到所述微納米纖維骨修復(fù)支架。所述的微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球是一種現(xiàn)有的產(chǎn)品，具體的制備方式可以參考現(xiàn)有技術(shù)，如(Nanoscale 2010，2，2456-2462)及相關(guān)文獻(xiàn)?？梢允遣捎贸Ｒ?guī)的溶劑蒸發(fā)法或微乳法等技術(shù)制備得到，還可以是根據(jù)下述方法得到的具有無(wú)機(jī)-有機(jī)插層結(jié)構(gòu)的微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球。所述具有插層結(jié)構(gòu)微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球的具體制備方法可以按如下步驟進(jìn)行
a、制備十二烷基磺酸鈉含量為r40mM，高分子材料含量為0.Of 5g/L的溶液，并可選擇性地添加或不添加0. l-10mg/ml的生長(zhǎng)因子和/或藥物，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液A;
b、制備硝酸鈣含量為5 1000mM的硝酸鈣溶液，調(diào)節(jié)pH值至10.5，得到溶液B ；
C、制備磷酸二氫鈉含量為5 IOOOmM的磷酸二氫鈉溶液，加入相對(duì)于磷酸二氫鈉溶液體積0. 2^0. 5倍的異丙醇，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液C ；
d、按體積比A:B=0. 5 2:1 B:C=0. 5^1:1的用量，將溶液B加入溶液A中，攪拌均勻后，緩慢滴加溶液C，溶液C的加入速度為0. 5^2ml/min,滴加過(guò)程中攪拌轉(zhuǎn)速控制為40(T800rpm，直至不再產(chǎn)生沉淀，所述沉淀即為具有插層結(jié)構(gòu)的高分子聚合物顆粒。所述的復(fù)合顆粒，是通過(guò)單獨(dú)由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球在醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽溶液中進(jìn)行自組裝得到的。作為一種優(yōu)選方案，步驟(2)中，所述醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽的溶液為由1(T200mM的無(wú)機(jī)鹽、5 200mM的沉淀劑、IOOmM的沉淀形貌調(diào)整劑及有機(jī)溶劑組成的混合水溶液；
所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈣、硝酸鋅、硝酸鈣、氯化鎂、硫酸鈣或正硅酸乙酯； 所述沉淀劑為磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉或鹽酸；
所述沉淀形貌調(diào)整劑為氯化鎂等鹽類、界面活性劑或絡(luò)合劑；
所述有機(jī)溶劑為醇類溶劑。作為一種優(yōu)選方案，所述以醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽為殼的復(fù)合顆?？梢园慈缦路椒ˋ、B或C制備
方法A:
將核放入含有摩爾濃度為10(T700mM的氯化鈉、l(T25mM的氯化鈣，l 10mM的磷酸氫二鈉、IOlOmM的碳酸氫鈉、5 15mM的氯化鎂，及含有占總混合溶液體積20 30%的異丙醇、乙醇的混合水溶液中，靜置24小時(shí)，在高分子聚合物顆粒的表面上形成一層磷酸鈣外殼。硫酸鈣、碳酸鎂等外殼可參考此法制備。方法B
將核放入含有摩爾濃度為f 15mM的氫氧化鈉，KTlOOmM的硝酸鋅乙醇溶液，質(zhì)量濃度riOg/L的聚乙烯吡咯烷酮的正己醇溶劑中，低速磁力攪拌20小時(shí)，并控制溫度為40°C。高分子聚合物顆粒表面覆蓋一層均勻的氧化鋅薄膜。方法C
將適量表面活性劑加入到去離子水中得到質(zhì)量濃度為5 50g/L的溶液，所述的表面活性劑為長(zhǎng)鏈季銨鹽類、環(huán)氧乙烯類等表面活性劑；添加核并使其終濃度為5 20g/L并攪拌均勻；隨后在該溶液中加入正硅酸乙酯終濃度為3 12g/L，氯化鈣的終濃度為l 20g/L，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，室溫水解3飛個(gè)小時(shí)；隨后加入磷酸氫二鈉使其終濃度為f 18g/L，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值到9. 5^11，溫度25飛5°C，中速攪拌下，反應(yīng)6 24小時(shí)，在高分子聚合物顆粒表面包覆一層生物玻璃。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為六氟異丙醇、醋酸水溶液、氯仿或二氯甲烷。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述靜電紡絲的條件優(yōu)選為微量注射泵的速率為廣10毫升/小時(shí)，高壓發(fā)生器的電壓為15 30KV，接收裝置的距離為1(T30厘米。本發(fā)明所述微納米纖維骨修復(fù)支架在骨修復(fù)中的應(yīng)用。更具體地，所述微納米纖維骨修復(fù)支架通過(guò)折疊、纏繞等方式制備具有成塊狀或管狀材料后填充進(jìn)缺損的骨組織中，可進(jìn)一步結(jié)合干細(xì)胞等療法以治愈骨缺損。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明所述微納米纖維骨修復(fù)支架，相對(duì)常規(guī)材料具有更高的活性，能夠更好地吸附誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)；所述的醫(yī)用生物可降解的非水溶性無(wú)機(jī)鹽外殼，保護(hù)了復(fù)合顆粒中的膠原、生長(zhǎng)因子和/或藥物，減少了電紡溶液體系對(duì)這些具有誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)作用的活性成分的影響，如以磷酸鈣為外層，磷酸鈣表面吸附骨細(xì)胞，其分解出的活性物質(zhì)有利于骨細(xì)胞分化，且磷酸鈣在被破骨細(xì)胞分解的同時(shí)釋放活性物質(zhì)，避免活性物質(zhì)在早期釋放出來(lái)，優(yōu)化了釋放條件；具有無(wú)機(jī)-有機(jī)插層結(jié)構(gòu)的微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球，具有人體仿生結(jié)構(gòu)，更有利于骨組織的修復(fù)。


圖I為本申請(qǐng)所述復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)示意 圖2為本申請(qǐng)所述復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)所述復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)見圖1，其中，I為含有生長(zhǎng)因子和/或藥物的具有緩釋功能的高分子聚合物顆粒內(nèi)核，2為醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽外殼。圖2為實(shí)施例2所述具有插層結(jié)構(gòu)的復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，I為具有聚合物與無(wú)機(jī)鹽的復(fù)合插層結(jié)構(gòu)的內(nèi)核，2為位于內(nèi)核I表面覆蓋一層無(wú)機(jī)鹽。以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例I
內(nèi)油相的制備稱取10 Ug生長(zhǎng)因子BMP-2充分溶于Ig的水溶液中；稱取0. 5g的聚乳酸溶解于IOg的二氯甲烷與丙酮體積比為2/1的油相中。將水相、油相兩種溶液混合形成混合，高速均質(zhì)機(jī)充分乳化lmin。將該乳液加入到含有0. 3g的聚乙二醇50g水溶液中，緩慢加入并超聲分散，隨后在25°C的環(huán)境中低速攪拌3小時(shí)，使有機(jī)溶劑揮發(fā)得到含生長(zhǎng)因子的聚乳酸顆粒。將聚乳酸顆粒放入含有摩爾濃度為350mM的氯化鈉、15mM的氯化鈣，IOmM的磷酸氫二鈉、20mM的碳酸氫鈉、15mM的氯化鎂的體積分?jǐn)?shù)為25%的異丙醇混合水溶液中，靜置24小時(shí)，在聚乳酸顆粒的表面上形成一層磷酸鈣外殼。取聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物(9:1) 5g，溶于六氟異丙醇50ml;隨后加入上述磷酸鈣外殼的聚乳酸高分子顆粒0. 5g，混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為20KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為15厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2
a、制備十二烷基磺酸鈉含量為20mM，殼聚糖或明膠含量為0.15g/L的溶液，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液A;
b、制備鈣離子濃度為500mM的鈣鹽溶液，調(diào)節(jié)pH值至10.5，得到溶液B ;
C、制備磷酸二氫鈉含量為500mM的磷酸二氫鈉溶液，加入相對(duì)體積0. 3倍的異丙醇，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液C ;
d、按體積比A: B: C=2:1:1的用量，將溶液B加入溶液A中，攪拌均勻后，緩慢滴加溶液C，溶液C的加入速度為lml/min，滴加過(guò)程中攪拌轉(zhuǎn)速控制為500rpm，直至不再產(chǎn)生沉淀，所述沉淀即為具有插層結(jié)構(gòu)高分子顆粒。將具有插層結(jié)構(gòu)高分子顆粒放入含有摩爾濃度為700mM的氯化鈉、IOmM的氯化鈣，IOmM的磷酸氫二鈉、15mM的碳酸氫鈉、IOmM的氯化鎂的體積分?jǐn)?shù)為25%的異丙醇混合水溶液中，靜置24小時(shí)，在緩釋顆粒的表面上形成一層磷酸鈣外殼。取膠原5g，溶于醋酸鹽混合水醇溶液中；隨后加入插層結(jié)構(gòu)無(wú)機(jī)外殼高分子顆粒
0.5g,混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為15KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為10厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)，用戊二醛蒸汽交聯(lián)。實(shí)施例3
a、制備十二烷基磺酸鈉含量為20mM，殼聚糖或明膠含量為0.15g/L的溶液，并添加·BMP-7的生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液A;
b、制備鈣離子濃度為為500mM的鈣鹽溶液，調(diào)節(jié)pH值至10.5，得到溶液B ；
C、制備磷酸二氫鈉含量為500mM的磷酸二氫鈉溶液，加入相對(duì)體積0. 3倍的異丙醇，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液C ;
d、按體積比A: B: C=2:1:1的用量，將溶液B加入溶液A中，攪拌均勻后，緩慢滴加溶液C，溶液C的加入速度為lml/min，滴加過(guò)程中攪拌轉(zhuǎn)速控制為500rpm，直至不再產(chǎn)生沉淀，所述沉淀即為具有插層結(jié)構(gòu)高分子顆粒。將具有插層結(jié)構(gòu)高分子顆粒放入含有摩爾濃度為700mM的氯化鈉、IOmM的氯化鈣，IOmM的磷酸氫二鈉、15mM的碳酸氫鈉、IOmM的氯化鎂的體積分?jǐn)?shù)為25%的異丙醇混合水溶液中，靜置24小時(shí)，在緩釋顆粒的表面上形成一層磷酸鈣外殼。取膠原5g，溶于醋酸鹽混合水醇溶液中；隨后加入插層結(jié)構(gòu)無(wú)機(jī)外殼高分子顆粒
0.5g,混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為15KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為10厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)，用戊二醛蒸汽交聯(lián)。實(shí)施例4
稱取0. 5g的聚乳酸溶解于IOg的二氯甲烷與丙酮體積比為2/1的油相中。將實(shí)施例2制備的插層結(jié)構(gòu)高分子緩釋顆粒0. 7g加入到油相中并超聲分散lmin。將該油相加入到含有0. 3g的聚乙二醇50g水溶液中，緩慢加入并超聲分散，隨后在25攝氏度的環(huán)境中低速攪拌3小時(shí)，使有機(jī)溶劑揮發(fā)得到復(fù)合結(jié)構(gòu)含生長(zhǎng)因子的聚乳酸顆粒。將復(fù)合結(jié)構(gòu)聚乳酸顆粒放入含有摩爾濃度為300mM的氯化鈉、20mM的氯化鈣，IOmM的磷酸氫二鈉、30mM的碳酸氫鈉、15mM的氯化鎂，及相對(duì)水溶液體積0. 3倍的異丙醇，乙醇的混合水溶液中，靜置24小時(shí)，在聚乳酸顆粒的表面上形成一層磷酸鈣外殼。取聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物(9 :l)5g，溶于六氟異丙醇50ml ;隨后加入磷酸隹丐外殼的聚乳酸顆粒0. 5g,混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為7毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為30KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為15厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例5
取濃度為0. IM的氫氧化鈉溶液0. 5ml，聚乙烯吡咯烷酮0. lg，正己醇19ml。攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為600rpm，將0. 5g濃度為IM的硝酸鋅乙醇溶液加入上述混合溶液中，持續(xù)攪拌20分鐘。將實(shí)施例I制備的聚乳酸顆粒放入上述鋅鹽溶液中，低速磁力攪拌20小時(shí)，并控制溫度為40°C。聚乳酸顆粒表面覆蓋一層均勻的氧化鋅薄膜。取聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物(9 :1) 5g，溶于六氟異丙醇50ml ;隨后加入上述氧化鋅外殼的聚乳酸顆粒0. 5g,混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為20KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為15厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6
將5g的十二烷基聚氧乙烯醚硫酸鈉加入到400ml的去離子水中，加入實(shí)施例I制備的聚乳酸顆粒4g并攪拌均勻；
加入3g的正硅酸乙酯，4g的氯化鈣，并用鹽酸調(diào)整pH值為2，室溫水解4個(gè)小時(shí)；隨后加入5g的磷酸氫二鈉，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為10. 5,溫度為40°C,攪拌轉(zhuǎn)速600rpm,反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)。聚乳酸顆粒表面覆蓋一層凝膠狀生物玻璃。取聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物(9:1) 5g，溶于六氟異丙醇50ml;隨后加入上述生物玻璃外殼的聚乳酸顆粒0. 5g，混合均勻。將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為25KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為15厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)。實(shí)施例7
制備十二烷基磺酸鈉含量為20mM，膠原含量為0. 15g/L的溶液，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液A;
制備鈣離子濃度為500mM的鈣鹽溶液，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液B ；
制備磷酸二氫鈉含量為500mM的磷酸二氫鈉溶液，加入相對(duì)體積0. 3倍的異丙醇，調(diào)節(jié)pH值至10. 5，得到溶液C ;
按體積比A: B: C=2:1:1的用量，將溶液B加入溶液A中，攪拌均勻后，緩慢滴加溶液C，溶液C的加入速度為lml/min,滴加過(guò)程中攪拌轉(zhuǎn)速控制為500rpm,直至不再產(chǎn)生沉淀,所述沉淀即為具有插層結(jié)構(gòu)顆粒。將5g的十二烷基聚氧乙烯醚硫酸鈉加入到400ml的去離子水中，加入上述的4g插層結(jié)構(gòu)顆粒，并攪拌均勻；加入3g的正硅酸乙酯，4g的氯化鈣，并用鹽酸調(diào)整pH值為2，室溫水解4個(gè)小時(shí)；隨后加入5g的磷酸氫二鈉，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為10. 5，溫度為40°C，攪拌轉(zhuǎn)速600rpm，反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)。聚乳酸顆粒表面覆蓋一層凝膠狀生物玻璃。取聚乙交酯-聚(L-乳酸)共聚物(9:1) 5g，溶于六氟異丙醇50ml;隨后加入上述生物玻璃外殼的聚乳酸顆粒0. 5g，混合均勻。
將上述溶液加入靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為25KV，調(diào)節(jié)接收裝置的距離為15厘米，將纖維收為膜狀結(jié)構(gòu)。實(shí)施例8
用實(shí)施例3制得微納米纖維骨修復(fù)支架進(jìn)行兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。3只新西蘭兔，體重2. 5±0. 5Kg，其中雌性I只，雄性2只。全麻后備皮，將動(dòng)物置于專用手術(shù)臺(tái)上，俯臥位，用碘伏酒精消毒，鋪好無(wú)菌敷料，布巾鉗固定好。切開兔腿部皮膚，使用剝離器分離骨膜，暴露脛骨骨板，用高速骨鉆制造兔子脛骨缺損，缺損大小為lcmX2cm，將實(shí)施例3制得的材料折疊成扇形塞入缺損處，調(diào)整填充物高度，使其與骨缺損面平齊，縫合。術(shù)后14天，肉眼觀察骨小梁較粗大，超聲骨密度儀檢測(cè)新生骨質(zhì)致密，并有較多的編織骨形成。術(shù)后3個(gè)月，缺損的骨洞表面有骨痂形成。敲擊骨痂，質(zhì)地堅(jiān)硬，與正常骨組織硬度相似，且骨痂顏色與自體骨顏色一致?？祻?fù)期間無(wú)炎癥反應(yīng)。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)良好，進(jìn)食進(jìn)水正常。肢體運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)后，未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙。實(shí)施例9
用實(shí)施例6制得微納米纖維骨修復(fù)支架進(jìn)行兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。3只新西蘭兔，體重2. 5±0. 5Kg，其中雌性I只，雄性2只。全麻后備皮，將動(dòng)物置于專用手術(shù)臺(tái)上，俯臥位，用碘伏酒精消毒，鋪好無(wú)菌敷料，布巾鉗固定好。切開兔腿部皮膚，使用剝離器分離骨膜，暴露脛骨骨板，用高速骨鉆制造兔子脛骨缺損，缺損大小為lcmX2cm，將實(shí)施例6制得的材料折疊成扇形塞入缺損處，調(diào)整填充物高度，使其與骨缺損面平齊，縫合。術(shù)后14天，肉眼觀察 骨小梁較粗大，超聲骨密度儀檢測(cè)新生骨質(zhì)致密，并有較多的編織骨形成。術(shù)后3個(gè)月，缺損的骨洞表面有骨痂形成。敲擊骨痂，質(zhì)地堅(jiān)硬，與正常骨組織硬度相似，且骨痂顏色與自體骨顏色一致?？祻?fù)期間無(wú)炎癥反應(yīng)。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)良好，進(jìn)食進(jìn)水正常。肢體運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)后，未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙。實(shí)施例10
用實(shí)施例2制得微納米纖維骨修復(fù)支架進(jìn)行兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。3只新西蘭兔，體重
2.5±0. 5Kg，其中雌性I只，雄性2只。全麻后備皮，將動(dòng)物置于專用手術(shù)臺(tái)上，俯臥位，用碘伏酒精消毒，鋪好無(wú)菌敷料，布巾鉗固定好。切開兔腿部皮膚，使用剝離器分離骨膜，暴露脛骨骨板，用高速骨鉆制造兔子脛骨缺損，缺損大小為lcmX2cm，將實(shí)施例2制得的材料折疊成扇形塞入缺損處，調(diào)整填充物高度，使其與骨缺損面平齊，縫合。術(shù)后14天，肉眼觀察骨小梁較粗大，超聲骨密度儀檢測(cè)新生骨質(zhì)致密，并有較多的編織骨形成。術(shù)后3個(gè)月，新骨平整，但骨化中心周圍的新生骨小梁較少，骨密質(zhì)不足，新骨硬度較低。對(duì)比例I
陰性對(duì)照組，3只新西蘭兔，體重2. 5±0. 5Kg，其中雌性I只，雄性2只。手術(shù)方法同實(shí)施例8，缺損大小lCmX2Cm。止血后直接進(jìn)行包扎。術(shù)后三個(gè)月觀察，骨缺損處無(wú)骨形成，且有炎癥及紫紅色血栓的形成。對(duì)比例2
陽(yáng)性對(duì)照組，3只新西蘭兔，體重2. 5±0. 5Kg，其中雌性I只，雄性2只。手術(shù)方法同實(shí)施例8，缺損大小lCmX2Cm。在缺損處植入P _磷酸鈣骨水泥后縫合包扎。術(shù)后三個(gè)月觀察，新骨較脆且不平整。從實(shí)施例8 10及對(duì)比例可以看出，本發(fā)明所述緩釋微納米纖維骨修復(fù)材料具有良好的骨修復(fù)性能。
權(quán)利要求
1.一種微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述微納米纖維骨修復(fù)支架是在用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物中，添加復(fù)合顆粒，然后再制備成微納米纖維得到；所述復(fù)合顆粒具有核殼結(jié)構(gòu)，所述核為単獨(dú)由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球，所述殼為醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽； 所述微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球?yàn)橛筛叻肿硬牧吓c無(wú)機(jī)鹽組成。
2.如權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述復(fù)合顆粒的核還含有促進(jìn)骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子和/或藥物。
3.如權(quán)利要求I所述的微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述復(fù)合顆粒的粒徑范圍為10 1000μ m。
4.如權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述微納米纖維骨修復(fù)支架的纖維直徑為O. Γ200 μ m。
5.如權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述復(fù)合顆粒分散在微納米纖維骨修復(fù)支架的纖維上或分散在纖維的孔隙間。
6.如權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述高分子材料為合成高分子材料或天然高分子材料，所述合成高分子材料為聚乳酸、聚こ醇酸、聚甲基丙烯酸甲酷、殼聚糖或上述幾種物質(zhì)的共聚復(fù)合物；所述天然高分子材料為膠原、明膠、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸。
7.如權(quán)利要求1、2、5或6任意一項(xiàng)權(quán)利要求中所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球具有插層結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架，其特征在于，所述醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽為磷酸鈣、硫酸鈣、碳酸鎂、氧化鋅或生物玻璃； 所述用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物為聚こ交酷-聚(L-乳酸)共聚物、膠原、聚こニ醇、殼聚糖、聚丙交酯或聚對(duì)ニ氧環(huán)己酮。
9.權(quán)利要求I所述微納米纖維骨修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (O制備復(fù)合顆粒的核； (2)將步驟(I)所述核加入醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽的溶液中，靜置，使醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽在核的表面上沉積，得到ー種以醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽為殼的復(fù)合顆粒； (3)將用于骨修復(fù)支架制備的可降解聚合物加入到有機(jī)溶劑中，得到質(zhì)量濃度為5 15%的溶液，將步驟(2)所得復(fù)合顆粒加入上述得到的溶液中，使復(fù)合顆粒在溶液中的質(zhì)量濃度為廣10%，震蕩分散，得到混合液； (4)將步驟(3)所得混合液進(jìn)行紡絲，并將纖維收成膜，得到所述微納米纖維骨修復(fù)支架。
10.如權(quán)利要求9所述微納米纖維骨修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述紡絲為靜電紡絲，所述靜電紡絲的條件為微量注射泵的速率為f 10毫升/小吋，高壓發(fā)生器的電壓為15 30KV，接收裝置的距離為10 30厘米。
全文摘要
本發(fā)明公開一種微納米纖維骨修復(fù)支架。其是通過(guò)在用于骨修復(fù)的工程支架可降解聚合物中添加復(fù)合顆粒后，再制備成微納米纖維得到；所述復(fù)合顆粒具有核殼結(jié)構(gòu)，所述核為由高分子材料制備的聚合物顆?；蛭⒂^尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球，所述殼為醫(yī)用生物可降解無(wú)機(jī)鹽；所述微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球?yàn)橛筛叻肿硬牧吓c無(wú)機(jī)鹽組成。所述微納米纖維骨修復(fù)支架，具有更高的活性，能夠更好地吸附誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)；所述的醫(yī)用生物可降解的非水溶性無(wú)機(jī)鹽外殼，還能起到保護(hù)了復(fù)合顆粒中的膠原、生長(zhǎng)因子和/或藥物的作用；具有無(wú)機(jī)-有機(jī)插層結(jié)構(gòu)的微觀尺度上類骨結(jié)構(gòu)的仿生活性微球，具有人體仿生結(jié)構(gòu)，更有利于骨組織的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61L27/50GK102671244SQ20121018061
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者徐弢, 王國(guó)帥, 袁玉宇 申請(qǐng)人:廣州邁普再生醫(yī)學(xué)科技有限公司, 深圳邁普再生醫(yī)學(xué)科技有限公司