專利名稱：類黃酮類的糖苷化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類黃酮類的糖苷化。通過本發(fā)明得到的類黃酮類的糖苷，可作為食品、醫(yī)藥品、以及化妝品使用。
背景技術(shù)：
有關(guān)原花色素(葡萄籽提取物)作為血管治療藥物的有用性方面的研究已深入開展，其理由之一可例舉因作為對象的物質(zhì)對熱、酸穩(wěn)定，在水中溶解良好，吸收性高，所以可成為追蹤在生物體內(nèi)吸收、代謝的標記物。相對于此，兒茶素等多酚化合物具有大多在水中難于溶解、并且在生物體內(nèi)難于吸收的問題。為了改善在水中的溶解度、提高穩(wěn)定性，已研究了對兒茶素等進行糖苷化的技術(shù)。
例如，在專利文獻I公開了從野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)WU-9701的培養(yǎng)液中回收得到的分子量約為57，000的a -葡萄糖苷酶。該酶以麥芽糖等為供體(不以麥芽三糖、環(huán)糊精、淀粉等為供體)，向特定的受體上轉(zhuǎn)移葡萄糖來合成糖苷。在此，作為受體，例舉了薄荷醇、乙醇、I-丙醇、I- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、I-戊醇、2-戊醇、5-壬醇等具有醇羥基的化合物，以及辣椒素、二氫辣椒素、壬酸香草酰胺、兒茶素、表兒茶素、香草醛、氫醌、兒茶酚、間苯二酚、3，4_ 二甲氧基苯酚等具有酚羥基的化合物。此外，確認生成的糖苷僅為單葡萄糖苷。專利文獻2公開了使蔗糖磷酸化酶與兒茶素類和葡萄糖-I-磷酸或蔗糖的混合液進行作用，制造兒茶素類糖苷的方法。在此，作為蔗糖磷酸化酶的來源，可例舉腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜糖假單胞菌(Pseudomonas saccharophila)、腐敗假單胞菌(Pseudomonas putrefaciens)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、產(chǎn)糖芽霉菌(Pullularia pullulans)。在此，作為受體，作為兒茶素類，例舉了( + )-兒茶素、(-)-表兒茶素、(-)-表兒茶素3-0-沒食子酸酯、(_)-表沒食子兒茶素、以及(-)-表沒食子兒茶素3-0-沒食子酸酯，但作為實施例，僅記載了使用(+ ) _兒茶素為受:體制造(+ )-兒茶素3’ -0- a -D-卩比喃匍萄糖苷的例子。專利文獻3公開了在5、7、3’、4’、5’、3〃、4〃、5〃位中的至少一個上結(jié)合了葡萄糖殘基或聚合度為2 8的麥芽低聚糖殘基的表沒食子兒茶素3-0-沒食子酸酯衍生物。在此，與專利文獻2相同，作為實施例，僅記載了使蔗糖磷酸化酶與(_)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯和葡萄糖-I-磷酸或蔗糖的混合液進行作用，制造4’ -0- a -D-吡喃葡萄糖基(_)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及4’，4”-0-a -D- 二 -吡喃葡萄糖基(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯的例子。專利文獻4公開了通過對多酚類進行糖苷化而減少了澀味的茶提取物或茶飲料。在此，作為減少茶提取物或茶飲料的澀味的具體方法，記載了在茶提取物或茶飲料中添加糊精、環(huán)糊精、淀粉或這些物質(zhì)的混合物，使環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶與其作用的方法。在實施例中，記述了使來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)的環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶與綠茶提取物和a -環(huán)糊精進行作用，使得到的反應(yīng)產(chǎn)物中澀味降低的情況，并且主要記述了由此表明表沒食子兒茶素3-0-沒食子酸酯、表兒茶素等多酚類已被糖苷化。但是沒有明確反應(yīng)產(chǎn)物的具體結(jié)構(gòu)。專利文獻5公開了 3’位、3’和5位以及3’和7位被糖苷化的兒茶素類的糖苷。在此，作為進行糖苷化的具體方法，與專利文獻4相同，記載了使來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)的環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶與兒茶素類及糊精、環(huán)糊精、淀粉或這些物質(zhì)的混合物進行作用的方法。而且，在根據(jù)使用糊精作糖供體的上述方法的實施例中，對于(_)-表沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素3-0-沒食子酸酯、(_)-表兒茶素3-0-沒食子酸酯的糖苷，根據(jù)分子吸光系數(shù)，認為得到了每I分子的各多酚平均結(jié)合了 6 8個葡萄糖的糖苷。并且確認,通過使來自根霉(Rhizopus niveus)的葡萄糖淀粉酶與上述方法得到的糖苷進行作用，生成了 3’，7- 二 -0- a -D-吡喃葡萄糖基(_)-表沒食子兒茶素、3’ , 5- 二 -0- a -D-卩比喃匍萄糖基(-)-表沒食子兒茶素、3’ _0_ a -D-卩比喃匍萄糖基(_)_表沒食子兒茶素、3’ , 7- 二 -0- a -D-卩比喃匍萄糖基(-)-表沒食子兒茶素3_0_沒食 子酸酯、3’ -0- a -D-吡喃葡萄糖基(_)-表沒食子兒茶素3-0-沒食子酸酯、3’ _0_ a -D-吡喃匍萄糖基(_)-沒食子兒茶素、3’ -0- a -D-批喃匍萄糖基(_)-表兒茶素3_0_沒食子酸酯。此外，作為兒茶素糖苷的效果，非專利文獻I記載了澀味降低、水溶性提高、穩(wěn)定性改善、酪氨酸酶阻斷的效果，非專利文獻2記載了致突變性抑制的效果。專利文獻I日本特開2001-46096專利文獻2日本特開平5-176786 (專利第3024848號)專利文獻3日本特開平7-10897 (專利第3071610號)專利文獻4日本特開平8-298930 (專利第3579496號)專利文獻5日本特開平9-3089 (專利第3712285號)非專利文獻IBiosci. Biotech. Biochem.，57 (10)，1666-1669 (1993)非專利文獻2Biosci. Biotech. Biochem.，57 (10)，1290-1293 (1993)

發(fā)明內(nèi)容
這些糖苷化技術(shù)，從使用的酶的糖供體特異性、可進行糖苷化的化合物的特異性、糖苷化效率等觀點來看，并不能說是很充分，需要更多的能夠?qū)︻慄S酮類進行糖苷化的制造方法以及類黃酮糖苷。本發(fā)明者對包括兒茶素的類黃酮類的糖苷化技術(shù)進行了精心研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自木酶屬(Trichoderma)的各種酶劑中具有向類黃酮上轉(zhuǎn)移糖的活性，完成了本發(fā)明。本發(fā)明,提供類黃酮類的糖苷的制造方法，其包括使來自木酶屬(Trichoderma)的具有糖苷化活性的酶劑與類黃酮類和糖供體進行作用的工序。[類黃酮類]在本說明書中所述的“類黃酮類”，除特別情況之外，包括類黃酮以及七葉亭。在本說明書中所述的“類黃酮”，除特別情況之外，是指兒茶素類(黃烷醇)、二氫黃酮、黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、異黃酮、花色素苷以及查耳酮、以及這些物質(zhì)的甲基化物。類黃酮中包括柚皮素、槲皮素、大豆素、金雀異黃素、山奈酚?？稍诒景l(fā)明中使用的類黃酮，可以來自天然物，也可以是合成的類黃酮。在本說明書中所述的“兒茶素類”，除特別情況之外，采用廣義的兒茶素的意思，是指3-氧代黃烷(3-oxyflavane)的聚氧衍生物。其中包括兒茶素、沒食子兒茶素以及這些物質(zhì)的3-沒食子?；?，并且還包括這些物質(zhì)的光學(xué)異構(gòu)體((+)體、(_)體、(+)_表(印i)體、(-)_表(印i)體)以及外消旋體。具體包括兒茶素、沒食子兒茶素(gallocatechin ;GC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin-3-O-gallate ;CG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin-3-O-gallate ;GCG)、表兒茶素(epicatechin ;EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin ;EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate ；ECG)以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-0-gallate ； EGCG)、以及這些物質(zhì)的光學(xué)異構(gòu)體。兒茶素類的甲基化物，是指在上述兒茶素類中，至少一個OH基的H被甲基所取代后的化合物。作為兒茶素類的甲基化物的例子，可例舉在表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯或表沒食子兒茶素沒食子酸酯中的3’位、4’位、3"位以及4"位的任一個OH基的H被甲基取代后的化合物?？稍诒景l(fā)明中使用的兒茶素類以及兒茶素類的甲基化物，可以來自天然物，也可以為合成物。作為天然物的例子，可例舉茶提取物、其濃縮物以及純化物(例如 Teavigo (DSM Nutrition Japan )> Po I yphenon (三井農(nóng)林)以及 Sunphenon(太陽化學(xué))等的綠茶提取物)、以及紅富貴茶提取物。在本發(fā)明中，作為類黃酮類，可使用單一化合物，也可使用2種以上的類黃酮類的混合物。(酶劑)本發(fā)明中使用來自木霉屬(Trichoderma)的具有糖苷化活性的酶劑。木霉屬(Trichoderma)包括綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、土星抱木霉(Trichoderma saturnisporum)、力口納木霉(Trichoderma ghanense)
霉(Trichoderma koningii )、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)以及多抱木霉(Trichoderma polysporum)。在本說明書中所述的酶劑，除特別情況之外，有單一酶組成的情況，也有多種酶的混合物的情況。酶劑至少含有具有糖苷化活性的酶，也可含有作為纖維素酶或葡聚糖酶(例如3-1，3-葡聚糖酶)等而使用的與糖質(zhì)分解相關(guān)的其他酶。此外，本發(fā)明的酶劑，除酶成分之外，還可含有適當?shù)奶砑觿?。其中例如有賦形劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑?？稍诒景l(fā)明中使用的酶劑至少具有糖苷化活性。在本說明書中所述的“糖苷化活性”，是指具有向類黃酮類轉(zhuǎn)移糖殘基的活性。某種酶是否具有向類黃酮類轉(zhuǎn)移糖殘基的活性，除特別情況之外，例如可通過以下方法確認，即如本說明書的實施例所示，在類黃酮(例如兒茶素)和適當?shù)奶枪w(例如糊精)的混合液中供給對象酶，使反應(yīng)進行充足時間，將反應(yīng)液供給高效液相色譜法(HPLC)等來進行分析。本發(fā)明的酶劑，在具有糖苷化活性的同時，也可具有其他活性例如糊精酶活性。在本說明書中所述的“糊精酶”，除特別情況之外，是指可水解淀粉、糊精等a -葡萄糖苷結(jié)合的糖質(zhì)的酶。糊精酶是淀粉酶中的一種。對象是否具有糊精酶活性，可通過下述方法來判斷，即在適當?shù)臈l件下，使其與市售的糊精(例如通過酸、熱或酶將淀粉水解，平均分子量為3，500左右的產(chǎn)物)進行作用，根據(jù)糊精是否發(fā)生了水解來判斷。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可適當設(shè)計使對象發(fā)生作用的反應(yīng)的適當條件、以及用于判斷糊精是否發(fā)生水解的方法。在本發(fā)明中，作為酶劑，可優(yōu)選使用來自木霉屬(Trichoderma)的具有糖苷化活性的酶劑。在本發(fā)明中，作為酶劑，可有效使用來自綠色木霉(Trichoderma viride )的作為纖維素酶酶劑、以及￠-1, 3-葡聚糖酶酶劑使用的酶劑。通過本發(fā)明者的研究可知，作為纖維素酶或葡聚糖酶(例如P -I, 3-葡聚糖酶)等使用的來自木霉屬(Trichoderma)的各種酶劑均具有糖苷化活性，因此這種酶劑可有效應(yīng)用于類黃酮類的糖苷化中。例如，在本發(fā)明中，作為在本說明書的實施例2的表I中所列的酶劑可使用市售的酶劑。此夕卜，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可利用以往技術(shù)，從屬于木霉屬(Trichoderma)的菌(例如綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、土星抱木霉(Trichoderma saturnisporum)、力口納木霉(Trichoderma ghanense)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)或多孢木霉(Trichoderma polysporum))的培養(yǎng)物中分離 純化糖苷酶，作為酶劑用于本發(fā)明。在這種糖苷酶中，特別優(yōu)選的例子為，從綠色木霉(Trichoderma viride)IAM 5141株的培養(yǎng)上清中得到的糖苷酶(在本說明書中有時稱為“TRa2”)、以及其同源物，即含有下述)或(k)的蛋白質(zhì)(優(yōu)選為下述(i)、(j )或(k)的蛋白質(zhì))(i)由序列號10記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(j)由在序列號10記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列組成，并且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)；(k)由與序列號10記載的氨基酸序列至少有60%以上的同一性的氨基酸序列組成，并且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的其他例子為，除去了上述的新型糖苷酶蛋白質(zhì)中推定分泌信號序列部分后的成熟蛋白質(zhì)及其同源物，即含有下述(P)、(q)或(r)的蛋白質(zhì)(優(yōu)選為下述(p)、(q)或(r)的蛋白質(zhì))(p)由序列號26記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(q)由在序列號26記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列組成，并且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)；(r)由與序列號26記載的氨基酸序列至少有60%以上的同一性的氨基酸序列組成，并且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)。序列號25表示編碼作為成熟蛋白質(zhì)的TRa2的cDNA的堿基序列、即序列號9的第61-1389位堿基序列，序列號26表示作為成熟蛋白質(zhì)的TRa2的氨基酸序列、即序列號10的第21-463位氨基酸序列。此外，下述蛋白質(zhì)也可例舉為可在本發(fā)明中使用的糖苷酶的例子。 蛋白質(zhì)，其為來自木霉屬(Trichoderma),優(yōu)選來自綠色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichoderma reesei )、土星抱木霉(Trichoderma saturnisporum)、加納木霉(Trichoderma ghanense)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)或多抱木霉(Trichodermapolysporum),由含有序列號11 24中任一項記載的堿基序列的多核苷酸編碼的且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)的優(yōu)選例子為由下述多核苷酸編碼的且具有類黃酮類的糖苷化活性的蛋白質(zhì)，所述多核苷酸含有序列號11 24中任一項記載的堿基序列，與序列號6、9或25記載的喊基序列具有聞同一性。此外，在本說明書中所述的“I個或多個氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列”中的發(fā)生置換等的氨基酸的個數(shù)，只要具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有所期望的功能，無特別限定，可以為I 9個或I 4個左右，如果是置換為性質(zhì)相似的氨基酸，則可以為更多個數(shù)的置換等。用于制備與這種氨基酸序列相關(guān)的蛋白質(zhì)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員已非常熟悉。有關(guān)多核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的檢索 分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過公知的算法或程序(例如BLASTN、BLASTX, BLASTP, Clustalff)進行。使用程序時的參數(shù)，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當設(shè)定，此外也可使用各程序的默認參 數(shù)。這些分析方法的具體方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。此外，在本說明書中，對于堿基序列，所述的高同一性是指至少有60%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列同一性。此外，對于氨基酸序列，所述的高同一性是指至少有60%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進一步優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列同一性。在本發(fā)明中，可以僅使用I種糖苷酶，此外也可以組合使用多種糖苷酶。[糖供體]在本說明書中所述的“糖供體”，除特別情況之外，是指在本發(fā)明的方法中可以成為酶的底物，被水分解后可對類黃酮類提供糖殘基的糖質(zhì)?？稍诒景l(fā)明中使用的糖供體是含有麥芽三糖殘基的糖質(zhì)，其中包括麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、糊精、Y -環(huán)糊精、以及可溶性淀粉。在本說明書中所述的“糊精”，除特別情況之外，是指將淀粉水解后得到的糊精，所述的“可溶性淀粉”，除特別情況之外，是指淀粉的水解產(chǎn)物，且可在熱水中溶解。水解可采用酸、熱、酶等任一種方法。在本發(fā)明中，作為糊精例如可使用平均分子量約3，500的糊精，作為可溶性淀粉例如可使用平均分子量約100萬的可溶性淀粉。[糖苷]通過本發(fā)明提供的類黃酮類的糖苷，用下式表示，
權(quán)利要求
1.一種化合物，其為下式表示的化合物，
2.如權(quán)利要求I所述的化合物，其中，其選自下述化合物， 5-0- a -D-吡喃葡萄糖基-⑴-兒茶素； 7-0- a -D-吡喃葡萄糖基-⑴-兒茶素； 5-0- a -D-吡喃葡萄糖基-(_)-表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯； 7-0- (4-0- a -D-吡喃葡萄糖基-a -D-吡喃葡萄糖基)_㈠-表沒食子兒茶素-3_0_沒食子酸酯； 4’ -O- (4-0- a -D-吡喃葡萄糖基-a -D-吡喃葡萄糖基)-(+)-兒茶素； 4’ -O- a -D-吡喃葡萄糖基-(+)-兒茶素； 3’ -O- (4-0- a -D-吡喃葡萄糖基-a -D-吡喃葡萄糖基)_(+)_兒茶素； 3’ -O- a -D-吡喃葡萄糖基-(_)-表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯；以及3’ -O-(4-0-α-D-吡喃葡萄糖基-a -D-吡喃葡萄糖基)_(_)_表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。
3.一種食品用、醫(yī)藥用或化妝用組合物，其含有權(quán)利要求I或2所述的化合物。
4.一種飲料，其含有權(quán)利要求I或2所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供類黃酮類的糖苷的制造方法，其包括使來自木霉屬(Trichoderma)(優(yōu)選來自綠色木霉(Trichoderma viride)或來自里氏木霉(Trichoderma reesei))的具有糖苷化活性的酶劑與類黃酮和糖供體進行作用的工序。類黃酮類包括兒茶素類或其甲基化物；糖供體包括含有麥芽三糖殘基的糖質(zhì)(優(yōu)選麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖以及糊精、γ-環(huán)糊精或可溶性淀粉)。根據(jù)本發(fā)明得到的糖苷在水中的溶解性高、呈味得到改善、穩(wěn)定性提高。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的方法得到的新型兒茶素類糖苷。
文檔編號A61P9/02GK102702288SQ20121016471
公開日2012年10月3日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者中尾正宏, 深見治一, 落合美佐, 野口秋雄 申請人:三得利控股株式會社