專利名稱：包含獲得自肋軟骨的軟骨細胞的人工軟骨及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種包含獲得自助軟骨的軟骨細胞的人工軟骨及其制備方法。
背景技術：
關節(jié)軟骨損傷是ー種非常常見的影響數(shù)百萬人關節(jié)的問題。由于在這些組織中沒有血管和缺少干細胞，成熟軟骨的再生能力受到了限制。雖然擴大到軟骨下骨的缺損會激發(fā)纖維或纖維軟骨組織的形成，其還是將經(jīng)受早期退化，因為該修復組織在生物化學和生物力學方面不同于透明軟骨。已經(jīng)開發(fā)了各種用于修復關節(jié)軟骨缺損的臨床處理，但成就有限。骨髄刺激方法(精細關節(jié)整形外科和鉆孔關節(jié)整形外科)穿透軟骨下骨，并刺激骨髄內的多能干細胞把 缺損修復成為纖維組織或纖維軟骨。然而，這些方法具有如下缺點修復的纖維軟骨缺乏如同正常透明軟骨具有的生物化學和生物力學性質。更進一歩，對大面積缺損、骨關節(jié)炎和年老的病人，它們的作用也沒有被證明。對于小尺寸的缺損，骨軟骨/軟骨的移植是簡單和有效的，但是如果組織是從低重量部位向高重量部位移動，由于移植部位的非生理承重，將引起有害的壓縮。骨膜和軟骨膜移植具有引起新細胞集結的潛在益處，所述新細胞集結能夠構造軟骨，但也具有缺點透明樣修復組織有通過軟骨骨發(fā)生而鈣化的趨勢。此外，已經(jīng)發(fā)展了幾個基于細胞的利用軟骨細胞、間充質干細胞(MSC)、骨膜細胞和軟骨膜細胞的エ藝。成軟骨祖細胞例如間充質干細胞、骨膜細胞和軟骨膜細胞作為修復骨軟骨缺損的潛在細胞源變得越來越流行。然而，所述祖細胞構造關節(jié)軟骨細胞的能力是受限的，而且病人的年齡與臨床結果直接相關。更進一歩，據(jù)報道該修復透明樣組織有鈣化的趨勢。自體關節(jié)軟骨細胞移植(ACT)已經(jīng)被臨床應用于關節(jié)軟骨的小缺損，但僅有限的成就被報道。雖然關節(jié)軟骨細胞可以被輕易地通過酶消化從成熟關節(jié)軟骨中分離，但是采集和移植這兩步需要侵入關節(jié)，并且是相當昂貴的。因此自體關節(jié)軟骨細胞移植不能被應用到超過兩個的小損傷、尺寸大于IOcm2的損傷、類風濕性或免疫相關的關節(jié)炎病人和由于隨年齡增長關節(jié)軟骨退化的老年病人。此外，僅關節(jié)軟骨體積的百分之一到ニ是軟骨細胞，其中對于培養(yǎng)物，大約2000細胞/mg人關節(jié)軟骨可以被分離用于培養(yǎng)。對于自體關節(jié)軟骨細胞移植步驟，如果以類似于正常人膝關節(jié)發(fā)現(xiàn)的細胞密度植入，平均3cm2的缺損需要9X IO6細胞。事實上，由于26%的年齡小于40的有IV級軟骨軟化損傷的病人具有多處損傷，自體關節(jié)軟骨細胞移植需要更多的細胞。因此，為以類似于正常人關節(jié)軟骨所示細胞密度來充分填充缺損的體積，需要大量的軟骨細胞。在用于細胞擴充的連續(xù)單層培養(yǎng)期間，軟骨細胞趨于停止表達軟骨特異蛋白多糖和II型膠原，并轉到表達產生少量蛋白多糖的I型膠原。這種去分化是限制體外細胞擴充和自體關節(jié)軟骨細胞移植應用的主要問題。更進一歩，肋軟骨是哺乳動物體內最大的永久透明軟骨，其已經(jīng)被建議作為關節(jié)軟骨、外耳和氣管的重構中用于自體移植的可能的替代供給源。肋軟骨已經(jīng)被用于修復小關節(jié)，例如拇指指節(jié)間關節(jié)和顳下頜關節(jié)中骨軟骨的缺損。肋軟骨作為供給組織看起來與關節(jié)軟骨相比有幾個優(yōu)點。甚至在80歲或 更老的病人中也檢測到了活動的增殖軟骨細胞，而且小于60歲的病人有大量的肋軟骨可用。另外，肋軟骨是充足的，而且其容易的外科可及性允許對供體部位較小的損害。因此，如果肋軟骨具有與關節(jié)軟骨的透明軟骨相同的表現(xiàn)型，它可以被認為是用于治療各種關節(jié)軟骨紊亂病最有益的來源，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎和關節(jié)軟骨缺損。然而，迄今為止，僅進行了移植肋軟骨本身到關節(jié)軟骨部分的自體組織移植，還沒有嘗試從肋軟骨分離軟骨細胞通過組織工程方法來再生關節(jié)軟骨。此外，單獨軟骨細胞或軟骨形成細胞的移植已經(jīng)被證明在兔模型中是成功的，但由于移植細胞存活力的損失和在缺損部位固定軟骨細胞的困難，治愈率是有限的。為克服與外科步驟相關的困難和找到保持軟骨細胞于缺損部位不在關節(jié)腔內外流的方法，已經(jīng)研究了新的作為支架的不同生物材料載體方法，細胞被接種到所述支架上。理想的支架將是生物相容的、生物可吸收的或可塑的，并且提供促進新組織生長的骨架。它們還應該顯示與關節(jié)軟骨功能相容的材料和機械性能。各種生物材料，自然產生的例如基于膠原的生物材料；1和II型膠原或膠原/葡萄糖胺聚糖(GAG)復合物和合成的例如聚こ醇酸(PGA)和聚乳酸(PLLA)，或它們的復合混合物，PLGA (聚D，L-乳酸-こ醇酸共聚物)，已經(jīng)被弓I入作為軟骨修復的潛在的細胞載體物質。它們在體外和體內實驗中都顯示了，軟骨特異的細胞外基質(ECM)組分例如II型膠原和GAG在調節(jié)軟骨細胞表現(xiàn)型的表達和支持軟骨形成中起到了關鍵的作用。殼聚糖是幾丁質的堿性去こ?；a品，是去こ酰程度和分子量不同的聚-D-葡糖胺單元的族。許多研究者建議殼聚糖可能被考慮作為用于結締組織修復的結構生物材料，因為其結構類似于在細胞外基質中發(fā)現(xiàn)的GAG。殼聚糖和某些它的降解產品可以用于關節(jié)液體組分的合成，例如軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸膚質素、硫酸角質素和透明質酸(HA)。這些物質是軟骨營養(yǎng)所必需的。事實上，殼聚糖是聚陽離子的，其結構類似于透明質酸，所述透明質酸是關節(jié)軟骨細胞外基質的重要分子，對軟骨組織工程具有特別的重要性。最近已經(jīng)評論了基于殼聚糖的間質在透明軟骨的組織工程中的用途。Lahiji et al. (2000)報道了，在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)的軟骨細胞保持了分化表現(xiàn)型并表達軟骨特異的細胞外基質蛋白質例如I I型膠原和硫酸蛋白多糖。殼聚糖用于強化新軟骨形成的研究已經(jīng)掲示了，當生長在殼聚糖薄膜上時，殼聚糖具有促進軟骨細胞表現(xiàn)型維持和軟骨特異細胞外基質組分生物合成的能力(Lahiji et al. 2000) 0殼聚糖還表現(xiàn)為強化骨祖細胞分化和加強骨形成。透明質酸在許多生物進程中起重要作用，例如組織水合作用、在細胞外基質中的蛋白多糖(PG)機化和細胞分化。它還是健康關節(jié)軟骨的組成部分。Patti et al. (2001)報道了透明質酸在體外改善基質粘附能力和人軟骨細胞的增生活性。透明質酸還在關節(jié)炎早期改善臨床功能(Patti et al. ,2001)。更進一歩，對于結締組織細胞和間充質干細胞，成纖維細胞生長因子(FGF)是強促細胞分裂劑(J.Cell Biol. 100,477-485，1985)。在細胞擴充期間，成纖維細胞生長因子抑制F肌動蛋白結構的形成，以維持關節(jié)軟骨細胞的軟骨形成潛力。(Exp. Cell Res. 253,681-688，1999)。并且，成纖維細胞生長因子已知在許多有絲分裂中維持間充質干細胞的多方矣分化(multifamily differentiation)。
發(fā)明概要首先，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研究了獲得自助軟骨的軟骨細胞是否可以用作組織エ程人工軟骨的細胞源。并且，他們已經(jīng)研究了解決問題的方法，所述問題為由于在傳代期間的去分化，軟骨細胞趨于失去軟骨細胞表現(xiàn)型。更進一歩，他們還繼續(xù)評價了接種肋軟骨細胞的基于殼聚糖的支架是否可以被用于關節(jié)軟骨再生。結果，他們發(fā)現(xiàn)獲得自助軟骨的軟骨細胞與獲得自關節(jié)軟骨的軟骨細胞相比，更適合作為軟骨修復的供體細胞源。并且，通過在分化可誘導培養(yǎng)基中將它們再分化成為期望的細胞他們發(fā)現(xiàn)在傳代期間去分化的軟骨細胞顯示間充質干細胞性質，以證實它們用作細胞治療劑以及人工軟骨的能力。另外，本發(fā)明人證實加載軟骨細胞的基于殼聚糖的支架，當被移植到關節(jié)缺損時，顯示了有效的關節(jié)再生，以實現(xiàn)本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目地是提供一種包含間充質干細胞樣去分化細胞的人工軟骨及其 制備方法，所述去分化細胞通過傳代肋軟骨細胞獲得。


圖I顯示關節(jié)軟骨細胞(AC)和肋軟骨細胞(CC)體外細胞擴充能力的比較。圖2和3顯示關節(jié)軟骨細胞和肋軟骨細胞在各自的傳代中的形態(tài)變異和II型膠原的表達。圖4顯示在P7的肋軟骨細胞形態(tài)學，圖5和6顯示I、II型膠原和平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體的表達。圖7顯示在達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基-胎牛血清(DMEM-FBS)、間質干細胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)和間質干細胞生長培養(yǎng)基-成纖維細胞生長因子(MSCGM-FGF)中的細胞擴充率。圖8和9分別顯示在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中培養(yǎng)的細胞的I型膠原、II型膠原和平滑肌肌動蛋白抗體表達。圖10顯示番紅精-O對葡萄糖胺聚糖染色的結果，以確認在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中細胞培養(yǎng)物分化為軟骨細胞的情況。圖11顯示P7肋軟骨細胞在軟骨分化培養(yǎng)基中以團塊形式，再分化為軟骨的結果。圖12顯示番紅精-O對葡萄糖胺聚糖染色的結果，以證實分化為軟骨細胞。圖13顯示作為成骨分化初始標記物的細胞中的堿性磷酸酶的表達，所述細胞被誘導以分化為成骨細胞，圖14顯示作為成骨細胞分化標記物的茜紅染色的結果。圖15顯示油紅O對細胞中脂類小滴染色的結果，所述細胞被誘導分化為脂肪細胞。圖16顯示通過肋軟骨細胞加載的基于殼聚糖的支架來修復關節(jié)軟骨缺損的方法。圖17為通過MTT分析顯示在膠原-葡萄糖胺聚糖海綿(COL-GAG)、殼聚糖海綿(CS)和透明質酸包被的殼聚糖海綿(CS-HA)中軟骨細胞生長率的比較。圖18顯示前膠原I型C-肽(PIP)和GAG的測量結果。
圖19顯示蘇木精和伊紅(H & E)染色后的細胞形態(tài)。圖20顯示通過番紅精-O染色和固綠染色顯示葡萄糖胺聚糖的累積量。圖21和22分別顯示對I型膠原和II型膠原免 疫染色的結果。圖23顯示關節(jié)軟骨缺損的修復組織的總體外觀。圖24到26顯示光學顯微鏡下關節(jié)軟骨缺損的修復組織。圖27顯示對在關節(jié)軟骨缺損的修復組織中葡萄糖胺聚糖分布，用番紅精-O染色的結果。圖28顯示對關節(jié)軟骨缺損的修復組織中的I型和II型膠原，用免疫染色的結果。圖29是人工軟骨的目視圖片，所述人工軟骨來自于在軟骨形成培養(yǎng)基中加載于基于殼聚糖的支架上的間充質干細胞樣去分化的細胞。圖30顯示對在軟骨形成培養(yǎng)基中再分化的軟骨細胞內的葡萄糖胺聚糖，用番紅精-O染色的結果。圖31是兔關節(jié)軟骨缺損在移植間充質干細胞樣去分化的加載于基于殼聚糖的支架上的細胞6周后的目視圖片。

發(fā)明內容
第一，本發(fā)明涉及ー種包含間充質干細胞樣去分化細胞的人工軟骨，所述去分化細胞通過傳代肋軟骨細胞獲得。優(yōu)選，肋軟骨細胞在MSCGM中傳代，特別是，包含成纖維細胞生長因子(FGF)的MSCGM更有利于細胞擴充及分化為軟骨。第二、本發(fā)明涉及ー種包含再分化軟骨細胞的人工軟骨，所述再分化軟骨細胞通過在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞樣去分化細胞獲得。在ー個具體方案中，間充質干細胞樣去分化細胞是在軟骨形成培養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)的。第三，本發(fā)明涉及ー種人工軟骨，其中軟骨細胞被加載到基于殼聚糖的支架上。所述基于殼聚糖的支架優(yōu)選選自殼聚糖海綿；包含轉化生長因子-β (TGF-β)的殼聚糖海綿；透明質酸(HA)包衣的殼聚糖海綿；硫酸軟骨素包衣的殼聚糖海綿和殼聚糖-膠原復合海綿。更優(yōu)選，基于殼聚糖的支架是透明質酸包衣的殼聚糖海綿或透明質酸包衣的殼聚糖-膠原復合海綿。第四，本發(fā)明涉及一種制備人工軟骨的方法，包括傳代肋軟骨細胞以獲得間充質干細胞樣去分化細胞的步驟。在ー個具體方案中，將肋軟骨細胞在MSCGM或包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代。在另ー個具體方案中，通過傳代肋軟骨細胞獲得的間充質干細胞樣去分化細胞通過在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)來再分化，優(yōu)選通過在軟骨形成培養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)。在另ー個具體方案中，該方法包括加載間充質干細胞樣去分化細胞到基于殼聚糖的支架的步驟。第五，本發(fā)明涉及ー種包含間充質干細胞樣去分化細胞的細胞治療劑，所述去分化細胞通過傳代肋軟骨細胞獲得。在ー個具體方案中，該細胞治療劑包含再分化軟骨細胞，所述再分化軟骨細胞通過在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞樣去分化細胞獲得。在另ー個具體方案中，該細胞治療劑包含成骨細胞，所述成骨細胞通過在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞樣去分化細胞獲得。在另ー個具體方案中，該細胞治療劑包含脂肪細胞，所述脂肪細胞通過在脂肪形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞樣去分化細胞獲得。
下面，本發(fā)明被更詳細的解釋。在自體關節(jié)軟骨細胞移植中對于關節(jié)軟骨修復的主要技術限制是不在膝關節(jié)承受重量的供體軟骨具有低的細胞生長量，和按照在體外細胞擴充期間的軟骨細胞去分化，難以獲得合適數(shù)量的軟骨細胞用于覆蓋軟骨缺損。另外，自體關節(jié)軟骨細胞移植應用的成功受到患者年齡和供體部位有限的限制。因此，在本發(fā)明中，首次評估肋軟骨是否可以用作自體關節(jié)軟骨細胞移植的供體細胞源，所述肋軟骨在其存在期間保持較長的生長量而且在體內有較大的供體組織。首先，基于原始細胞產量、細胞擴充率和去分化，評價分離自助軟骨的軟骨細胞是否可以用作組織工程關節(jié)軟骨的潛在細胞源。特別的，在本發(fā)明中，將獲得自助軟骨的軟骨細胞的原始細胞產量和在單層培養(yǎng)中的細胞擴充率與從關節(jié)軟骨獲得的軟骨細胞進行比較。另外，通過細胞形態(tài)和II型膠原的表達來評估體外細胞培養(yǎng)期間的去分化率。結果，肋軟骨的原始細胞產量是關節(jié)軟骨的2. 6倍。在體外細胞培養(yǎng)期間，肋軟骨細胞(CC)與關節(jié)軟骨細胞(AC)相比生長更快，而且細胞擴充至P4的速度大約是關節(jié)軟骨 的3倍。在連續(xù)培養(yǎng)期間，關節(jié)軟骨細胞和肋軟骨細胞包逐漸地失去它們的軟骨細胞表現(xiàn)型，相反轉變?yōu)槌衫w維細胞樣細胞，而且II型膠原的表達減少。肋軟骨細胞與關節(jié)軟骨細胞相比它們原始表現(xiàn)型丟失得更快。比較相同的傳代數(shù)，肋軟骨細胞與關節(jié)軟骨細胞相比去分化更快。由來自相同兔的關節(jié)軟骨細胞和肋軟骨細胞的比較代表的首次培養(yǎng)的結果顯示肋軟骨能用作骨關節(jié)炎修復的潛在細胞源，所述第一培養(yǎng)物的結果具有按照體外細胞擴充傳代的去分化和生長分布圖。在進ー步研究中，本發(fā)明人證實通過傳代肋軟骨獲得的去分化細胞具有間充質干細胞的性質。間充質干細胞是軟骨形成祖細胞，意味著可以作為用于修復骨軟骨缺損的潛在細胞源。因此，在本發(fā)明中，首先公開了獲得自助軟骨細胞的間充質干細胞樣去分化細胞是軟骨形成祖細胞，所述軟骨形成祖細胞能被用于骨軟骨缺損的修復。根據(jù)本發(fā)明的間充質干細胞樣去分化細胞能分化為成骨細胞和脂肪細胞以及軟骨細胞。因此，在本發(fā)明中，術語“間充質干細胞樣去分化細胞”指通過傳代去分化的和具有分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等等的潛能的細胞，如間充質干細胞。也就是說，這個術語指多能細胞。在進ー步的研究中，本發(fā)明人公開當肋軟骨細胞特別是在包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代時，細胞擴充率是顯著的，向軟骨細胞的分化是優(yōu)秀的?？梢灶A料，如果向其中添加成纖維細胞生長因子，包含DMEM的正常細胞培養(yǎng)基可以具有相同的結果。此外，在本發(fā)明中，作為用于加載軟骨細胞的支架，基于殼聚糖的支架，特別是海綿形態(tài)的透明質酸包衣的殼聚糖支架被用于評價被加載到透明質酸包衣的殼聚糖復合支架上的培養(yǎng)自體肋軟骨細胞，在修復動物模型中承受重量位置的全層關節(jié)軟骨缺損的作用。兔膝模型已經(jīng)被廣泛應用于軟骨修復的評估，4至6個月齡的兔髕骨凹槽中全層3mm直徑的軟骨缺損在6至8周之內自然痊愈。因此，需要這個時期掲示表面上愈合軟骨的大多數(shù)退化故障。在如下的設計動物模型試驗中(4_直徑骨軟骨的缺損)，可以表明，根據(jù)本發(fā)明在基于殼聚糖的支架內的自體肋軟骨細胞非常有效的修復了在承受重量位點的全層關節(jié)軟骨缺損。
以下，本發(fā)明將參考下述實施例被更詳細的描述，但本發(fā)明的范圍將不會被解釋為借此以任何方式限制。
具體實施例方式實施例實施例I :評價肋軟骨細胞是否可以作為修復關節(jié)軟骨的供體細胞源材料和方法軟骨細胞的分離從3至4個月大的新西蘭白兔中獲得關節(jié)軟骨和肋軟骨，然后稱重。為了采集肋軟骨，動物被通過靜脈注射甲苯噻嗪鹽酸鹽(2mg/kg體重,Rompun,Bayer,Korea)和氯胺酮鹽酸鹽(6-10mg/kg體重，ketalar, Yuhan Co. , Korea)的混合物麻酔。將胸部附近的皮膚刮凈，用酒精清洗，并用聚維酮碘溶液備皮。打開右胸的背側，暴露第9和第10肋軟骨，在移除軟的粘附組織之后，稱重肋軟骨。這些軟骨被切碎為1-2_3的塊，并在D-PBS (Dulbecco' s 磷酸鹽緩沖鹽水；Jeil Biotech services Inc. , Taegu, Korea)中漂洗3次。漂洗后，將切碎的軟骨在多酶雞尾酒溶液37°C和5% CO2條件下消化整夜，所述多酶雞尾酒溶液包括膠原酶D(2mg/ml,Roche Diagnostic GmbH,Germany),透明質酸酶(lmg/ml,Roche),和脫氧核糖核酸酶(O. 75mg/ml, Roche)。將所述溶液通過53 μ m的尼龍網(wǎng)孔,分離的細胞用補充有10%胎牛血清(FBS ；Hyclone technologies, U. S. A.)和I %青霉素/鏈霉素/兩性霉素B雞尾酒(Gibco)的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium ;Gibco Life Technologies,Grand Island, NY, U. S. A.)洗滌2次，活細胞在血球計上基于錐蟲藍排除法計數(shù)。細胞以5 X IO5細胞/IOOmm直徑平皿的細胞密度接種，每隔一天更換培養(yǎng)基，每次更換時添加新配制的50 μ g/ml的L-抗壞血酸(Sigma, St. Louis, MO, U. S. A.)。匯合的原生細胞傳代培養(yǎng)直到P4。MTT 分析將各自傳代的關節(jié)軟骨細胞和肋軟骨細胞以I X IO5細胞每孔的細胞密度種植到6孔培養(yǎng)平板上培養(yǎng)5天。細胞的生長根據(jù)MTT分析測定(Mosman T. Rapid colormetricassay for cellular growth and survival， application to proliferation andcytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 1983 ；65 :55-63) 為了以光密度(0. D.)校準細胞數(shù)目，在I到8X105細胞范圍內繪制標準曲線，將光密度被轉化為細胞數(shù)目。II型膠原的免疫熒光染色對于免疫熒光染色，將各自傳代的軟骨細胞鋪板在蓋玻片上，培養(yǎng)2天，用3.7%福爾馬林磷酸鹽緩沖鹽水固定10分鐘，并用O. 2% Triton X-100磷酸鹽緩沖鹽水透化。用20%正常山羊血清培養(yǎng)透化細胞以阻斷非特異性反應并以單克隆抗II型膠原抗體(monoclonal anti-mouse antibody ；Chemicon Internationa丄 Inc. , Temecula, CA,U.S.A.)作為初級抗體。以標記了異硫氰酸熒光素(FITC)的山羊抗鼠IgG結合物(VectorLab.，Burlingame, CA，U. S. A.)作為第二抗體，蓋玻片用4'，6 ニ脒基-2-苯吲哚(DAPI ；I g/ml ；Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO, U. S. A.)培養(yǎng) 5 分鐘用于核染色。細胞在突光顯微鏡下觀察(Olympus Optical Co. , Japan)。統(tǒng)計用不配對t檢驗進行統(tǒng)計分析，以確定各試驗中的變量是否具有顯著性差異(P<O. 05)。結果分離自關節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞的原始細胞產量和細胞擴充率的比較為了尋找成人體內適合自體軟骨細胞移植的供體部位，對分離自關節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞產量進行比較(表I)。表I.分離自關節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞原始細胞產量的比較
權利要求
1.ー種人工軟骨，包含通過肋軟骨細胞傳代獲得的間充質干細胞(MSC)樣去分化細胞。
2.如權利要求I所述的人工軟骨，其中所述間充質干細胞樣去分化細胞是通過在MSCGM或包含成纖維細胞生長因子(FGF)的MSCGM中傳代肋軟骨細胞獲得的。
3.如權利要求I或2所述的人工軟骨，其包含通過在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞獲得的再分化軟骨細胞。
4.如權利要求3所述的人工軟骨，其中所述再分化軟骨細胞通過在軟骨形成培養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞獲得。
5.如權利要求3所述的人工軟骨，其中所述軟骨細胞被加載到基于殼聚糖的支架上。
6.如權利要求5所述的人工軟骨，其中所述基于殼聚糖的支架選自殼聚糖海綿；包含轉化生長因子-β (TGF-β)的殼聚糖海綿；透明質酸(HA)包衣的殼聚糖海綿；硫酸軟骨素包衣的殼聚糖海綿；和殼聚糖膠原復合海綿。
7.ー種用于制備人工軟骨的方法，包括傳代肋軟骨細胞以獲得間充質干細胞樣去分化細胞的步驟。
8.如權利要求7所述的方法，其中將所述肋軟骨細胞在MSCGM或包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代。
9.如權利要求7或8所述的方法，其包含在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞以獲得再分化軟骨細胞的步驟。
10.如權利要求9所述的方法，其包含在軟骨形成培養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞以獲得再分化軟骨細胞的步驟。
11.如權利要求7或8所述的方法，其包含加載所述間充質干細胞樣去分化細胞到基于殼聚糖的支架上的步驟。
12.—種細胞治療劑，包含通過傳代肋軟骨細胞獲得的間充質干細胞樣去分化細胞。
13.如權利要求12所述的細胞治療劑，其包含通過在軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞獲得的再分化軟骨細胞。
14.如權利要求12所述的細胞治療劑，其包含通過在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞獲得的成骨細胞。
15.如權利要求12所述的細胞治療劑，其包含通過在脂肪形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質干細胞樣去分化細胞獲得的脂肪細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含間充質干細胞(MSC)樣去分化細胞的人工軟骨及其制備方法，所述去分化細胞通過傳代培養(yǎng)肋軟骨細胞獲得。
文檔編號A61L27/38GK102688524SQ20121014561
公開日2012年9月26日 申請日期2006年10月31日 優(yōu)先權日2005年10月31日
發(fā)明者孫英淑, 李定宣, 李殷坰, 李珍妍 申請人:慶熙大學校產學協(xié)力團, 株式會社現(xiàn)代組織工學, 韓國原子力醫(yī)學院