專利名稱：熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
熊果酸(Ursolic Acid)，別名烏索酸，烏蘇酸，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗?jié)儭⒔档脱堑榷喾N生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料。近年來(lái)在Wang等人發(fā)表的Ursolic Acid Inhibits Proliferation and Induces Apopto·sis of Cancer Cells InVitro and In Vivo。J Biomed Biotechnol. 2011;2011:419343. Ursolic acid inhibitsproliferation and induces apoptosis of HT—29 colon cancer cells by inhibitingthe EGFR/MAPK pathway. J Zhejiang Univ Sci B. 2009; 10 (9) :668 -674.的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中顯示熊果酸對(duì)多種腫瘤有抑制效果，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是熊果酸由于其極差的水溶性使其在應(yīng)用和開(kāi)發(fā)上收到了極大的限制。因此，有相關(guān)人員采用納米負(fù)載的方法來(lái)制備熊果酸載藥微球。如中國(guó)專利號(hào)ZL02147712. 4公布了一種熊果酸氰基丙烯酸酯納米粒凍干粉針劑的制備方法。該熊果酸載藥納米粒能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但其負(fù)載熊果酸的高分子材料為氰基丙烯酸酯，安全性難以保證。且制備過(guò)程工藝較復(fù)雜，需要精確控制PH值及溫度等指標(biāo)。中國(guó)專利號(hào)ZL02147713. 2公開(kāi)了一種熊果酸聚乳酸納米粒凍干粉針劑的制備方法。該納米粒具有抑制和殺傷肝癌細(xì)胞的效果。但由聚乳酸等形成的納米微球穩(wěn)定性不夠理想，體外環(huán)境以及體內(nèi)環(huán)境中容易降解。此外、其制備過(guò)程工藝也較復(fù)雜，需要精確控制PH值及溫度等指標(biāo)。同時(shí)，該方法所制備出的微粒粒徑較大，在200nm以上，靜脈注射后容易形成栓塞，將限制其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。中國(guó)專利號(hào)ZL02147711. 6公開(kāi)了一種熊果酸豆磷脂納米粒凍干粉針劑的制備方法。該納米粒能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但其所用制備工藝仍需嚴(yán)格的條件控制，成本較高，且所制備出的微粒粒徑較大，在200nm以上，靜脈注射后容易形成栓塞，將限制其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1857273A公開(kāi)了一種熊果酸脂微球制劑及其制備方法。但該方法所制備的納米微球需要經(jīng)過(guò)溶解、加熱、混勻、乳化、冷卻、灌裝等多步驟，成本較高，且得到的納米微球粒徑在300nm以上，靜脈注射后容易形成栓塞，將限制其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域中亟待解決的重大難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球及其制備方法，本發(fā)明制得的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球不僅可以達(dá)到長(zhǎng)時(shí)的緩釋效果，且具有強(qiáng)于裸藥的抗腫瘤效果。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便可靠，能夠保證本發(fā)明產(chǎn)品的質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明提出的一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球，其特征是由熊果酸和載藥材料混合組成，載藥材料為聚己內(nèi)酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物。聚己內(nèi)酯分子量為200(Tl00000 ;聚己內(nèi)酯分子量為200(Tl00000 ;聚乳酸分子量為2000^100000 ;聚羥基乙酸分子量為2000 100000 ;聚乙二醇分子量為1000 20000。由5-35%熊果酸和65-95%載藥材料混合組成。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方案，其特征是按重量配比的組份為熊果酸載藥材料為I :1-8。更優(yōu)的重量配比，熊果酸載藥材料為I :1. 5-5。本發(fā)明的技術(shù)方案的改進(jìn)還包括在前述技術(shù)方案或者優(yōu)選方案的基礎(chǔ)上，由熊果酸和載藥材料組成的納米載藥微球與外加的凍干保護(hù)劑混合組成，其中，凍干保護(hù)劑為 嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。本發(fā)明另一種技術(shù)方案的優(yōu)選方案,其特征是按重量配比的組份為由熊果酸和載藥材料組成的納米載藥微球混合藥20-30%和外加的凍干保護(hù)劑70-80%混合組成。根據(jù)本發(fā)明所述的一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球的制備方法，其特征在于步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取5-35%熊果酸和65-95%載藥材料(包括優(yōu)選的二種原料的配比)，其中，載藥材料為聚己內(nèi)酯或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的熊果酸和載藥材料(二親嵌段共聚物)二種原料組分溶于一定量的乙醇等醇類、丙酮、四氫呋喃、氮、氮-二甲基甲酰胺有機(jī)溶劑中，其中，按組分的重量配比，原料組分1_20%、有機(jī)溶劑80-99% ；步驟三，稀釋將步驟二得到的有機(jī)溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中，其中有機(jī)溶液與蒸餾水的體積比為，有機(jī)溶液蒸餾水=1:4-5 ；步驟四，純化將步驟三得到的有機(jī)溶液稀釋液，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，或者用透析法除去有機(jī)溶劑；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去有機(jī)溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑為SO-IOOnm抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，干燥或凍干將步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發(fā)，即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品；或者在步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液中，加入凍干保護(hù)劑嵌段式聚醚(PluronicF-68)，冷凍干燥后即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品，其中，按組分的重量配比，該溶液凍干成品中的熊果酸納米載藥微球混合藥20-30%、凍干保護(hù)劑70-80%。本發(fā)明的作用原理是第一，利用具有可生物降解特性的醫(yī)用聚己內(nèi)酯與聚乙二醇等合成的二親嵌段共聚物作為負(fù)載熊果酸的載藥材料，聚己內(nèi)脂作為疏水端、聚乙二醇作為親水端，兩者在水相中能夠自動(dòng)合成二嵌段共聚物聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)的納米載藥微球。第二，聚己內(nèi)脂的疏水性能夠使具有脂溶性的熊果酸更容易被載入納米載藥微球，而聚乙二醇的親水性則使納米載藥微球在患者體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間大大延長(zhǎng)，更容易達(dá)到對(duì)腫瘤組織發(fā)揮藥效，同時(shí)該熊果酸納米載藥微球具有單藥所不能比擬的低毒副作用，為在患者使用中增加藥物的使用劑量而又不引起過(guò)高的毒性反應(yīng)提供了保證。第四，該熊果酸納米載藥微球能夠通過(guò)腫瘤細(xì)胞的包吞作用被攝入細(xì)胞內(nèi)，這種進(jìn)入方式效率遠(yuǎn)大于小分子裸藥逐漸滲入方式的效率，從而使熊果酸能夠迅速在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到較高的藥物濃度，產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。本發(fā)明的有益效果是第一，本發(fā)明選用聚己內(nèi)脂或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二嵌段共聚物作為藥物載體制備了負(fù)載熊果酸的納米級(jí)載藥微球。聚己內(nèi)脂或聚乳酸或聚羥基乙酸作為疏水端，聚乙二醇作為親水端在水中自組裝成較小粒徑的納米粒子。聚己內(nèi)脂或聚乳酸或聚羥基乙酸與聚乙二醇均為美國(guó)FDA批準(zhǔn)醫(yī)用的材料，具有可生物降解性的特點(diǎn)。疏水性的聚己內(nèi)脂使脂溶性的藥物更容易被載入微球，而聚乙二醇的親水性則使微球在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間大大延長(zhǎng)。因此，聚乙二醇修飾的微球能夠減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)于微球的攝取從而使微球在體內(nèi)能存留更長(zhǎng)的時(shí)間，更容易達(dá)到腫瘤組織發(fā)揮藥效；同時(shí)藥物被高分子材料負(fù)載成為載藥納米粒子具有裸藥所不能比擬的低毒性，這為在以后的使用中增加藥物的使用劑量而不引起毒性反應(yīng)提供了依據(jù)。第二，本發(fā)明的熊果酸納米 載藥微球的粒徑小于lOOnm，不會(huì)形成給藥栓塞，不僅可用于患者體外治療，而且還可用于患者的靜脈給藥或者腹腔給藥，能夠在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的循環(huán)，從而達(dá)到更加優(yōu)越的抗腫瘤藥效。第三，本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球的制備方法簡(jiǎn)便易行，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I是本發(fā)明提出的一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品制備方法的流程示意圖。圖2是本發(fā)明提出的一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品制備方法的流程示意圖。圖3是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球在凍干后復(fù)溶的電子顯微鏡影像照片。圖4是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球在室溫條件下的體外釋放曲線。圖5是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球?qū)θ宋赴㎝KN45以及MKN28細(xì)胞的體外協(xié)同抑瘤效果評(píng)價(jià)。圖6是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球在小鼠肝癌H22細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤效果評(píng)價(jià)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。結(jié)合附圖I和圖2，制備本發(fā)明提出的一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品或者一種抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品，所采用的熊果酸和載藥材料以及溶齊U、凍干保護(hù)劑等全部原料均為市售醫(yī)藥原料，符合中華人民共和國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。其中載藥材料為聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)合成的二親嵌段共聚物，不論采用所述的何種載藥材料都能夠達(dá)到本發(fā)明所述的載藥效果。本發(fā)明的原料規(guī)格如下I、熊果酸，2、載藥材料
①聚己內(nèi)酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL);經(jīng)過(guò)核磁(NMR)和凝膠濾過(guò)色譜(GPC)驗(yàn)證。系聚合后形成的納米載藥微球IOOnm最可幾分布。②聚乳酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA);經(jīng)過(guò)核磁(NMR)和凝膠濾過(guò)色譜(GPC)驗(yàn)證。系聚合后形成的納米載藥微球。③聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物為聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA);經(jīng)過(guò)核磁(NMR)和凝膠濾過(guò)色譜(GPC)驗(yàn)證。系聚合后形成的納米載藥微球。3、溶劑溶劑的重量一般多于熊果酸和載藥材料等原材料的重量；①丙酮為色譜純；也可以采用乙醇、正丁醇、異丙醇、四氫呋喃、氮、氮-二甲基甲 酰胺等分析純級(jí)以上的有機(jī)溶劑；②蒸餾水為色譜純；蒸餾水的體積一般是溶劑體積的2倍以上；4、凍干保護(hù)劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，又名Lutrol F68 (泊洛沙姆188)，分子式(C3H60C2H40)X ;分子量8350 ;級(jí)別醫(yī)用級(jí)。結(jié)合附圖1，以制備IOOOg抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品為例，本發(fā)明的具體實(shí)施方式
如下。實(shí)施例I :步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取60g熊果酸以及940g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內(nèi)酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG 分子量 4000、PCL 分子量 20000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的60g熊果酸和940g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分80%、丙酮溶劑20%)；步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:4)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑82. Inm的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發(fā)，即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品。實(shí)施例2 步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取200g熊果酸以及SOOg載藥材料，其中，載藥材料為聚乳酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，其中mPEG 分子量 4000、PLA 分子量 40000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的200g熊果酸和800g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分65%、丙酮溶劑35%);步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:4. 5)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑78. 3nm的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發(fā)，即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品。其它條件不變，改成乙醇或異丙醇作為溶劑能得到相同的結(jié)果。
實(shí)施例3步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取360g熊果酸以及640g載藥材料，其中，載藥材料為聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)，其中mPEG 分子量 4000、PLGA 分子量 36000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的360g熊果酸和640g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分50%、丙酮溶劑50%);步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:5)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑74. 6nm的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，干燥將步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發(fā)，即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品。結(jié)合附圖2，以制備7000g抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品為例，本發(fā)明的具體實(shí)施例如下。實(shí)施例4步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取400g熊果酸以及1600g載藥材料，其中，載藥材料為聚己內(nèi)酯與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG 分子量 4000、PCL 分子量 20000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的400g熊果酸以及1600g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分80%、丙酮溶劑20%)；步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:4)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑78. 4nm的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護(hù)劑嵌段式聚醚(Pluronic F-68) 5000g,冷凍干燥后即制得熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品。實(shí)施例5步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取200g熊果酸以及S OOg載藥材料，其中，載藥材料為聚乳酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)，其中mPEG 分子量 4000、PLA 分子量 40000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的200g熊果酸和800g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分65%、丙酮溶劑35%)；步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:4. 5)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑777. 5nm的熊果酸納米載藥微球溶液；步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護(hù)劑嵌段式聚醚(Pluronic F-68) 6000g,冷凍干燥后即制得熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品。實(shí)施例6步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取200g熊果酸以及800g載藥材料，其中，載藥材料為聚羥基乙酸與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)，其中mPEG 分子量 4000、PLGA 分子量 36000 ；步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的200g熊果酸和800g載藥材料等原料組分溶于一定量的丙酮溶劑中(按組分的重量配比，原料組分50%、丙酮溶劑50%);步驟三，稀釋將步驟二得到的丙酮溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中(丙酮溶液與蒸餾水的體積比為1:5)，即得到淡藍(lán)色的熊果酸微球丙酮及水的混合溶液；步驟四，純化將步驟三得到的丙酮溶液稀釋液裝入透析袋中(透析袋c(diǎn)ut-off值為12000)，采用透析法將該溶液中的丙酮溶劑全部除去；步驟五，過(guò)濾將步驟四得到的除去丙酮溶劑的稀釋液，用220nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑80. 3nm的含紫杉醇(Ptx)與白藜蘆醇(Res)熊果酸的納米載藥微球溶液；步驟六，凍干將步驟五得到的納米載藥微球溶液中，加入凍干保護(hù)劑嵌段式聚醚(Pluronic F-68) 6000g,冷凍干燥后即制得熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品。在其它相同條件下，溶劑換成四氫呋喃或氮、氮-二甲基甲酰胺有機(jī)溶劑能夠得到相同的結(jié)果。本發(fā)明經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，取得了滿意的應(yīng)用效果。其應(yīng)用效果圖示如下圖3是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球成品凍干后復(fù)溶的電子顯微鏡影像照片。圖3中可見(jiàn)該納米載藥微球?yàn)檩^為規(guī)則的圓形，其粒徑較為均勻，大小在lOOnm，且在凍干后具有良好的復(fù)溶效果。圖4是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球在室溫條件下的體外釋放曲線。圖4中可見(jiàn)熊果酸表現(xiàn)為緩慢釋放的特征，這樣使得該納米載藥微球在患者體內(nèi)發(fā)揮療效時(shí)可以通過(guò)最初的突釋來(lái)達(dá)到一個(gè)較高的血藥濃度，而隨后的長(zhǎng)時(shí)釋放則為保持一定的有效濃度提供了保證，從而達(dá)到了長(zhǎng)效緩釋的抗腫瘤效果。圖5為人胃癌MKN-45細(xì)胞及鼠肝癌H22細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng) 液中培養(yǎng)。采用MTT法測(cè)定IC50值，具體如下細(xì)胞生長(zhǎng)在T-75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為1640CpH = 7. 4，含胎牛血清10%，青霉素，鏈霉素)，在37°C，含5%C02培養(yǎng)箱中全濕度培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，接種密度5000/孔，每孔200ii L，接種24小時(shí)后吸出培液150 u L，加入熊果酸裸藥或熊果酸載藥納米微球(凍干粉復(fù)溶后)，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，濃度分別為:10、20、30、40、50、601^，每孔200 y L，于給藥48h后加四甲偶氮唑藍(lán)(MTT)，4h后吸干孔內(nèi)溶液，加入DMSO 1501^，振蕩溶解，于54011111下測(cè)吸光值。抑制率按照公式3計(jì)算。1% = (I - At/Ac) X 100%其中I為抑制率，At為給藥組的平均吸光度，Ac為陰性對(duì)照組平均吸光度。圖5可見(jiàn)在兩株腫瘤細(xì)胞上熊果酸納米載藥微球均顯示了比熊果酸裸藥更強(qiáng)的抗腫瘤效果。圖6是本發(fā)明的熊果酸納米載藥微球在小鼠肝癌H22細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤效果評(píng)價(jià)。將鼠源性H22肝癌細(xì)胞系保種于ICR小鼠腹腔內(nèi)，待7 — 9日腹水生成后取腹水，顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4 6X IO6個(gè)/ml，分別接種于ICR小鼠(左側(cè)腋下，每只0. 2ml)。細(xì)胞種植后7-8天，選擇腫瘤體積IOOmm3左右的小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將符合條件的小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。各組藥物如圖6所示，其中，熊果酸的劑量為20mg/kg，熊果酸微球中熊果酸的劑量也為20mg/kg。各組均瘤體內(nèi)注射給藥，隔天測(cè)一次腫瘤長(zhǎng)徑a和垂直于a的最大橫徑b,計(jì)算瘤體積并且繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。瘤體積=l/2*a*b2。每日觀察各組動(dòng)物的飲食、活動(dòng)、皮色等方面的變化，每2天測(cè)量一次小鼠體重，觀察體重變化情況。圖6中可見(jiàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示等劑量的熊果酸納米載藥微球產(chǎn)生了顯著優(yōu)于熊果酸裸藥的抑瘤效果。
權(quán)利要求
1.熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，其特征是熊果酸納米載藥微球包含熊果酸和載藥材料混合，載藥材料為聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚輕基乙酸之一與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物，即聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA) ；5-35wt%熊果酸和65_95wt%載藥材料混合組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，其特征是載藥材料中聚己內(nèi)酯分子量為200(Tl00000 ;聚己內(nèi)酯分子量為200(Tl00000 ;聚乳酸分子量為2000^100000 ;聚羥基乙酸分子量為2000 100000 ;聚乙二醇分子量為1000 20000。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，其特征是熊果酸載藥材料的重量比為1:1-8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，其特征是熊果酸載藥材料的重量比為I :1. 5-5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，其特征是熊果酸納米載藥微球外加的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為嵌段式聚醚(Pluronic F-68)；按重量配比的組份為熊果酸和載藥材料組成的納米載藥微球混合藥20-30%，凍干保護(hù)劑70-80%o
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的熊果酸納米載藥微球的制備方法，其特征在于 步驟一，配藥按原料組分的重量配比分別稱取5-35%熊果酸和65-95%載藥材料，其中，載藥材料為聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚羥基乙酸之一與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)、聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)； 步驟二，溶藥在常溫條件下，將步驟一中稱取的熊果酸和二親嵌段共聚物載藥材料二種原料組分溶于乙醇等醇類、丙酮、四氫呋喃、氮、氮-二甲基甲酰胺有機(jī)溶劑中，按組分的重量配比，原料組分1_20%、有機(jī)溶劑80-99% ； 步驟三，稀釋將步驟二得到的有機(jī)溶液在攪拌條件下緩慢滴加入一定量的蒸餾水中，其中有機(jī)溶液與蒸餾水的體積比為，有機(jī)溶液蒸餾水=1:4-5 ； 步驟四，純化將步驟三得到的有機(jī)溶液稀釋液，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，或者用透析法除去有機(jī)溶劑； 步驟五，過(guò)濾將步驟四所述的除去有機(jī)溶劑的稀釋液，用220 nm的微孔濾膜過(guò)濾以除去未包裹的熊果酸和載藥材料，所得到的淡藍(lán)色分散液即為粒徑為80-100 nm抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液； 步驟六，干燥或凍干將步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全揮發(fā)，即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球成品；或者在步驟五得到的抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液中，加入凍干保護(hù)劑嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，冷凍干燥后即制得抗腫瘤的熊果酸納米載藥微球溶液凍干成品，其中，按組分的重量配比，該溶液凍干成品中的熊果酸納米載藥微球混合藥20-30%、凍干保護(hù)劑70-80%。
全文摘要
熊果酸納米載藥微球用于治療腫瘤的用途，熊果酸納米載藥微球包含熊果酸和載藥材料混合，載藥材料為聚己內(nèi)酯、聚乳酸或聚羥基乙酸之一與聚乙二醇合成的二親嵌段共聚物，即聚己內(nèi)脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羥基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；5-35wt%熊果酸和65-95wt%載藥材料混合組成。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102670525SQ20121014087
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者張皓, 李曉林, 鄭東輝 申請(qǐng)人:李曉林