專利名稱：一種適用于肺癌分子影像診斷的小分子肽探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及適用于肺癌分子影像診斷的特異性小分子肽探針及其制備方法，以及其在制備肺癌影像診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌已成為我國(guó)人群特別是城市居民中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，目前肺癌高死亡率的主要原因是因?yàn)?0%以上的肺癌就診時(shí)已屬晚期，失去了最佳的治療時(shí)機(jī)，而I期肺癌患者的5年生存率可達(dá)80%以上。肺癌的早期診斷將有助于提高肺癌患者生存率和降低死亡率。臨床肺癌診斷的主要手段目前仍是影像技術(shù)，隨著現(xiàn)代影像檢查設(shè)備和技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，明顯提高了肺癌早期診斷的陽(yáng)性率，但無(wú)論CT、PET，還是MRI技術(shù)，對(duì)于肺癌早期診斷的特異性和敏感性均有待于提高。分子影像學(xué)的創(chuàng)建為肺癌高特異性和敏感性診斷方法的建立提供了一個(gè)非常重要的研究平臺(tái)，分子探針是分子影像技術(shù)的關(guān)鍵因素，也是分子影像學(xué)研究的先決條件。目前研究最為廣泛的分子探針根據(jù)所用影像學(xué)技術(shù)的不同，可分為(1)核醫(yī)學(xué)探針。同位素標(biāo)記ανβ3整合素和VEGF的分子探針在動(dòng)物模型中顯示了令人滿意的腫瘤血管成像。(2) MRI探針。Gd-DTPA標(biāo)記ανβ3整合素單克隆抗體或小分子肽RGD，MRI顯示兔或裸鼠動(dòng)物模型腫瘤血管，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記α νβ 3整合素單克隆抗體能顯著提高M(jìn)RI的敏感性。(3)光學(xué)探針。由于光學(xué)成像技術(shù)的穿透力有限，光學(xué)探針僅用于小動(dòng)物模型的研究。小分子探針相對(duì)于大分子抗體探針，具有分子量小，組織穿透性好，更易到達(dá)靶細(xì)胞，無(wú)免疫源性，可大批量合成，制作成本低及易于標(biāo)記等特點(diǎn)，因此，小分子探針較大分子探針有更好的臨床應(yīng)用前景。目前已應(yīng)用于臨床影像研究的小分子探針有(I)生長(zhǎng)抑素探針適用用于胃腸道和支氣管神經(jīng)內(nèi)分泌癌、垂體腺瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤等診斷；(2) CCK探針用于甲狀腺髓樣癌診斷；(3)蛙皮素探針適用于乳腺癌和前列腺癌的診斷；(4) RGD探針適用于各種實(shí)體腫瘤的血管顯像。迄今為止國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)肺癌特異性分子探針的成功研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的小分子肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種適用于肺癌分子影像診斷的特異性小分子肽探針及其制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述小分子肽探針在制備肺癌影像診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種小分子肽，其為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種。所述的小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。一種小分子肽探針，由放射性同位素標(biāo)記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種。所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨 酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。所述放射性同位素為99mTc、mIn、18F-FDG、68Ga、64Cu中的任一種。一種小分子肽探針的制備方法，包括如下步驟
(1)將小分子肽與螯合劑S-acetyI-MAG3(巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯(lián)后得到小分子肽-MAG3復(fù)合物；
(2)用放射性同位素標(biāo)記小分子肽-MAG3復(fù)合物得到小分子肽探針；
所述小分子肽為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種；
所述放射性同位素為99mTc。所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。以上所述的小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于
(1)本發(fā)明的小分子肽能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合，為肺癌的特異性診斷及治療提供了新的方法；
(2)本發(fā)明利用放射性核素標(biāo)記小分子肽制備的小分子探針，可在體內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞示蹤成像，適用于肺癌患者的分子影像診斷及鑒別診斷，可增加肺癌成像的敏感性和特異性，對(duì)提高肺癌的早期陽(yáng)性診斷率有重要的臨床意義。


圖I是小分子肽cNGEGQQc_MAG3的質(zhì)譜分析圖。圖2小分子肽cNGEGQQc_MAG3的HPLC分析圖。圖3采用紙層析法分析小分子肽探針99mTC-CNGEGQQC的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(A是丙酮系統(tǒng)是氨水/乙醇/水混合物系統(tǒng))。圖4小分子肽探針99mTc-cNGEGQQc在小鼠體內(nèi)的分布情況圖。圖5 "mTc-cNGEGQQc在兔體內(nèi)的SPECT動(dòng)態(tài)顯像圖(I幀/秒，采集Imin )。圖6 "mTc-cNGEGQQc在兔體內(nèi)的SPECT動(dòng)態(tài)顯像圖(I幀/min，采集5min)。圖7 "mTc-cNGEGQQc在兔體內(nèi)的SPECT動(dòng)態(tài)顯像圖(I幀/5min，采集30min)。圖8利用ROI感興趣區(qū)分析技術(shù)獲取心臟、肝脾、腎臟和膀胱的時(shí)間-放射性曲線圖(I為兔動(dòng)態(tài)顯像圖各臟器ROI感興趣區(qū)勾畫；2為心臟的時(shí)間-放射性曲線圖；3為脾臟的時(shí)間-放射性曲線圖；4為肝臟的時(shí)間-放射性曲線圖；5為腎臟的時(shí)間-放射性曲線圖；6為膀胱的時(shí)間-放射性曲線圖)。圖9靜脈注射99mTC-CNGEGQQC后I. 5h兔前位及后位全身SPECT顯像。
圖10肺癌裸鼠模型(L78細(xì)胞)小分子肽探針99mTC-cNGEGQQc SPECT顯像圖(箭頭所示為移植瘤部位放射性濃聚情況)。圖11肺癌裸鼠模型(H1975細(xì)胞)小分子肽探針SPECT顯像圖(A圖為尾靜脈注射"mTc-cNGEGQQc后2h的顯像圖；B圖為尾靜脈注射99mTC-cNAQAEQc后2h的顯像圖)(箭頭所示為移植瘤部位放射性濃聚情況)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。實(shí)施例I
I、利用固相合成方法制備小分子肽cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)
(1)稱取Ig表面具有NH2活性基團(tuán)的樹脂珠子，用二甲基酰胺洗滌3次，然后在二甲基 酰胺浸泡至珠子充分腫脹；
(2)加入半胱氨酸和N，N’- 二異丙基碳二亞胺，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20% (v/v)的哌啶，在室溫下反應(yīng)5 min，再加入20% (v/v)的DMF，反應(yīng)15min,完全脫去Fmoc保護(hù)基；
(3)按步驟(2)方法依次偶聯(lián)L型天冬酰胺-L型甘氨酸-L型谷氨酸-L型甘氨酸-L型谷氨酰胺-L型谷氨酰胺-D型半胱氨酸；
(4)將連接完最后一個(gè)氨基酸的珠子經(jīng)25%(v/v)的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3
次；
(5)用無(wú)水氟化氫將小分子肽從樹脂珠子上切下，同時(shí)脫除所有側(cè)鏈保護(hù)基。還原產(chǎn)物在30% (v/v)乙酸高度稀釋下用碘作氧化劑，使分子內(nèi)2個(gè)半胱氨酸氧化形成二硫鍵。經(jīng)Sephadex-G-15柱層析,透析和高效液相層析分離純化，獲得在反相高效液相層析(分析柱)為單一峰的高純度產(chǎn)物。2、小分子肽探針99niTc-cNGEGQQc的制備
(I)小分子肽與螯合劑S-acetyl-MAG3 (巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯(lián)后得到復(fù)合物cNGEGQQc-MAG3 [乙酰化巰基乙醇-GGG (D-Cys) cNGEGQQc (D-Cys)]，理論分子量為1125. 05，質(zhì)譜測(cè)量其分子量為1146. 84(見附圖I)，HPLC法監(jiān)測(cè)其純度為96%(見附圖2)。螯合劑小分子肽的偶聯(lián)采用下列技術(shù)路線①SATA (s-乙?；鶐€基乙酰-N-羥基丁二酰亞胺)的合成巰基乙酸和乙酸酐(二者摩爾比為1:1. I)在室溫下反應(yīng)4d，反應(yīng)產(chǎn)物以減壓蒸餾(115 125°C、2 3mmHg)純化，得到高純度的乙?；瘞€基乙酸。75mmol乙酰化巰基乙酸與75mmol羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)溶解于150ml 二氧雜環(huán)乙烷中，在4°C條件下與75mmol 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)16h，過(guò)濾去除二環(huán)已脲，溶劑經(jīng)真空凍干后用異丙醇2次重結(jié)晶而得到SATA。②小分子短肽cNGEGQQc-MAG3復(fù)合物的合成按照上述I的方法，采用自動(dòng)多肽合成儀常規(guī)固相法合成目標(biāo)多肽cNGEGQQc，并在合成過(guò)程中直接在其N端連接3個(gè)甘氣酸，且在最后Iv甘氣Ife接完后，去保護(hù)，加入I倍摩爾量的SATA、7倍摩爾量的3mDIEA ( 二異丙基乙胺)及3倍摩爾量的HBTU (I-羥基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸鹽)和3倍摩爾量的HOBT (I-羥基苯并三唑)反應(yīng)60min，茚三酮反應(yīng)檢測(cè)為黃色即可。然后用NMP (N-甲基吡咯烷酮)、DCM (二氯甲烷)交替洗6次抽干。把切割液(Iml乙二硫醇，Iml苯甲硫醚,0. 5g苯酹,0. 4ml H2O, O. Iml三異丙基娃燒)倒入樹脂中，反應(yīng)7h左右后抽濾，用乙醚沉淀、離心4次，最后晾干，純化得cNGEGQQc-MAG3，產(chǎn)物經(jīng)HPLC鑒定。即在合成cNGEGQQc過(guò)程中直接完成與MAG3的偶聯(lián)。(2)采用間接標(biāo)記法實(shí)現(xiàn)99mTc標(biāo)記復(fù)合物cNGEGQQc_MAG3，具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行(Winnard P, et al. Nucl Med Biol, 1997，24 :425_432)，并略作改進(jìn)。標(biāo)記緩沖液為O. 25 mol/L的NaHC03、0· 18 mol/L氨水、O. 125 mol/L醋酸銨混合液，反應(yīng)總體積125 μ 1，小分子肽(cNGEGQQc-MAG3)含量為20 μ g，新鮮淋洗的99mTc04_淋洗液的放射性活度為3. 7 X IO7Bq,搖勾后水浴箱中反應(yīng)完成標(biāo)記。對(duì)影響標(biāo)記結(jié)果的5個(gè)重要因素分別選取4種不同水平酒石酸亞錫用量分別為O. 25U>5U0yg/ul ;反應(yīng)體系最終pH值分別為2、4、7. 6、10. O ;反應(yīng)溫度分別為25、37、75UOO0C ;反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、60min (反應(yīng)過(guò)程中氮?dú)饷芊?；轉(zhuǎn)鰲合劑酒石酸鉀鈉的終濃度分別為O. 5、1、3. 5、10μ g/μ 1，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，以尋找最佳標(biāo)記條件。因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
權(quán)利要求
1.一種小分子肽，其為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小分子肽，其氨基酸序列為cNGEGQQc(SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
3.一種小分子肽探針，由放射性同位素標(biāo)記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子肽探針，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子肽探針，其特征在于，所述放射性同位素為99mTc、111In, 18F-FDG,68Ga,64Cu 中的任一種。
6.一種小分子肽探針的制備方法，包括如下步驟 (1)將小分子肽與螯合劑S-acetyI-MAG3(巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯(lián)后得到小分子肽-MAG3復(fù)合物； (2)用放射性同位素標(biāo)記小分子肽-MAG3復(fù)合物得到小分子肽探針； 所述小分子肽為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種； 所述放射性同位素為99mTc。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的小分子肽探針的制備方法，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
8.權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于肺癌分子影像診斷的小分子肽探針及其制備方法。所述小分子肽探針由放射性同位素99mTc標(biāo)記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結(jié)構(gòu)的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個(gè)氨基酸中的任一種，該小分子肽能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合。本發(fā)明的小分子肽探針可在體內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞示蹤成像，適用于肺癌患者的分子影像診斷及鑒別診斷，可增加肺癌成像的敏感性和特異性，對(duì)提高肺癌的早期陽(yáng)性診斷率有重要的臨床意義。
文檔編號(hào)A61K103/10GK102643331SQ20121012360
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者劉亞杰, 李貴平, 郭琳瑯, 陳珍珠 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院