專利名稱：丹酚酸a在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及丹酚酸A的用途，尤其涉及丹酚酸A在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎臟纖維化，以腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化為特征，是多種慢性腎臟疾病最終結(jié)局。本質(zhì)上，腎纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚和沉積為特征的過程。產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞活化是腎纖維化形成的關(guān)鍵。生理情況下，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生適量的膠原基質(zhì)充填腎單位、血管和腎被膜之間的空隙。隨年齡增長(zhǎng)腎臟體積逐漸增大，成纖維細(xì)胞主要起腎間質(zhì)重塑作用。當(dāng)損傷及炎癥因素持續(xù)存在時(shí)，成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生過量的細(xì)胞外基質(zhì)。新合成的成纖維膠原成分在腎組織沉積。此外，腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞是主要的產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞。腎纖維化早期，系膜細(xì)胞和纖維母細(xì)胞發(fā)生活化，晚期出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。很多細(xì)胞因子可以促進(jìn)腎臟成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞的活化，加速腎臟纖維化的進(jìn)程，其中以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P I (TGF-0 I)作用最強(qiáng)。目前，國(guó)外對(duì)腎臟纖維化的機(jī)制研究較為深入，但是尚無安全有效的治療腎臟纖維化的藥物，而我國(guó)在該領(lǐng)域研究活血化瘀中藥的療效取得了一定的成績(jī)。丹參是唇型科植物丹參的干燥根和根莖，性苦，微寒，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神等功效。丹酚酸A是從丹參中提取的一類既有咖啡酞縮酚酸結(jié)構(gòu)又有新木脂素骨架的水溶性成分，分子式為C26H22Oltl，分子量是494. 45，溶于甲醇、乙醇、水。具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用，其在心臟保護(hù)、抗腫瘤等方面有著顯著活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A還有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制成纖維細(xì)胞增殖及抗肝纖維化的作用。劉成海等觀察了丹酚酸A對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖及其膠原生成率，對(duì)膠原合成的抑制可能是其抗肝纖維化的主要作用機(jī)理之一。王曉玲等觀察了丹酚酸A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響，結(jié)果顯示丹酚酸A能抑制成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)膠原合成，體外最佳作用濃度為10_6mol/l。王潤(rùn)平等觀察了丹酚酸A對(duì)過氧化損傷肝細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示丹酚酸A呈濃度依賴性地降低損傷肝細(xì)胞顯著升高的ALT (丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST (天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、LDH (乳酸脫氫酶)和SOD (超氧化物歧化酶)活性，改善異常的AST/ALT比值。胡義揚(yáng)等研究丹酚酸A的抗肝損傷、抗肝纖維化作用及其對(duì)I型膠原基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示丹酚酸A可降低血清ALT、AST水平及肝組織Hyp (羥脯氨酸)含量，減輕肝纖維化程度，抑制I型膠原在基質(zhì)中沉積。目前，對(duì)丹酚酸A在抑制腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化中的作用、降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白(24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG、^ 2_MG、TRF)、腎功能(Scr、BUN)、減輕腎臟炎癥及膠原沉積中的作用及改善腎纖維化相關(guān)基因和蛋白(TGF-0 UCTGF,ColIagenIII、LN、Collagen I、FN)的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供丹酚酸A的新用途，即丹酚酸A在制藥中的新應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，在本發(fā)明的一方面，提供丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用。所述丹酚酸A抑制TGF-P I誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的有效濃度為4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備降低腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。所述丹酹酸A降低腎纖維化的有效劑量為10mg/kg/d或17. lmg/kg/d。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善尿蛋白的藥物中的應(yīng)用。所述改善尿蛋白包括改善24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG, ^ 2_MG、TRF。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善腎功能的藥物中的應(yīng)用。所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白的藥物中的應(yīng)用。所述改善腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白包括改善纖維化相關(guān)基因和蛋白TGF-P I、CTGF、Collagen III、LN、Collagen I、FN。本發(fā)明以TGF-P I為刺激因子，在體外用MTT法觀察不同濃度梯度的丹酚酸A對(duì)TGF-Pl刺激下大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的作用，并在體內(nèi)觀察其對(duì)UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白的影響。本發(fā)明設(shè)計(jì)了以TGF-P I誘導(dǎo)的大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的篩選平臺(tái)，觀察各濃度梯度的丹酚酸A對(duì)大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的抑制作用及有效工作濃度。結(jié)果顯示濃度為4. 94 X 10 Vml 4. 94 X 10 Vml的丹酚酸A可抑制TGF-P I誘導(dǎo)的大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化，兩個(gè)濃度作用效果之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)了丹酚酸A對(duì)大鼠腎纖維化作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察丹酹酸A中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17. lmg/kg/d)對(duì)UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白的影響，結(jié)果中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17. lmg/kg/d)的丹酚酸A均能降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白。從而本發(fā)明從體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了丹酚酸A能抑制腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化，降低腎纖維化大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白，即本發(fā)明驗(yàn)證了丹酚酸A可用于制備降低腎纖維化的藥物。


圖I-圖6是試驗(yàn)例2中丹酚酸A在UUO模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖I-圖3為HE染色(100 X )，圖I代表A組，圖2代表B組，圖3代表C組；圖4-圖6為Masson染色(100X)，圖4代表A組，圖5代表B組，圖6代表C組。圖7-圖14是試驗(yàn)例2中丹酚酸A在Platt模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖7-圖10為HE染色(100X)，圖7代表A組，圖8代表B組，圖9代表C組，圖10代表D組；圖11-圖14為Masson染色(100X)，圖11代表A組，圖12代表B組，圖13代表C組，圖14代表D組。具體實(shí)施 方式以下通過試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明丹酚酸A的藥理活性試驗(yàn)及結(jié)果作進(jìn)一步的闡述試驗(yàn)例I體外實(shí)驗(yàn)一、材料與方法(一 )材料實(shí)驗(yàn)細(xì)胞正常大鼠腎臟成纖維細(xì)胞株(NRK-49F)和系膜細(xì)胞株(HBZY-I)，均購(gòu)自上海復(fù)盟基因生物科技有限公司。丹酚酸A購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)110420 ； TGF-^ I生長(zhǎng)因子購(gòu)自P印roTech公司，產(chǎn)品編號(hào):100_21C。胎牛血清，產(chǎn)品編號(hào)S1840-500 ;DMEM高糖培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)LOl 103-500 ；
0.25%胰蛋白酶-0. 02%乙二胺四乙酸，產(chǎn)品編號(hào)L0932-500 ;青霉素-鏈霉素產(chǎn)品編號(hào)03-050-1B ;以上均購(gòu)自Biowest公司。MTT粉末，化學(xué)名為3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5- 二苯基溴化四唑,購(gòu)自Amresco公司，產(chǎn)品編號(hào)0793。( 二 )方法I.實(shí)驗(yàn)步驟I. I MTT法先用 0. 25%胰蛋白酶-0. 02% 乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25%-0. 02%EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細(xì)胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔I X 104/ml個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 yl。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液100 iil，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。之后加入TGF- ^ I生長(zhǎng)因子和丹酚酸A，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 10 u 1，37°C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液(盡量洗凈殘留的培養(yǎng)液)。每孔加入IOOiU DMSO (二甲基亞砜)，振蕩lOmin，使針狀結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(0D值)。I. 2 ELISA法先用0. 25 %胰蛋白酶-0. 02 %乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25% -0. 02% EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細(xì)胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔I X 104/ml個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積IOOu I0待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液100 yl，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。之后加入TGF-P I生長(zhǎng)因子和丹酚酸A，收集24h細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作。2.實(shí)驗(yàn)分組2. I觀察NRK-49F細(xì)胞株分7組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分組如下A 組(空白對(duì)照組)、B 組(TGF- P I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- P I 5ng/ml 組)、D 組(TGF- P 12ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X l(T5g/ml 組)、E 組(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸 A
4.94X 10 Vml 組)、F 組(TGF- ^ I 5ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94X l(T5g/ml 組)、G 組(TGF- ^ I5ng/ml+丹酚酸A4. 94 X 10 Vml組)。B組和C組為模型組。2. 2觀察HBZY-I細(xì)胞株分4組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分組如下A 組(空白對(duì)照組)、B 組(TGF- P I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸A 4. 94X l(T5g/ml 組)、D 組(TGF- ^ I 2ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X 10 Vml 組)。B 組為模型組。
3.觀察指標(biāo)
3. I采用MTT法觀察24h丹酚酸A對(duì)兩種細(xì)胞株的作用。3. 2采用ELISA法觀察細(xì)胞上清液中TGF- ^的分泌情況。二、結(jié)果I.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纖維細(xì)胞株(NRK-49F)的增殖空白對(duì)照組NRK-49F的OD值為0. 355±0. 034，加入TGF-P I生長(zhǎng)因子(2ng/ml和5ng/ml)NRK-49F的OD值為0. 508±0. 026和0. 457±0. 042，明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。說明TGF-P I生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)NRK-49F的活化。丹酚酸A高劑量(4. 94Xl(T5g/ml)及中劑量(4. 94Xl(T6g/ml)組OD值分別為 0. 450±0. 019,0. 394±0. 010和 0. 389±0. 007,0. 389±0. 011，低于模型組(P < 0. 05 0. 01)(見表 I)。表I丹酚酸A對(duì)活化的大鼠成纖維細(xì)胞株(NRK-49F)的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白對(duì)照組(A)0.355±0.034
+TGF-pi 2ng/ml (B)0.508±0.026 *
+TGF-PI 5ng/ml (C)0.457±0.042 *+TGF-Pl 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(D) 0.450±0.019#
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(E) 0.389±0.007#
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(F) 0.39牡0.010A
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(G) 0.389±0.011A注與A組比較，*P < 0. 05 ;與B組比較，#P < 0. 01 ;與C組比較，aP < 0. 05。2.丹酚酸A能抑制活化的大鼠系膜細(xì)胞株(HBZY-I)的增殖空白對(duì)照組HBZY-I的00值為0.204±0.018，加入丁6卩-3 1生長(zhǎng)因子(2ng/ml)HBZY-I的OD值為0. 229±0. 019，明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。說明TGF-P I生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)HBZY-I的活化。丹酚酸A高劑量(4. 94X10_5g/ml)及中劑量(4. 94X l(T6g/ml)組 OD 值分別為 0. 218±0. 020 和 0. 205±0. 013，低于模型組(P < 0. 05)(見表2)。表2丹酚酸A對(duì)活化的大鼠HBZY-I的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白對(duì)照組(A)0.20牡0.018+TGF-pi 2ng/ml (B)0.229±0.019 *
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml (C)0.218±0.020A
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml (D)0.205±0.013A注與A組比較，*P < 0. 05 ;與B組比較，aP < 0. 05。3.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纖維細(xì)胞株(NRK-49F) TGF- ^的分泌
空白對(duì)照組NRK-49F 的 TGF- ^ 濃度為(15. 682 ± 2. 396) pg/ml，加入 TGF- ^ I生長(zhǎng)因子(2ng/ml 和 5ng/ml)NRK-49F 的 TGF-^ 濃度為(122. 664 ±10. 397) pg/ml 和(401.252±31.856)pg/ml，明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)。說明TGF-P I生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)NRK-49F TGF-^的分泌。丹酚酸A高劑量(4. 94X 10_5g/ml)及中劑量(4.94X10_6g/ml)組 TGF-P 濃度分別為(84. 070±5. 726)pg/ml、(262. 198±24. 077)pg/ml 和(67. 894±10. 529)pg/ml, (200. 574±18. 181)pg/ml,低于模型組(P < 0. 05 0. 01)(見表 3)。表3丹酚酸A對(duì)活化的大鼠NRK-49F TGF- ^的分泌(x±s)
權(quán)利要求
1.丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述丹酚酸A抑制TGF-PI誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的有效濃度為4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。
3.丹酚酸A在制備降低腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述丹酚酸A降低腎纖維化的有效劑量為10mg/kg/d 或 17. lmg/kg/cL
5.丹酚酸A在制備改善尿蛋白的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述改善尿蛋白包括改善 24h 尿蛋白定量、a I-MG, NAG, P 2_MG、TRF。
6.丹酚酸A在制備改善腎功能的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
7.丹酚酸A在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應(yīng)用。
8.丹酚酸A在制備改善腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述改善腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白包括改善纖維化相關(guān)基因和蛋白TGF-P I、CTGF,Collagen III、LN、Collagen I、FN0
全文摘要
本發(fā)明公開了丹酚酸A在制藥中的應(yīng)用。涉及丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用、在制備降低腎纖維化的藥物中的應(yīng)用、在制備改善尿蛋白的藥物中的應(yīng)用、制備改善腎功能的藥物中的應(yīng)用、在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應(yīng)用以及在制備減輕腎臟纖維化指標(biāo)相關(guān)基因和蛋白的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)了以TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞活化的篩選平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)4.94×10-5g/ml～4.94×10-6g/ml的丹酚酸A可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞的活化。本發(fā)明還設(shè)計(jì)了丹酚酸A對(duì)UUO模型和Platt模型大鼠作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17.1mg/kg/d)均能降低UUO模型和Platt模型大鼠的尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關(guān)基因和蛋白。
文檔編號(hào)A61P13/12GK102614164SQ201210083120
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者何立群, 楊雪軍, 林日陽(yáng), 王東, 王琛 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院