專利名稱：一種人工真皮支架及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術和生物醫(yī)學工程領域。更確切地說，本發(fā)明涉及一種人工真皮支架及其制備方法。
背景技術：
皮膚作為人體器官，具有保持水分、透氣和防止細菌侵襲等功能。當皮膚受到外傷、燒傷、炎癥等損害，尤其是當大面積的皮膚受到嚴重損害時，傷口應該立即被保護起來。如果僅是皮膚的淺層或是小面積受損，新皮膚會自體得以再生。如果深層的大面積皮膚受到創(chuàng)傷，皮膚就不能實現自修復，通常須進行自體皮膚移植，如郵票植皮、網狀植皮、嵌皮等方法?；蛘呤褂萌斯てつw產品?，F有技術的人工皮膚產品均存在皮膚誘導自體皮膚組織修復能力不足，而且存在創(chuàng)面修復過程中創(chuàng)面因為內源或外源性的感染的風險。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題在于:提供一種人工真皮支架及其制備方法，以克服現有技術用于皮膚損傷修復的人工真皮支架修復能力差的問題，避免內源或外源性感染的風險。為解決上述技術問題，本發(fā)明的采取的技術方案是:提供一種人工真皮支架，包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，該人工真皮支架引入了加載有功能因子的緩釋微球。 所述加載有功能因子的緩釋微球包括加載抗生素的微球和/或加載皮膚生長因子的微球；所述人工真皮支架的三維多孔結構因深層和淺層孔隙率不同而形成梯度結構，所述淺層孔隙率低于深層孔隙率。進一步地，在所述深層，加載抗生素的微球被加入；在所述淺層，加載皮膚生長因子的微球被加入，從而形成雙因子緩釋人工真皮支架。進一步地，所述加載抗生素微球的基體原料選自聚乳酸，聚乙醇酸聚乳酸，聚乙醇酸中的一種或幾種的組合；抗生素選自慶大霉素、萬古霉素、青霉素中的一種或幾種的組合；所述載皮膚生長因子的微球的基體原料選自聚乳酸，聚乙醇酸聚乳酸，聚乙醇酸中的一種或幾種的組合；所述皮膚生長因子選自表皮生長因子或血管內皮細胞生長因子中的一種或兩種；人工真皮支架三維多孔結構的制備原料為膠原、或膠原與殼聚糖、硫酸軟骨素、絲素蛋白之一種或幾種的復合而成的復合物。所述復合物中膠質量分數為50 98%。所述深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間；淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250 ii m之間。本發(fā)明還提供人工真皮支架的制備方法，包括以下步驟:
步驟1:制備加載有功能因子的緩釋微球；
步驟2:制備一定濃度的膠原溶液作為基體溶液；
步驟3:將加載有功能因子的緩釋微球混于相應的基體溶液，并成型包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，從而形成引入了加載有功能因子緩釋微球的人工真皮支架。所述步驟2是分別制備兩種質量濃度的基體溶液。所述步驟3中成型兩個層次的三維多孔結構的工藝:是將所述一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入一定深度的模具中，淌平后靜置一定時間形成第一層次；之后再將另一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入模具中所述第一層次之上，再淌平后靜置一定時間形成第二層次；接著將模具置于一定溫度下冷凍，然后冷凍干燥從而得到本發(fā)明的雙層真皮支架。進一步地，步驟I所述緩釋微球包括加載抗生素的微球和/或加載皮膚因子的微球。進一步地，步驟2中是分別制備總質量百分濃度為0.8^1%的膠原溶液和總質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液。進一步地，步驟3中，是將制備得到的載抗生素的微球懸液混入質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液中形成第一混合溶液，以每5 35g第一混合溶液且其中含微球2(T200mg的質量比例注入模具中，淌平后靜置一定時間形成所述第一層次；將制備得到的載皮膚因子的微球懸液混入質量百分濃度為0.8 1%的膠原溶液中形成第二混合溶液，以每5 35g第二混合溶液且其中含微球5-100mg的質量比例注入已淌平的第一層次之上，再次淌平后靜置一定時間形成所述的第二層次，經冷凍，然后冷凍干燥得到雙因子緩釋雙層人工真皮支架；所述第一層次對應形成人工真皮支架的深層，第二層次對應形成淺層。進一步地，所述步驟2中分別制備質量濃度為0.8 1%的膠原溶液和質量濃度為0.4^0.8%的膠原溶液， 其工藝為:按0.r2g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同時按絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖共0.r2g溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第二溶液，將第一和第二溶液按一定比例混合，從而分別制備成質量百分濃度為0.8^1%的膠原溶液和質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液。進一步地，所述步驟I制備加載有功能因子的緩釋微球是指制備加載抗生素的微球和/或加載皮膚因子的微球，其工藝為:是將一定量的抗生素或皮膚因子的水溶液與PLA或者PLGA或者PGA的二氯甲烷DCM溶液混合，攪拌乳化制得內乳液后，同進將去離子水中加入聚山梨醇酯-80攪拌至分散均勻制得外水相，將內乳液加入外水相，攪拌乳化制得復乳液，進一步攪拌使DCM揮發(fā)，經洗滌分離得到加載抗生素的微球懸液或者加載皮膚因子的微球懸液。本發(fā)明的有益效果:一方面，引入了制備兩層孔隙率不同的支架，這樣的梯度結構有利于引導皮膚組織的長入。另一方面，我們引入了加載功能因子的緩釋微球，有效改善人工真皮支架促進創(chuàng)面修復、抗感染，或其它功能。特別地在深層，加載抗生素的微球被加入，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中，尤其是前期的感染，以實現抗生素的長效作用，用以克服感染。在淺層，加載皮膚生長因子的微球被加入，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復，以促進創(chuàng)面愈合。這種人工真皮支架被稱為雙因子緩釋人工真皮支架，具有抗菌活性和促進創(chuàng)面愈合的特性。整個真皮支架采用天然高分子制備成多孔支架結構。本發(fā)明的制備方法，深層和淺層采用不同濃度逐層注模成型，形成梯度多孔支架，有利引導組織長入。且兩層加載不同藥物的微球，達到兩層不同的功能。特別地深層藥物釋放防止感染，淺層釋放促進修復。
具體實施例方式本發(fā)明的人工真皮支架包括深層和淺層的兩個層次的三維多孔結構，該兩層孔隙率不同，淺層偏低，深層偏高，從而形成梯度結構。這樣的梯度結構有利于弓I導皮膚組織的長入。在一具體實施方式
中，深層的孔隙率為85 98%,孔徑主要分布在100 300iim之間；淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250 ii m之間。進一步地，本發(fā)明的人工真皮支架引入了加載有功能因子的緩釋微球，所述緩釋微球包括但不限于加載抗生素的微球和/或加載皮膚生長因子的微球。最佳地，在深層，力口載抗生素的微球被加入，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中，尤其是前期的感染；在淺層，加載皮膚生長因子的微球被加入，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復，從而形成本發(fā)明創(chuàng)造的雙因子緩釋人工真皮支架。所述載抗生素微球的基體原料可選擇聚乳酸PLA，乙醇酸-乳酸共聚物PLGA，聚乙醇酸PGA中的一種或幾種的組合?？股乜蛇x擇慶大霉素、萬古霉素、青霉素等中的一種或幾種的組合。也可根據具體需要來選擇微球基體原料以及抗生素的種類。載抗生素微球的平均粒徑為IOOnm 200 u m。所述載皮膚生長因子的微球的基體原料可選擇聚乳酸PLA，乙醇酸-乳酸共聚物PLGA，聚乙醇酸PGA中的一種或幾種的組合。所述皮膚生長因子可選擇但不限于:表皮生長因子EGF或血管內皮細胞生長因子VEGF中的一種或兩種。載皮膚生長因子微球的平均粒徑為 200nm 500 u m。本發(fā)明的人工真皮支架的兩個層次的三維多孔結構的制備原料為膠原，或膠原與殼聚糖、硫酸軟骨素、絲素蛋白之一種或幾種的復合物。優(yōu)選地，膠原在復合物中的質量分數為50 98%,其于成分 為殼聚糖和/或硫酸軟骨素和/或絲素蛋白。本發(fā)明實施例所制備的人工真皮支架具有緩釋抗生素和皮膚生長因子的特性，釋放出的藥物保持生物活性。一方面，引入了深層及淺層孔隙率不同的支架，這種梯度結構有利于引導皮膚組織的長入。另一方面，引入了緩釋微球，在淺層，加載皮膚生長因子的微球被加入，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復；在深層，加載抗生素的微球被加入，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中尤其是前期的感染，且實現抗生素的長效作用，以克服感染。這種雙因子緩釋人工真皮支架，具有抗菌活性和促進創(chuàng)面愈合的特性，具有較好的誘導自體皮膚組織修復能力，可有效地在創(chuàng)面修復過程中防止創(chuàng)面因為內源或外源性的感染。整個真皮支架采用天然高分子制備成多孔支架結構?？梢岳斫猓鳛樯鲜鰧嵤├淖儞Q方式，所述雙因子緩釋微球(緩釋抗生素和緩釋皮膚生長因子)也可選擇性地加載于淺層或深層二者之一，或者加載于同一層次。本發(fā)明的人工真皮支架制備方法主要包括的步驟如下文進行具體的描述。步驟1:制備加載有功能因子的緩釋微球，所述緩釋微球可包括但不限于加載抗生素的微球和/或加載皮膚因子的微球。其中，步驟I制備載抗生素的微球的工藝實例中，先取0.4mL的l(T200mg/mL的抗生素如慶大霉素或萬古霉素或青霉素等的超純水溶液至4mL的PLA或者PLGA或者PGA濃度為2(T200mg/mL的二氯甲烷DCM溶液，用內切式勻漿機以300(T5000rpm的轉速乳化30 60秒，制得內乳液(即油包水乳液w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80 (聚山梨酯-80)，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻漿機以300(T8000rpm的轉速乳化3(T90秒，制得復乳液(即水包油包水乳液w/o/w);將該液中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到加載抗生素的微球懸液。步驟I制備載皮膚因子的微球的工藝實例中，先取0.2mL的0.0f 100mg/mL的皮膚因子如表皮生長因子EGF或血管內皮細胞生長因子VEGF等的超純水溶液至2mL的聚乳酸(PLA)或者乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)或者聚乙醇酸(PGA)濃度為2(T200mg/mL的二氯甲烷(DCM)溶液，用內切式勻漿機以300(T5000rpm的轉速乳化30 60秒，制得內乳液(w/0);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80 (吐溫80)，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻漿機以300(T8000rpm的轉速乳化30、0秒，制得復乳液(w/o/w);將該液中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到加載皮膚因子的微球懸液?？梢岳斫?，可以根據現有技術的其它工藝來制備加載抗生素的微球和加載皮膚因子的微球。另外，根據具體的臨床需要，也可以選擇和制備加載其它功能因子的緩釋微球。步驟2:制備兩種質量濃度的膠原溶液作為基體溶液，較佳地，分別制備總質量百分濃度為0.8 1%的膠原溶液和總質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液；更優(yōu)選地，所述膠原溶液中復合有絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖。其中，制備質量分數為0.8 1%的膠原與絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖復合的溶液的工藝為:按每0.r2g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液配比比例配制第一溶液，同時按絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖總量為0.l 2g溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的比例配制第二溶液，選取適宜配比將第一、二溶液混和配制成總的質量百分濃度為0.8 1%的復合膠原溶液。制備質量分數為0.4^0.8%的膠原與絲素蛋白或硫酸軟骨素或殼聚糖復合的溶液的工藝為:按每0.r2 g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同時按絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖總質量0.r2 g溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的比例配制第二溶液，選取適宜配比將第一、二溶液混和制得總的質量百分濃度為0.4^0.8%的復合膠原溶液。步驟3:將加載有功能因子的緩釋微球混于相應的基體溶液，并成型包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，從而形成引入了加載有功能因子緩釋微球的人工真皮支架。所述成型兩個層次的三維多孔結構的工藝，是將所述一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入一定深度的模具中，淌平后靜置一定時間形成第一層次；之后再將另一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入模具中的所述第一層次之上，再淌平后靜置一定時間形成第二層次；接著將模具置于-6(T-8(TC冷凍，然后冷凍干燥從而得到本發(fā)明的雙層真皮支架。更優(yōu)選地，將制備得到的載抗生素的微球懸液混入質量分數為0.4^0.8%的復合膠原溶液中形成第一混合溶液，以5 35g第一混合溶液且其中含微球2(T200 mg注入深度為5mm的正方體不銹鋼模具中，淌平后靜置f 10分鐘形成第一層次；將制備得到的載皮膚因子的微球懸液混入質量分數為0.8 1%的復合膠原溶液中形成第二混合溶液，以5 35g該第二混合溶液且其中含微球5-100mg注入前述已淌平的第一層次上，再次淌平后靜置廣10分鐘形成第二層次，迅速置于-6(T-8(TC冷凍，然后冷凍干燥得到本發(fā)明雙因子緩釋雙層人工真皮支架。其中第一層次對應形成人工真皮支架的深層，第二層次對應形成淺層?？梢岳斫?，模具的形狀、尺寸、材質可根據不同需要進行靈活選擇。下面舉例進一步闡明本發(fā)明雙因子緩釋人工真皮支架的制備方法。實例I
一種雙因子緩釋人工真皮支架的制備方法為:
首先，制備載抗生素的PLGA微球:取0.4mL的10mg/mL的慶大霉素的超純水溶液至4mL的PLGA的DCM溶液，用內切式勻漿機以3000rpm的轉速乳化30秒，制得內乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯_80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻衆(zhòng)機以3000rpm的轉速乳化30秒,制得復乳液(w/o/w);將該復乳液以中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到加載抗生素的PLGA微球懸液；
同時，制備載皮膚因子的微球:取0.2mL的0.01mg/mL的表皮生長因子(EGF)的超純水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用內切式勻漿機以5000rpm的轉速乳化60秒，制得內乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯_80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻衆(zhòng)機以8000rpm的轉速乳化90秒,制得復乳液(w/o/w);將該復乳液以中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜；離心后，水洗三次，得到加載表皮生長因子的PLA微球懸液；
然后，制備復合人工真皮支架:將已制備的載慶大霉素的PLGA微球和載表皮生長因子的PLA微球復合進膠原與絲素蛋白的復合真皮支架，其具體實施的工藝步驟如下:
(1)制備質量分數為0.8%的膠原與絲素蛋白的膠原復合溶液:將0.1g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，同時將1.513g絲素蛋白溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將兩溶液混和均勻配制成總的質量濃度為0.8%的復合溶液；
(2)制備質量分數為0.4%的膠原與絲素蛋白的復合膠原溶液:將0.1g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，同時將0.7032g絲素蛋白溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將兩溶液混和均勻配制成總的質量濃度為0.4%的復合溶液；
(3)制備載微球的雙層真皮支架，其具體包括的工藝步驟為:
a.將制備得到的載抗生素的PLGA微球懸液混入質量濃度為0.8%的膠原與絲素蛋白的復合溶液中形成混合溶液，以5g該混合溶液其中含50mgPLGA微球注入深度為5mm的正方體不銹鋼模具中，淌平后靜置I分鐘，形成第一層次；
b.將制備得到的加載表皮生長因子的PLA微球懸液混入質量分數為0.4%的膠原與絲素蛋白的復合溶液中形成混合溶液，以該混合溶液15g其中含5mgPLGA微球注入a中已淌平的復合液之上，再次淌平后靜置3分鐘形成第二層次；迅速將模具置于-6(T-8(TC冷凍，然后冷凍干燥得到雙層真皮支架，其中第一層次形成深層，第二層次形成淺層。本例中制備的雙因子人工真皮支架包括深層和淺層的兩個層次的三維多孔結構，該兩層孔隙率不同， 淺層偏低，深層偏高，從而形成梯度結構。經實驗檢測可得，其中深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間，淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250iim之間。該雙因子緩釋人工真皮支架的深層引入加載抗生素的微球，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中的感染；在淺層引入加載皮膚生長因子的微球，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復。當該雙層真皮支架用于III度燒傷創(chuàng)面切痂后植皮時，可有效減少前期的感染，同時縮短創(chuàng)面修復的周期。實例2
一種雙因子緩釋人工真皮支架的制備方法為:
首先，制備載抗生素的PLGA微球:取0.4mL的200mg/mL的青霉素的超純水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用內切式勻漿機以5000rpm的轉速乳化60秒，制得內乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯_80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻衆(zhòng)機以8000rpm的轉速乳化90秒,制得復乳液(w/o/w);將該復乳液以中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到加載青霉素的PGA微球懸液；
同時，制備載皮膚因子的微球:取0.2mL的lOOmg/mL的血管內皮(細胞)生長因子(VEGF)的超純水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用內切式勻漿機以3000rpm的轉速乳化30秒，制得內乳液(w/o);在30!^去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻漿機以8000rpm的轉速乳化90秒，制得復乳液(w/o/w);將該液中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜，離心后，水洗三次，得到加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液；
然后，制備復合人工真皮支架:將已制備的載抗生素的微球和載皮膚因子的微球復合進膠原與硫酸軟骨素的復合真皮支架 ，其具體實施的工藝步驟如下:
(1)制備質量濃度為1%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液:將1.5g膠原溶解于IOOmL的
0.5M的醋酸水溶液，同時將0.52g硫酸軟骨素溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和配制成總的質量濃度為1%的復合溶液；
(2)制備質量濃度為0.8%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液:將1.2g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，同時將1.61g硫酸軟骨素溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和制得總的質量濃度為0.8%的復合溶液；
(3)制備載微球的雙層真皮支架，其具體實施的工藝步驟如下:
a.將制備得到的加載青霉素的PGA微球懸液混入質量濃度為0.8%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液中形成混合溶液，以20g該混合溶液其中含200mgPLGA微球注入深度為5mm的正方體不銹鋼模具中，淌平后靜置2分鐘形成第一層；
b.將制備得到的加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液混入質量濃度為1%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液中形成混合溶液，以20g該混合溶液其中含IOOmgPLGA微球注入a中已淌平的第一層之上，再次淌平后靜置3分鐘形成第二層；迅速置于-6(T-80°C冷凍，然后冷凍干燥得到雙層真皮支架，其中第一層次形成深層，第二層次形成淺層。本例中制備的雙因子人工真皮支架包括深層和淺層的兩個層次的三維多孔結構，該兩層孔隙率不同，淺層偏低，深層偏高，從而形成梯度結構。經實驗檢測可得，其中深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間，淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250iim之間。
該雙因子緩釋人工真皮支架的深層引入加載抗生素的微球，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中的感染；在淺層引入加載皮膚生長因子的微球，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復。當該雙層真皮支架用于III度燒傷創(chuàng)面切痂后植皮時，可有效減少前期的感染，同時縮短創(chuàng)面修復的周期。實例3
一種雙因子緩釋人工真皮支架的制備方法為:
首先，制備載抗生素的PLGA微球:取0.4mL的50mg/mL的萬古霉素的超純水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用內切式勻漿機以4000rpm的轉速乳化30秒，制得內乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯_80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻衆(zhòng)機以5000rpm的轉速乳化60秒,制得復乳液(w/o/w);將該復乳液以中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜，離心后，水洗三次，得到加載萬古霉素的PGA微球懸液；
同時，制備載皮膚因子的微球:取0.2mL的lOOmg/mL的血管內皮(細胞)生長因子(VEGF)的超純水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用內切式勻漿機以4000rpm的轉速乳化50秒，制得內乳液(w/o);在30!^去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻漿機以5000rpm的轉速乳化60秒，制得復乳液(w/o/w);將該復乳液中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜，離心后，水洗三次，得到加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液；
然后，制備復合人工真皮支架:將已制備的載抗生素的微球和載皮膚因子的微球復合進膠原與硫酸軟骨素的復合真皮支架，其具體的工藝步驟如下:
(1)制備質量濃度為0.9%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液:將1.5g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，同時將0.32g硫酸軟骨素溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和配制成總的質量濃度為0.9%的復合溶液；` (2)制備質量濃度為0.7%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液:將1.2g膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，同時將0.21g硫酸軟骨素溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和制得總的質量濃度為0.7%的復合溶液；
(3)制備載微球的雙層真皮支架，其具體的工藝步驟如下:
a.將制備得到的加載萬古霉素的PGA微球懸液混入質量濃度為0.8%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液中形成混合液，以15g該混合液其中含IOOmgPLGA微球注入深度為5mm的正方體不銹鋼模具中，淌平后靜置2分鐘，形成第一層次；
b.將制備得到的加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液混入質量濃度為1%的膠原與硫酸軟骨素的復合溶液中形成混合液，以25g該混合液其中含50mgPLGA微球注入a中已淌平的復合溶液形成的第一層次之上，再次淌平后靜置3分鐘形成第二層次；迅速置于-6(T-8(TC冷凍，然后冷凍干燥得到雙層真皮支架，其中第一層次形成深層，第二層次形成淺層。本例中制備的雙因子人工真皮支架包括深層和淺層的兩個層次的三維多孔結構，該兩層孔隙率不同，淺層偏低，深層偏高，從而形成梯度結構。經實驗檢測可得，其中深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間，淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250iim之間。
該雙因子緩釋人工真皮支架的深層引入加載抗生素的微球，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中的感染；在淺層引入加載皮膚生長因子的微球，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復。當該雙層真皮支架用于III度燒傷創(chuàng)面切痂后植皮時，可有效減少前期的感染，同時縮短創(chuàng)面修復的周期。實例4
一種雙因子緩釋人工真皮支架的制備方法為:
首先，制備載抗生素的PLGA微球:取0.4mL的50mg/mL的萬古霉素的超純水溶液至4mL的PGA的DCM溶液，用內切式勻漿機以3000rpm的轉速乳化20秒，制得內乳液(w/o);在30mL去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯_80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻衆(zhòng)機以5000rpm的轉速乳化60秒,制得復乳液(w/o/w);將該復乳液以中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜。離心后，水洗三次，得到加載萬古霉素的PGA微球懸液；
同時，制備載皮膚因子的微球:取0.2mL的lOOmg/mL的血管內皮(細胞)生長因子(VEGF)的超純水溶液至2mL的PLA的DCM溶液，用內切式勻漿機以3000rpm的轉速乳化50秒，制得內乳液(w/o);在30!^去離子水中，加入0.3mL聚山梨醇酯-80，機械攪拌至分散均勻，制得外水相；將內乳液加入外水相，用內切式勻漿機以5000rpm的轉速乳化70秒，制得復乳液(w/o/w);將該液中速攪拌3小時待DCM揮發(fā)，靜置過夜，離心后，水洗三次，得到加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液；
然后，制備復合人工真皮支架:將已制備的載抗生素的微球和載皮膚因子的微球復合進膠原與硫酸軟骨素的復合真皮支架，其具體的制備工藝步驟如下:
(1)制備質量濃度為0.9%的膠原與殼聚糖的復合溶液:將1.4g膠原溶解于IOOmL的
0.5M的醋酸水溶液，同時將0.42g殼聚糖溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和配制成總的質量濃度為0.9%的復合溶液；
(2)制備質量濃度為0.7%的膠原與殼聚糖的復合溶液:將1.3g膠原溶解于IOOmL的
0.5M的醋酸水溶液，同時將0.1lg殼聚糖溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液，將這兩溶液混和制得總的質量濃度為0.7%的復合溶液；
(3)制備載微球的雙層真皮支架，其具體包括的制備工藝為:
a.將制備得到的加載萬古霉素的PGA微球懸液混入質量濃度為0.8%的膠原與殼聚糖的復合溶液中形成混合液，以15g該混合液其中含50mgPLGA微球注入深度為5mm的正方體不銹鋼模具中，淌平后靜置2分鐘形成第一層次；
b.將制備得到的加載血管內皮(細胞)生長因子的PLA微球懸液混入質量濃度為1%的膠原與殼聚糖的復合溶液中形成混合液，以25g該混合液其中含50mgPLGA微球注入a中已淌平的復合溶液形成的第一層次之上，再次淌平后靜置3分鐘形成第二層次；迅速置于-6(T-8(TC冷凍，然后冷凍干燥得到雙層真皮支架，其中第一層次形成深層，第二層次形成淺層。本例中制備的雙因子人工真皮支架包括深層和淺層的兩個層次的三維多孔結構，該兩層孔隙率不同，淺層偏低，深層偏高，從而形成梯度結構。經實驗檢測可得，其中深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間，淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250iim之間。
該雙因子緩釋人工真皮支架的深層引入加載抗生素的微球，通過緩釋抗生素以防止創(chuàng)面修復過程中的感染；在淺層引入加載皮膚生長因子的微球，通過緩釋皮膚生長因子以促進皮膚的修復。當該雙層真皮支架用于III度燒傷創(chuàng)面切痂后植皮時，可有效減少前期的感染，同時縮短創(chuàng)面修復·的周期。
權利要求
1.一種人工真皮支架，包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，該人工真皮支架引入了加載有功能因子的緩釋微球。
2.如權利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于:所述加載有功能因子的緩釋微球包括加載抗生素的微球和/或加載皮膚生長因子的微球；所述人工真皮支架的三維多孔結構因深層和淺層孔隙率不同而形成梯度結構，所述淺層孔隙率低于深層孔隙率。
3.如權利要求2所述的人工真皮支架，其特征在于:在所述深層，加載抗生素的微球被加入；在所述淺層，加載皮膚生長因子的微球被加入，從而形成雙因子緩釋人工真皮支架。
4.如權利要求2所述的人工真皮支架，其特征在于:所述加載抗生素微球的基體原料選自聚乳酸，乙醇酸-乳酸共聚物，聚乙醇酸中的一種或幾種的組合；抗生素選自慶大霉素、萬古霉素、青霉素中的一種或幾種的組合；所述載皮膚生長因子的微球的基體原料選自聚乳酸，乙醇酸-乳酸共聚物，聚乙醇酸中的一種或幾種的組合；所述皮膚生長因子選自表皮生長因子或血管內皮細胞生長因子中的一種或兩種；人工真皮支架三維多孔結構的制備原料為膠原、或膠原與殼聚糖、硫酸軟骨素、絲素蛋白之一種或幾種的復合而成的復合物。
5.如權利要求4所述的人工真皮支架，其特征在于:所述復合物中膠原質量分數為50 98%。
6.如權利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于:所述深層的孔隙率為85 98%，孔徑主要分布在100 300 ii m之間；淺層的孔隙率為75 95%，孔徑主要分布在50 250 y m之間。
7.如權利要求1飛中任一項所述的人工真皮支架，其制備方法包括以下步驟: 步驟1:制備加載有功能因子的緩釋微球； 步驟2:制備一定濃度的膠原溶 液作為基體溶液； 步驟3:將加載有功能因子的緩釋微球混于相應的基體溶液，并成型包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，從而形成引入了加載有功能因子緩釋微球的人工真皮支架。
8.如權利要求7所述的人工真皮支架的制備方法，其特征在于:所述步驟2是分別制備兩種質量濃度的基體溶液；所述步驟3中成型兩個層次的三維多孔結構的工藝:是將所述一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入一定深度的模具中，淌平后靜置一定時間形成第一層次；之后再將另一種濃度的膠原溶液或其中混有加載功能因子緩釋微球，注入模具中所述第一層次之上，再淌平后靜置一定時間形成第二層次；接著將模具置于一定溫度下冷凍，然后冷凍干燥從而得到本發(fā)明的雙層真皮支架。
9.如權利要求8所述的人工真皮支架的制備方法，其特征在于:步驟I所述緩釋微球包括加載抗生素的微球和/或加載皮膚因子的微球；步驟2中是分別制備總質量百分濃度為0.8 1%的膠原溶液和總質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液；步驟3中，是將制備得到的載抗生素的微球懸液混入質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液中形成第一混合溶液，以每5 35g第一混合溶液且其中含微球2(T200mg的質量比例注入模具中，淌平后靜置一定時間形成所述第一層次；將制備得到的載皮膚因子的微球懸液混入質量百分濃度為0.8 1%的膠原溶液中形成第二混合溶液，以每5 35g第二混合溶液且其中含微球5-100mg的質量比例注入已淌平的第一層次之上，再次淌平后靜置一定時間形成所述的第二層次，經冷凍，然后冷凍干燥得到雙因子緩釋雙層人工真皮支架；所述第一層次對應形成人工真皮支架的深層，第二層次對應形成淺層。
10.如權利要求7所述的人工真皮支架的制備方法，其特征在于:所述步驟2中分別制備質量濃度為0.8^1%的膠原溶液和質量濃度為0.4^0.8%的膠原溶液，其工藝為:按.0.Hg膠原溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第一溶液，同時按絲素蛋白和/或硫酸軟骨素和/或殼聚糖共0.r2g溶解于IOOmL的0.5M的醋酸水溶液的配比比例配制第二溶液，將第一和第二溶液按一定比例混合，從而分別制備成質量百分濃度為.0.8 1%的膠原溶液和質量百分濃度為0.4^0.8%的膠原溶液；所述步驟I制備加載有功能因子的緩釋微球是指制備加載抗生素的微球和/或加載皮膚因子的微球，其工藝為:是將一定量的抗生素或皮膚因子的水溶液與PLA或者PLGA或者PGA的二氯甲烷DCM溶液混合，攪拌乳化制得內乳液后，同時將去離子水中加入聚山梨醇酯-80攪拌至分散均勻制得外水相，將內乳液加入外水相，攪拌乳化制得復乳液，進一步攪拌使DCM揮發(fā)，經洗滌分離得到加載抗生素的微球 懸液或者加載皮膚因子的微球懸液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工真皮支架，包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，該人工真皮支架引入了加載有功能因子的緩釋微球，包括加載抗生素的微球和加載皮膚生長因子的微球。所述人工真皮支架的三維多孔結構因深層和淺層孔隙率不同而形成梯度結構。該人工真皮支架的制備方法主要包括制備加載有功能因子的緩釋微球；制備兩種濃度的膠原溶液作為基體溶液；將加載有功能因子的緩釋微球混于相應的基體溶液，并成型包括深層和淺層兩個層次的三維多孔結構，從而形成引入了加載有功能因子緩釋微球的人工真皮支架。本發(fā)明的人工真皮支架具有抗菌活性和促進創(chuàng)面愈合的特性。
文檔編號A61L27/54GK103239758SQ20121003254
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權日2012年2月14日
發(fā)明者佘振定, 譚榮偉 申請人:深圳蘭度生物材料有限公司