專(zhuān)利名稱(chēng)：Neuritin蛋白的HLA-A*0201限制性CTL表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及ー種抗原細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位，特別涉及neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，還涉及該CTL表位的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，國(guó)內(nèi)資料統(tǒng)計(jì)平均為40-50%?，F(xiàn)已明確化療能延長(zhǎng)ー些膠質(zhì)瘤患者的生存期，但效果仍不理想。隨著分子生物科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，腫瘤的分子水平及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)增殖、血管發(fā)生等ー些分子參與的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)越來(lái)越多，腫瘤的分子治療逐漸顯示了日益重要的地位。腫瘤特異性免疫治療由于不傷及無(wú)關(guān)正常組織，是近年來(lái)發(fā)展迅速的腫瘤治療方法。其基本原理是腫瘤抗原多肽在抗原提呈細(xì)胞(APC)的作用下以MHC-I-肽復(fù)合物(與 MHC-I類(lèi)分子結(jié)合的肽被定義為CTL表位)的形式被提呈于APC表面，CTL通過(guò)其T細(xì)胞受體特異識(shí)別APC表面的MHC-I-肽復(fù)合物而得以活化，最終特異識(shí)別存在于腫瘤細(xì)胞表面的抗原多肽而特異殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，尋求特異腫瘤抗原及其相應(yīng)的CTL表位是腫瘤特異性免疫治療的關(guān)鍵。neuritin是ー種廣譜表達(dá)的小分子蛋白，屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族。neuritin編碼的蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)和成熟，促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng)及分支，調(diào)節(jié)突觸回路的形成和神經(jīng)細(xì)胞再生和可塑性方面發(fā)揮重要作用。最新研究結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤組織中，neuritin的表達(dá)量在正常以及癌旁組織中有顯著性差異，提示它和膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。并且有文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)染neuritin的3T3細(xì)胞注射裸鼠體內(nèi)可導(dǎo)致相應(yīng)部位腫瘤的形成。研究結(jié)果提示neuritin參與了腫瘤的發(fā)生過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，neuritin有可能在膠質(zhì)瘤的免疫治療中發(fā)揮重要的靶向作用。由于HLA-A*0201是中國(guó)人群最為常見(jiàn)的HLA-I類(lèi)分子的型別，陽(yáng)性率高達(dá)50%，同時(shí)也是北美高加索人種最常見(jiàn)的HLA-I類(lèi)分子的型別，陽(yáng)性率高達(dá)98%。因此，鑒定出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白neuritin的HLA_A*0201限制性CTL表位，將會(huì)對(duì)中國(guó)人群和北美高加索人群中Neuritin表達(dá)異常升高的惡性腫瘤提供免疫治療的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之ー在于提供neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，該表位能夠以高親和カ結(jié)合HLA-A*0201，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)肽特異性的CTL應(yīng)答。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID No. I、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明的目的之ニ在于提供所述neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位在制備腫瘤治療性肽疫苗中的應(yīng)用。進(jìn)ー步，所述腫瘤治療性肽疫苗為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性肽疫苗。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，該CTL表位能夠以高親和カ結(jié)合HLA-A*0201，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)肽特異性的CTL應(yīng)答，刺激肽特異性CTL分泌高水平的IFN- Y并對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，可用于制備腫瘤治療性肽疫苗例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性肽疫苗，在腫瘤特異性免疫治療領(lǐng)域有著潛在、良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。


圖I為預(yù)測(cè)CTL表位Pl與HLA-A*0201的復(fù)合物模型。圖2為預(yù)測(cè)CTL表位P2與HLA_A*0201的復(fù)合物模型。圖3為預(yù)測(cè)CTL表位P3與HLA_A*0201的復(fù)合物模型。 圖4為預(yù)測(cè)CTL表位Pl的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象。圖5為預(yù)測(cè)CTL表位P2的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象。圖6為預(yù)測(cè)CTL表位P3的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象。圖7為預(yù)測(cè)CTL表位肽P1、P2、P3與HLA_A*0201的親和カ檢測(cè)結(jié)果。圖8為預(yù)測(cè)CTL表位肽P1、P2、P3與HLA_A*0201的復(fù)合物穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。圖9為預(yù)測(cè)CTL表位肽P1、P2、P3刺激肽特異性CTL殺傷靶細(xì)胞的能力檢測(cè)結(jié)果。圖10為預(yù)測(cè)CTL表位肽Pl、P2、P3刺激肽特異性CTL分泌IFN- Y的能力檢測(cè)結(jié)果O
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩的詳細(xì)描述。一、Neuritin HLA_A*0201 限制性 CTL 表位預(yù)測(cè)
I、超基序方案預(yù)測(cè)CTL表位
超基序是指在同一 HLA家族，甚至是不同家族的HLA同種異型分子接納的抗原肽具有相同和相似的鋪著殘基構(gòu)成的妝基序。超基序主要的鋪定殘基是妝鏈第2位(P2)和第9位(P9)的氨基酸殘基，當(dāng)P2、P9位氨基酸殘基為V、L、I、M或T時(shí)，肽與HLA_A*0201有高親和カ；當(dāng)P2、P9位氨基酸殘基為A、I、L、M、V或T吋，肽與HLA_A*0201有較高親和力。利用 SYFPEITHI 在線軟件(http://www. syfpeithi. de/scripts/MHCServer. dll/home,htm)，以P2、P9位氨基酸殘基為V、L、I、M或T為條件，對(duì)neuritin蛋白(Genbank登錄號(hào)為ΝΜ_016588. 2)的HLA_A*0201限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果獲得分值大于26的預(yù)測(cè)CTL表位3個(gè)，分別是Pl ILAVQIAYL (SEQ IDNo. 1)，得分 29 ；P2 SLLPAFPVL (SEQ ID No. 2)，得分 27 ；P3 KLNGRYISL (SEQ ID No. 3)，得分26。2、預(yù)測(cè)CTL表位的分子動(dòng)力學(xué)模擬
運(yùn)用Silicon graphics工作站及Insight II軟件包中的Discover 3模塊(采用CVFFカ場(chǎng))，對(duì)3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位P1、P2和P3與HLA-A2. I的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。HLA-A*0201的初始坐標(biāo)來(lái)自于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)登錄的流感病毒蛋白Ml58_66 (T細(xì)胞表位)與HLA-A*0201的復(fù)合物模型(登錄號(hào)為IHH I)，預(yù)測(cè)CTL表位是運(yùn)用Bioploymer模塊對(duì)IHH I中的Ml58_66進(jìn)行氨基酸替換而得。分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程如下第一歩，將HLA-A*0201與β 2m固定，運(yùn)用最陡下降法對(duì)預(yù)測(cè)CTL表位進(jìn)行2000步優(yōu)化計(jì)算，再用共扼梯度法優(yōu)化，直到能量均方根誤差(RMS)小于I. 0187K/J. mo I ;第二歩，在預(yù)測(cè)CTL表位與HLA-A*0201復(fù)合物周?chē)萤`層7. 5埃的水分子，再固定復(fù)合物對(duì)水分子進(jìn)行2000步能量?jī)?yōu)化，以消除水分子之間以及水分子與蛋白質(zhì)之間的不合理接觸；第三歩，對(duì)溶液狀態(tài)下的預(yù)測(cè)CTL表位與HLA-A*0201復(fù)合物進(jìn)行能量最小化計(jì)算，非鍵相互作用采用9. 5埃的截?cái)嘀?，先后運(yùn)用最陡下降法和共扼梯度法優(yōu)化，直到能量RMS小于I. 0187K/J. mol ;第四步，在298K的恒定溫度下進(jìn)行20皮秒的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算；第五步，對(duì)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化得到的最后構(gòu)象進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化5000歩，獲得預(yù)測(cè)CTL表位與HLA-A*0201復(fù)合物的最終構(gòu)象。借助Homology模塊，計(jì)算3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位的P2、P9錨定間距等結(jié)合參數(shù)。3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位與HLA-A*0201的復(fù)合物模型分別見(jiàn)圖1_3，3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位的分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)象分別見(jiàn)圖4-6。3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位的P2、P9錨定間距在17 20埃范圍內(nèi)，滿(mǎn)足大部分HLA-A*0201限制性CTL表位的錨定間距在15 20埃范圍的要求。3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位與HLA-A*0201結(jié)合槽的氨基酸殘基之間均形成5個(gè)以上的穩(wěn)定氫鍵。
ニ、預(yù)測(cè)Neuritin HLA_A*0201限制性CTL表位肽的合成
3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成儀上進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)芴甲氧羰基(Fmoc)方案,精氨酸采用兩次偶聯(lián)。起始選用0. 125mmol對(duì)輕甲基苯氧甲基聚苯こ烯樹(shù)月旨(HMP樹(shù)脂)，按照多肽的氨基酸序列使肽鏈從羧基端逐個(gè)向氨基端延伸，每種氨基酸的用量為0. 5mmol,與樹(shù)脂的摩爾比為4:1。各種氨基酸的α -氨基為Fmoc保護(hù),其余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)分別為L(zhǎng)ys (Boc)、Ser (tBu)、Glu (OtBu)、Arg (Pmc)、His (Trt)、Thr (tBu)和 Tyr (tBu)。第一個(gè)氨基酸連接到樹(shù)脂上用4-ニ甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用I-羥基苯并三唑(HOBt)和ニ環(huán)己基碳ニ亞胺(DCC)，偶聯(lián)后用體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶水溶液去除Fmoc保護(hù)基。多肽合成后，將樹(shù)脂-粗肽產(chǎn)品在冰浴條件下混合于IOmL切割液A(由結(jié)晶苯酚0. 75g、I, 2-こニ硫醇即EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、去離子水0. 25mL和三氟こ酸即TFA IOmL組成)中，待切割液溫度上升至室溫后，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，使肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，同時(shí)去除多種保護(hù)基團(tuán)。將反應(yīng)混合液經(jīng)G4玻砂漏斗過(guò)濾以去除樹(shù)脂，先后用ImL TFA、5 10mL ニ氯甲烷反復(fù)沖洗反應(yīng)瓶、樹(shù)脂和漏斗。將濾液在常溫低壓下蒸發(fā)至f 2mL，加入50mL預(yù)冷こ醚沉淀多肽，4°C放置過(guò)夜，G6玻砂漏斗過(guò)濾，真空抽干，即得多肽粗品，-20°C保存?zhèn)溆?。將多肽粗品用ニ甲基亞?DMSO)溶解制成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾后，在AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀(瑞典AmersshamBioscienc公司)上用SOURCE凝膠柱進(jìn)行純化。流動(dòng)相A由體積分?jǐn)?shù)為10%的こ醇和體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的TFA組成，流動(dòng)相B由體積分?jǐn)?shù)為90%的こ醇和體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的TFA組成；洗脫梯度為先用流動(dòng)相A洗脫I. 5個(gè)柱體積，再用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液洗脫8個(gè)柱體積(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在8個(gè)柱體積內(nèi)由0%逐漸增加至80%)，再用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液洗脫0. 5個(gè)柱體積(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在0. 5個(gè)柱體積內(nèi)由80%逐漸增加至100%)，在主峰處收集多肽溶液，冷凍干燥，即得多肽純品，用DMSO溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩⒍嚯募兤酚肈elta 600型高壓液相色譜儀鑒定純度，采用Symmetry ShieldTMC18柱，流動(dòng)相由體積分?jǐn)?shù)為10°/Γ60%的こ腈和體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的TFA組成，流速為ImL/min。結(jié)果顯示，合成多肽的純度均達(dá)到95%以上。同時(shí)，將多肽純品用API 2000 LC/MS型電噴霧離子化質(zhì)譜儀測(cè)定分子量。結(jié)果顯示，合成多肽的分子量分別與3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽的理論分子量相符三、預(yù)測(cè)Neuritin HLA_A*0201限制性CTL表位肽與HLA_A*0201的親和カ檢測(cè) 采用HLA-A*0201表達(dá)陽(yáng)性但內(nèi)源性抗原肽遞呈途徑必需的抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體
(TAP)缺陷的T2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。T2細(xì)胞表面空載的HLA-A*0201表達(dá)極不穩(wěn)定，呈遞后很快降解，而結(jié)合了抗原肽的HLA-A*0201表達(dá)穩(wěn)定，且抗原肽與HLA-A*0201的結(jié)合力越強(qiáng)，HLA-A*0201的表達(dá)量越高。因T2細(xì)胞的內(nèi)源性抗原肽加工處理能力缺失，故T2細(xì)胞表面HLA-A*0201的表達(dá)量增加直觀地反應(yīng)了外源性抗原肽與HLA-A*0201的結(jié)合力。實(shí)驗(yàn)分為4組P1組(預(yù)測(cè)CTL表位肽Pl)、P2組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P2)、P3組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽AAVEEVRAL)。將3 X IO5個(gè)T2細(xì)胞接種于Iml含有濃度為100M的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)以及濃度為10% (w/w)的胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)16小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入BB7. 2雜交瘤細(xì)胞分泌的鼠抗人HLA_A*0201單克隆抗體100 μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入按體積比為1:50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀于波長(zhǎng)488nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光系數(shù)(FI)。結(jié)果如圖7所示，可見(jiàn)Pl組、P2組和P3組的FI值均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽PI、P2和P3均能以高親和カ結(jié)合HLA-A*0201。四、預(yù)測(cè)Neuritin HLA_A*0201限制性CTL表位肽與HLA_A*0201的復(fù)合物穩(wěn)定性檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)分為4組P1組(預(yù)測(cè)CTL表位肽Pl )、P2組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P2)、P3組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽AAVEEVRAL)。將I X IO6個(gè)T2細(xì)胞接種于Iml含有濃度為100M的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)以及濃度為10%(w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)16小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于O、2、4、6、8小時(shí)取出細(xì)胞，加入BB7. 2雜交瘤細(xì)胞分泌的鼠抗人HLA_A*0201單克隆抗體100μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入按體積比為1:50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100μ 1，4°C培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀于波長(zhǎng)488nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算肽與HLA_A*0201分子復(fù)合物的半數(shù)解離時(shí)間(DC50)。結(jié)果如圖8所示，可見(jiàn)Pl組、P2組和P3組的DC50值均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽P1、P2、P3與HLA_A*0201的復(fù)合物均具有較高的穩(wěn)定性。五、預(yù)測(cè)Neuritin HLA_A*0201限制性CTL表位肽促進(jìn)特異性的CTL應(yīng)答檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)分為4組P1組(預(yù)測(cè)CTL表位肽Pl )、P2組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P2)、P3組(預(yù)測(cè)CTL表位肽P3)和陰性對(duì)照組(無(wú)關(guān)表位肽AAVEEVRAL)。I、預(yù)測(cè)CTL表位肽體外誘導(dǎo)特異性的CTL
采用聚蔗糖-泛影葡氨分層液密度梯度離心法從HLA-A*0201陽(yáng)性健康者的外周血濃縮白細(xì)胞中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC用RPMI 1640培養(yǎng)基在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育2小時(shí)，分離非貼壁細(xì)胞[主要為淋巴細(xì)胞(PBL)]和貼壁細(xì)胞[樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)]。將DC按細(xì)胞密度為2X106/3ml加入含有濃度為800IU/ml的集落刺激因子(GM-CSF)、濃度為1000 IU/ml的白介素4 (IL-4)以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每2天半量換液并補(bǔ)充GM-CSF和IL-4，第5天加入終濃度為10ng/ml的腫瘤壞死因子(TNF- α )，第7天獲得成熟DC。向成熟DC中加入終濃度為IOM的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)，在溫度37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育2小吋，30Gy放射性處理，獲得負(fù)載肽的DC。按PBL與DC的數(shù)量比為3:1飛I向PBL中加入負(fù)載肽的DC，再按PBL細(xì)胞密度為I. 5 X 106/2ml加入含有濃度為10ng/ml的白介素7 (IL-7)以及濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，第11天加入負(fù)載肽的DC再次刺激培養(yǎng)的PBL，24 48小時(shí)后向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為10IU/ml的白介素2 (IL-2)并補(bǔ)充IL-7至終濃度為10ng/ml，之后每隔7天按照上述相同方法再次刺激培養(yǎng)的PBL，連續(xù)刺激4次，獲得肽特異性CTL，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細(xì)胞。、
2、肽特異性CTL對(duì)靶細(xì)胞的體外殺傷能力檢測(cè)
將I X IO6個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251轉(zhuǎn)移至離心管中，用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌I次，吸除大部分上清液，剩余約O. Iml培養(yǎng)基于管底，重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)量的51Cr溶液，在溫度為37°C、C02氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，獲得51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。在96孔板中，每孔分別按效靶比(E/T)為100 1、50 I和25 I加入效應(yīng)細(xì)胞與上述51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，每種效靶比設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)最大釋放孔(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放孔[用含有濃度為10% (w/w)的FCS的RPMI1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞]。將96孔板1200r/min離心30秒，溫度37°C孵育4小吋，向最大釋放孔中加入終濃度為2% (w/w)的Triton X-100并吹打混勻，孵育10分鐘，再將96孔板1200r/min離心5分鐘，分別吸取各孔上清液至SiCr計(jì)數(shù)管，用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算不同效靶比時(shí)的殺傷率。結(jié)果如圖9所示，可見(jiàn)Pl組、P2組和P3組在各效靶比對(duì)U251細(xì)胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比増大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽P1、P2、P3均能有效激發(fā)CTL的細(xì)胞毒活性，從而特異性殺傷靶細(xì)胞。3、肽特異性CTL分泌IFN- Y的能力檢測(cè)
采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Biolegend公司)進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞密度至I X 106/ml，取100 μ I鋪板，加入終濃度為10Μ的肽(按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)肽)，刺激48小時(shí)后去除細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入ー抗、ニ抗和顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，顯色晾干后讀數(shù)。結(jié)果如圖10所示，可見(jiàn)Pl組、Ρ2組和Ρ3組的斑點(diǎn)數(shù)均明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽Ρ1、Ρ2、Ρ3均具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- Y。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位肽PI、Ρ2、Ρ3均能以高親和カ結(jié)合HLA-A*0201，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)肽特異性的CTL應(yīng)答，刺激肽特異性CTL分泌高水平的IFN- Y并對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，可得出以下結(jié)論3個(gè)預(yù)測(cè)CTL表位P1、P2和P3均為neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，其對(duì)應(yīng)的表位肽P1、P2和P3可用于制備腫瘤治療性肽疫苗，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性肽疫苗。
最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本 發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.Neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQ ID No. I、SEQID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的Neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位在制備腫瘤治療性肽疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Neuritin蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤治療性肽疫苗為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性肽疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抗原細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位，特別涉及neuritin蛋白的HLA-A*0201限制性CTL表位，其氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。還涉及該CTL表位在制備腫瘤治療性肽疫苗中的應(yīng)用。該CTL表位能夠以高親和力結(jié)合HLA-A*0201，所形成的復(fù)合物穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)肽特異性的CTL應(yīng)答，刺激肽特異性CTL分泌高水平的IFN-γ并對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，可用于制備腫瘤治療性肽疫苗例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性肽疫苗，在腫瘤特異性免疫治療領(lǐng)域有著潛在、良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102659921SQ201210016998
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者袁邦清, 陳羽健, 馬建芳, 鮮榮華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院四七六醫(yī)院