專利名稱：具有共價(jià)結(jié)合肽的重組t細(xì)胞受體配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及包含共價(jià)連接有肽抗原的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)多肽的組合物和使用這些組合物以例如調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物對特異性抗原免疫應(yīng)答的起始由該抗原呈遞至T細(xì)胞帶來。在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的情形中，抗原被呈遞至T細(xì)胞。MHC復(fù)合物位于抗原呈遞細(xì)胞(APC)的表面上；MHC的三維結(jié)構(gòu)包括適合所呈遞抗原進(jìn)入的溝(groove)或裂隙(cleft)。當(dāng)在存在必需共刺激信號的情況下T細(xì)胞上的合適受體與APC上的MHC/抗原復(fù)合物相互作用時(shí)，所述T細(xì)胞被刺激，觸發(fā)免疫系統(tǒng)激活事件的充分表征的級聯(lián)的多個(gè)方面，包括誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，誘導(dǎo)B細(xì)胞活性和刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物中存在兩類基本的MHC分子，MHC I類和MHC II類。這兩類都是由兩個(gè)獨(dú)立的蛋白締合 形成的大蛋白復(fù)合物。每類都包括將所述復(fù)合物錨定至細(xì)胞膜的跨膜結(jié)構(gòu)域。MHC I類分子由兩個(gè)非共價(jià)締合的蛋白——α鏈和β 2-微球蛋白——形成。所述α鏈包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:α 1、α 2和α 3。所述α I結(jié)構(gòu)域和α 2結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)形成適合抗原進(jìn)入用于呈遞到T細(xì)胞的溝。所述α 3結(jié)構(gòu)域是Ig-折疊樣結(jié)構(gòu)域，其含有將α鏈錨定至APC細(xì)胞膜中的跨膜序列。當(dāng)與抗原締合時(shí)(并且在合適的共刺激信號的存在下)，MHC I類復(fù)合物可刺激CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所述細(xì)胞起到殺死其特異性識(shí)別的任何細(xì)胞的作用。所述非共價(jià)締合形成MHC II類分子的兩個(gè)蛋白被稱為α鏈和β鏈。所述α鏈包含αI結(jié)構(gòu)域和α 2結(jié)構(gòu)域，所述β鏈包含βI結(jié)構(gòu)域和β 2結(jié)構(gòu)域。適合抗原進(jìn)入的裂隙通過所述αI結(jié)構(gòu)域和βI結(jié)構(gòu)域的相互作用形成。所述α 2結(jié)構(gòu)域和β 2結(jié)構(gòu)域是將所述α鏈和β鏈錨定至APC的細(xì)胞膜中的跨膜Ig-折疊樣結(jié)構(gòu)域。當(dāng)與抗原締合時(shí)(并且在存在合適的共刺激信號的情況下)，MHC II類復(fù)合物可刺激⑶4Τ細(xì)胞。⑶4Τ細(xì)胞在免疫系統(tǒng)內(nèi)起多種作用，包括起始炎癥應(yīng)答，調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，幫助B細(xì)胞進(jìn)行抗體合成，調(diào)制免疫應(yīng)答以實(shí)現(xiàn)對給定抗原的合適免疫應(yīng)答，分泌細(xì)胞因子和/或表達(dá)膜結(jié)合因
罕坐丁寸οMHC復(fù)合物在免疫系統(tǒng)中起的作用已導(dǎo)致開發(fā)了將這些復(fù)合物用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。例如，在MHC的情形中，可識(shí)別“自身”抗原肽(自身抗原)的活化T細(xì)胞在自身免疫性疾病(例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化)中起關(guān)鍵作用。因?yàn)榉蛛x的MHC II類分子(裝載有合適的抗原)可替換攜帶MHC II類復(fù)合物的APC并且可結(jié)合抗原特異性T細(xì)胞，許多人已提出分離的MHC/抗原復(fù)合物可用于治療自身免疫性疾病(參見美國專利N0.5，194，425和 5，284，935)。在另一種情形中，已經(jīng)表明在缺乏共刺激因子的情況下，分離的MHCII/抗原復(fù)合物與T細(xì)胞的相互作用可誘導(dǎo)稱為無反應(yīng)性的無應(yīng)答狀態(tài)(Quill et al，J.1mmunol.，138:3704-3712，1987)。根據(jù)該現(xiàn)象，Sharma 等人(美國專利 N0.5，468，481 和5，130, 297)和Clarke等人(美國專利N0.5，260, 422)已經(jīng)提出，可在治療上給予這類分離的MHC 11/抗原復(fù)合物以使得對特定自身抗原肽特異性應(yīng)答的T細(xì)胞系無反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
雖然使用分離的MHC/抗原復(fù)合物的概念在治療和診斷應(yīng)用中具有很好的前景，但是到目前為止報(bào)道的各種方法的主要缺點(diǎn)是該復(fù)合物是大體積的并因此難于產(chǎn)生和操作。本文表明，重組MHC多肽(例如重組的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域MHC I類多肽或MHC II類多肽)可被共價(jià)連接到肽抗原上以產(chǎn)生穩(wěn)定的復(fù)合物。本文公開了含有通過二硫鍵與抗原決定簇共價(jià)連接的MHC I類或MHC II類重組T細(xì)胞受體配體(RTL)多肽的穩(wěn)定復(fù)合物。還公開了制備這類組合物的方法和使用方法，例如治療或抑制自身免疫性疾病。在一些實(shí)施方案中，所公開的組合物包括含有共價(jià)連接的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的重組MHC多肽以及通過二硫鍵與所述MHC多肽共價(jià)連接的抗原決定簇(例如肽抗原)，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類β I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類α I結(jié)構(gòu)域，其中所述α I結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述β I結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，其中所述MHC II類多肽不包括α2或β 2結(jié)構(gòu)域。在其 他實(shí)施方案中，所公開的組合物包括含有共價(jià)連接的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的重組MHC多肽以及通過二硫鍵與所述MHC多肽共價(jià)連接的抗原決定簇(例如肽抗原)，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α 2結(jié)構(gòu)域，其中所述α 2結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述α I結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，其中所述MHC I類多肽不包括α 3結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)例中，所述重組MHC多肽在溶液中聚集的傾向降低，例如這樣的重組MHC多肽，即在所述MHC多肽的極性氨基酸或荷電氨基酸的β折疊平臺(tái)(platform)中包括一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸置換。在一些實(shí)例中，利用所述MHC多肽中天然存在的半胱氨酸殘基(例如MHC II類β 結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基或MHC I類α結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基)形成二硫鍵。在其他實(shí)例中，利用所述MHC多肽中非天然存在的半胱氨酸殘基(例如通過誘變引入至所述MHC多肽的半胱氨酸殘基)形成二硫鍵。在其他實(shí)例中，利用所述抗原決定簇中天然存在的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。仍在其他實(shí)例中，利用所述肽抗原中非天然存在的半胱氨酸殘基(例如通過誘變引入至所述抗原決定簇的半胱氨酸殘基)形成二硫鍵。本文還公開了制備所公開組合物的方法和用于產(chǎn)生所公開組合物的試劑盒。在一些實(shí)例中，所述方法包括使用含有一種或多種組分的緩沖液或溶液，以幫助(例如提供充分的條件)在所述重組MHC多肽和所述抗原決定簇之間形成二硫鍵。本文還提供了使用所公開組合物的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括治療或抑制受試者中自身免疫性疾病(包括給予有效量的含有通過二硫鍵與抗原決定簇共價(jià)連接的本文公開的重組MHC多肽的組合物)。在具體的實(shí)例中，所述自身免疫性疾病包括但不限于多發(fā)性硬化、I型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉或銀屑病。根據(jù)以下的具體實(shí)施方式
，本公開的上述特征和其他特征將變得更加明顯，所述具體實(shí)施方式
參考附圖進(jìn)行。


圖1A是示出“空的”rIAg7 (_)和帶有二硫鍵(disulfide)捕獲的胰島素B:9_23肽的rIAg7 (WT)的考馬斯藍(lán)染色的10-20%SDS-PAGE的數(shù)字圖像。rIAg7/肽作為高分子量種類(29kD、31kD和33kD)遷移。裝載樣品和處理?xiàng)l件如所示(Red，還原性；NR，非還原性)。圖1B的條狀圖示出對圖1A的泳道7和泳道8中所示條帶的定量。圖2是示出對rIAg7捕獲的FITC標(biāo)記的胰島素B:9-23肽和變體(如所示)對比的數(shù)字圖像。rIAg7對野生型胰島素B:9-23肽(C19)的捕獲最有效。如圖所示，半胱氨酸移向氨基端(移至第18位；C18)或移向羧基端(移至第20位；C20)的胰島素B:9-23變體即使在孵育50小時(shí)之后仍被捕獲，但是效率低很多。肽序列在數(shù)字圖像下面示出。圖3是示出rIAg7捕獲肽的時(shí)間過程的兩張數(shù)字圖像。在IOOmM NaPO4 (pH6.5)、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN3中將胰島素B:16-23肽(FITC-YLVCGERG;SEQ ID NO:1)和rIAg7混合(10:1,肽:rIAg7),維持所示的時(shí)間。圖4的曲線圖示出圖3所示時(shí)間過程的29kD條帶和31kD條帶的密度測定結(jié)果。對考馬斯染色的條帶進(jìn)行定量以確定捕獲的起始速率。圖5是示出存在內(nèi)部二硫鍵的rIAg7的總質(zhì)量測量的兩張質(zhì)譜圖。將rIAg7的樣品烷基化，或者還原且烷基化。烷基化的rIAg7 (左)示出了在21，416.7Da處的主峰，其與缺失氨基末端甲硫氨酸的rIAg7的21，420.6Da的期望質(zhì)量非常接近。還原且烷基化的rIAg7 (右)示出了在21，530.3處的主峰，其與缺失氨基末端甲硫氨酸且多出兩個(gè)額外的烷基的rIAg7的期望質(zhì)量非常接近。在21，665.5處的次峰與具有完整氨基末端甲硫氨酸且多出兩個(gè)烷基的rIAg7的21，665.8的期望質(zhì)量非常接近。圖6是純化的rIAg7和與胰島素B:9_23肽混合的rIAg7的SDS-PAGE的數(shù)字圖像(左)。示出了分子量標(biāo)準(zhǔn)。將對應(yīng)rIAg7的條帶和在29kD和31kD處的兩個(gè)較高分子量條帶(中)從凝膠中切出，以胰蛋白酶消化并通過質(zhì)譜法進(jìn)行分析。所述rIAg7條帶包含二硫鍵連接的肽，該肽含有完整C17-C79 二硫鍵(右下)。所述29kD條帶和31kD條帶都包含二硫鍵連接的肽，該肽含有與含rIAg7C79的肽AELDTACR (SEQ ID N0:2)交聯(lián)的胰島素B:9_23肽(右上)。圖7 是裝載有 M0G35-55 (WT)、M0G35_55S42C 變體或 M0G35-55P43C 變體的純化的重組人DR2 (_)的SDS-PAGE的數(shù)字圖像(左)。裝載樣品，處理?xiàng)l件都如所示(Red，還原性；NR，非還原性)。在右側(cè)示出了泳道5、泳道6、泳道7和泳道8的密度測定數(shù)據(jù)(從左到右為DR2條帶、29kD條帶、3IkD條帶和33kD條帶)。圖8是裝載有小鼠M0G35-55S45C變體的重組鼠1-Ab的SDS-PAGE的數(shù)字圖像。裝載樣品，處理?xiàng)l件如所示(Red,還原性；NR,非還原性)。 圖9是在非常規(guī)結(jié)合寄存器(register)中結(jié)合IAg7的胰島素B:9-23的模型。當(dāng)Cysl9占據(jù)P4袋，將其置于距離C17-C79內(nèi)鏈二硫鍵合適的距離時(shí)，該結(jié)合寄存器支持對胰島素B:9-23的高效氧化還原捕獲。圖10的圖表示出用裝載有二硫鍵捕獲的胰島素B:9-23的rIAg7 (rIAg7_胰島素)、空rIAg7 (RTL450)或載體(Tris緩沖液)處理的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的存活率。圖1lA的曲線圖示出用載體、RTL551或裝載有二硫鍵捕獲的M0G35-55的RTL550(RTL550-Cys-MOG)處理的小鼠在處理后隨時(shí)間的EAE得分。圖1lB的條狀圖示出按照圖1lA所示處理的小鼠的累積疾病指數(shù)。圖12A的曲線圖示出用載體(未處理)或具有二硫鍵捕獲的M0G35-55的RTL550(RTL550-Cys-MOG)處理的、干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)敲除小鼠在處理后隨時(shí)間的EAE得分。圖12B的條狀圖示出按照圖12A所示處理的小鼠中累積疾病指數(shù)。圖13A-C是示出MHC II類多肽的預(yù)測結(jié)構(gòu)的系列圖。圖13A是抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的HLA-DR2多肽的模型。圖13B是示例性MHC II類β I α I分子的模型。圖13C是HLA-DR2 β Ia I分子中示例性β折疊平臺(tái)的模型，示出疏水性殘基。圖14是人、小鼠和大鼠MHC II類β I a I多肽的氨基酸序列的比對。*表示為了最佳的序列比對所引入的缺口。箭頭表示β 1/a I聯(lián)結(jié)。半胱氨酸殘基加陰影。斜體表示β I結(jié)構(gòu)域和a I結(jié)構(gòu)域之間的非天然接頭殘基。RTL302 (DR2)中具有下劃線的殘基是在改性RTL (在溶液中聚集減少)中被絲氨酸或天冬氨酸置換的殘基。序列標(biāo)識(shí)如下:DR2(SEQ ID N0:11)、DR3 (SEQ ID N0:55)、DR4 (SEQ ID N0:56)、DP2 (SEQ ID N0:19)、DQ2(SEQ ID N0:20)、IAs (SEQ ID N0:57)、IAg7 (SEQ ID N0:4)、IAb (SEQ ID NO:14),RTl.B(SEQ ID N0:58)。

序列表 本文提及的公開核酸序列和氨基酸序列使用核苷酸堿基和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫(如37C.F.R.1.822中定義的)示出。至少在某些情況情況下，僅顯示每個(gè)核酸序列的一條鏈，但任何對所顯示鏈的提及應(yīng)理解為將互補(bǔ)鏈包括在內(nèi)。序列表以命名為Sequence_Listing.txt的文件形式作為ASCII文本文件提交,該文件創(chuàng)建于2011年9月2日，28，991字節(jié)，其以引用的方式納入本文。SEQ ID NO:1是胰島素B: 16-23肽的氨基酸序列。SEQ ID NO: 2是rIAg7RTL氨基酸73-80的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是胰島素B:9_23肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:4 是 rIAg7RTL 的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是人髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG) 35-55肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是小鼠M0G35-55肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:7是胰島素B:9_23C18變體的氨基酸序列。SEQ ID N0:8是胰島素B:9_23C20變體的氨基酸序列。SEQ ID N0:9是胰島素B:9_23C19A變體的氨基酸序列。SEQ ID NO: 10是rIAg7RTL氨基酸15-25的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是示例性DR2RTL的氨基酸序列。SEQ ID NO: 12 是 hM0G35_55S42C 變體的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13 是 hM0G35_55P43C 變體的氨基酸序列。
SEQIDNO: 14 是 r1-Ab RTL 的氨基酸序列。SEQIDN0:15 是 mM0G35-55S45C 變體的氨基酸序列。SEQIDNO: 16是蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP) 139-151的氨基酸序列。SEQIDNO: 17是谷氨酸脫羧酶(GAD) 207-220肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 18是雞卵溶菌酶(HEL) 11-25肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 19是示例性DP2RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:20是示例性DQ2RTL的氨基酸序列。SEQIDNO: 21-24是示例性MOG肽的氨基酸序列。SEQIDN0:25_30是示例性髓磷脂堿性蛋白(MBP)肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 31是示例性PLP肽的氨基酸序列。SEQIDNO:32-35是示例性膠原II型肽的氨基酸序列。SEQIDNO:36是光間受體視黃類物質(zhì)結(jié)合蛋白(IRBP) 1177-1191肽的氨基酸序列。SEQIDN0:37是抑制蛋白291-310肽的氨基酸序列。SEQ IDNO: 38是光傳感因子65-96肽的氨基酸序列。SEQIDN0:39_42是示例性恢復(fù)蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDN0:43_46是示例性血纖蛋白原α肽的氨基酸序列。SEQIDΝ0:47_50是示例性波形蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 51是α -烯醇化酶5-21肽的氨基酸序列。SEQIDNO:52是人軟骨糖蛋白39259-271肽的氨基酸序列。SEQIDNO: 53和54是示例性α 2_麥醇溶蛋白肽的氨基酸序列。SEQIDΝ0:55是示例性DR3RTL的氨基酸序列。SEQIDΝ0:56是示例性DR4RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:57是示例性IAs RTL的氨基酸序列。SEQIDNO:58是示例性大鼠RTL B RTL的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式雖然使用分離的MHC/抗原復(fù)合物的概念在治療和診斷應(yīng)用中具有很好的前景，但是到目前為止報(bào)道的多種方法的主要缺點(diǎn)是所述復(fù)合物是大體積的并且因此而難于產(chǎn)生和操作。該方面的一個(gè)重大突破是重組T細(xì)胞配體或RTL的開發(fā)。RTL包含與I類MHC分子或II類MHC分子的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的可溶性單鏈多肽?？蓪㈦难b載至抗原結(jié)合裂隙，所述RTL-肽復(fù)合物可用于若干調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方法的任一種。RTL的缺點(diǎn)是，肽僅通過非共價(jià)結(jié)合相互作用結(jié)合至所述抗原裂隙中，因此所述復(fù)合物是較不穩(wěn)定的。已經(jīng)用抗原決定簇構(gòu)建RTL，所述抗原決定簇作為所述重組MHC多肽的遺傳編碼氨基末端延伸而被包括在內(nèi)。這些復(fù)合物是穩(wěn)定的，然而它們必須被單獨(dú)設(shè)計(jì)并且其產(chǎn)生非常耗時(shí)。本文公開了組合物，其中所述抗原決定簇通過二硫鍵與所述RTL多肽(例如β I a IMHC II類RTL多肽或α I a 2MHC I類RTL多肽)共價(jià)連接。在β I α I多肽的情況下，所述RTL多肽和所述抗原決定簇之間的二硫鍵打斷了所述β I亞基的內(nèi)部二硫鍵。出人意料地，即使當(dāng)該內(nèi)部二硫鍵被打斷時(shí)，所述RTL仍維持其結(jié)構(gòu)和功能。此外,所述二硫鍵提供了所述抗原決定簇和所述MHC多肽之間的穩(wěn)定連接。該穩(wěn)定相互作用對于旨在給予受試者的藥物組合物(不管是維持效力還是效能)，以及滿足對該類組合物的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。此外，所公開的組合物可通過用選擇的抗原決定簇簡單地裝載RTL來快速且方便地產(chǎn)生，有助于這類組合物的產(chǎn)生和測試。這些組合物也顯示出治療或抑制受試者中疾病或病癥(例如自身免疫性疾病)的效能增加。一些肽抗原包含翻譯后修飾(例如糖基化或瓜氨酸化)。在人風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，異常免疫應(yīng)答的關(guān)鍵靶標(biāo)是已進(jìn)行瓜氨酸化的蛋白。類似地，已經(jīng)表明MBP的瓜氨酸化在多發(fā)性硬化的病理中起重要作用，病理環(huán)境中人MBP上有六個(gè)位點(diǎn)被瓜氨酸化。這些經(jīng)修飾的肽抗原不能在先前描述的RTL (美國專利N0.6，270, 772 ;美國專利公開N0.2005/0142142)的氨基末端被基因編碼，本文描述的化學(xué)過程可提供對該問題的可行解決方案。抗原決定簇和MHC多肽之間的二硫鍵的另一優(yōu)點(diǎn)是，在內(nèi)化后該鍵維持直至所述復(fù)合物到達(dá)內(nèi)涵體深處，在那里所述抗原決定簇被通過Y干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)切割。然后，所述抗原決定簇可被重新裝載到全長(天然)MHC II類分子上以在細(xì)胞表面呈遞，并且可產(chǎn)生致耐受性應(yīng)答。1.縮寫和術(shù)語APC 抗原呈遞細(xì)胞EAE 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎FACS 熒光激活的細(xì)胞分揀GAD 谷氨酸脫羧酶GILT Y干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶HEL 雞卵溶 菌酶HLA 人白細(xì)胞抗原IAA 碘乙酰胺IRBP 光間受體視黃類物質(zhì)結(jié)合蛋白MBP 髓磷脂堿性蛋白MHC 主要組織相容性復(fù)合物MOG 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白NOD 非肥胖糖尿病小鼠PLP 蛋白脂質(zhì)蛋白R(shí)TL 重組T細(xì)胞受體配體SDS 十_■燒基硫酸納除非另有說明，技術(shù)術(shù)語依其常規(guī)用法使用。常用的分子生物學(xué)術(shù)語的定義可以在牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press) 1994年出版的Benjamin Lewin的《基因V》(Genes V)，(ISBN0-19-854287-9)) ;Kendrew等主編的《分子生物學(xué)百科全書》(The Encyclopedia of Molecular Biology), Blackwell Science Ltd.，1994 出版(ISBN0-632-02182-9)和Robert A.Meyers主編的《分子生物學(xué)和生物技術(shù):綜合案頭參考〉〉(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference), VCHPublishers, Inc.，1995 出版(ISBN1-56081-569-8)中找到。為了有助于閱讀各個(gè)實(shí)施方案，提供了以下對一些術(shù)語的解釋:
β Ια I多肽:以共價(jià)鍵包含MHC II類分子的α I結(jié)構(gòu)域和β I結(jié)構(gòu)域的重組多肽。為了確保合適的構(gòu)象，這類多肽的取向應(yīng)使得所述β I結(jié)構(gòu)域的羧基端與所述α I結(jié)構(gòu)域的氨基酸共價(jià)連接。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述多肽是人β I α I多肽，對于人MHC II類分子來說，所述多肽包括α I結(jié)構(gòu)域和β I結(jié)構(gòu)域。人β I α I多肽的一個(gè)具體非限制性實(shí)例是其中所述β I結(jié)構(gòu)域羧基端與HLA-DR分子的α I結(jié)構(gòu)域的氨基端共價(jià)連接的分子。人β I α I多肽的另一個(gè)具體非限制性實(shí)例是其中所述βI結(jié)構(gòu)域的羧基端與HLA-DR (Α或B)、HLA-DP (A和B)或HLA-DQ (A和B)分子的α I結(jié)構(gòu)域的氨基端共價(jià)連接的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述β α I多肽不包括β 2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述β I α I多肽不包括α 2結(jié)構(gòu)域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述β I α I多肽既不包括α 2結(jié)構(gòu)域也不包括β 2結(jié)構(gòu)域。示例性β I α I多肽被描述于美國專利N0.6，270, 772、美國專利公開 N0.2005/0142142 中，并在本文提供(例如 SEQ ID N0:4、ll、14、19、20 和 55-58)。

β I α I基因:含有編碼β I α I多肽的核酸序列的重組核酸分子。在一些實(shí)施方案中，β I α I基因包括可操作地連接到編碼β I α I多肽的核酸上的啟動(dòng)子區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所編碼的β I α I多肽是人β I α I多肽。α I α 2多肽:以共價(jià)鍵包含MHC I類分子的α I結(jié)構(gòu)域和α 2結(jié)構(gòu)域的多肽。這類多肽的取向應(yīng)使得所述α I結(jié)構(gòu)域的羧基端與所述α 2結(jié)構(gòu)域的氨基端共價(jià)連接。α I α 2多肽包含不完整的I類α鏈，通常省略所述α鏈的α 3結(jié)構(gòu)域的大部分或全部。α I α 2多肽的具體非限制性實(shí)例是其中α I結(jié)構(gòu)域的羧基端與HLA-A分子、HLA-B分子或HLA-C分子的α 2結(jié)構(gòu)域的氨基端共價(jià)連接的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，從α I α 2多肽中省略所述α 3結(jié)構(gòu)域，因此所述α I α 2多肽不包括α 3結(jié)構(gòu)域。α I α 2基因:含有編碼α I α 2多肽的核酸序列的重組核酸分子。在一些實(shí)施方案中，α I α 2基因包括可操作地連接到編碼α α 2多肽的核酸的啟動(dòng)子區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所編碼的α I α 2多肽是人α I α 2多肽?？乖?能夠在動(dòng)物體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì),包括被注射或吸收進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的組合物。抗原與特異性的體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，所述產(chǎn)物包括由異源免疫原誘導(dǎo)的產(chǎn)物。術(shù)語“抗原”包括了所有相關(guān)的抗原表位和抗原決定簇，例如在本文公開的重組MHC分子的情形中存在的抗原肽。自身免疫性疾病:免疫系統(tǒng)對內(nèi)源性抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(例如B細(xì)胞應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答)且引起組織損傷的疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于:多發(fā)性硬化、I型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性貧血、重癥肌無力和愛迪生氏病。保守置換或變體:氨基酸殘基被具有類似生物化學(xué)性質(zhì)的另外的氨基酸殘基置換。肽可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，例如1-10個(gè)保守置換、2-5個(gè)保守置換、4-9個(gè)保守置換，例如1、2、5或10個(gè)保守置換。保守置換的具體非限制性實(shí)例包括以下實(shí)例:
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含: 含有共價(jià)連接的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的分離的重組MHC多肽和通過二硫鍵與所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接的抗原決定簇，其中: 所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類β I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類α I結(jié)構(gòu)域，并且其中所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述第一結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，并且其中所述MHC II類分子不包括α 2結(jié)構(gòu)域或β 2結(jié)構(gòu)域；或 所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α 2結(jié)構(gòu)域，并且其中所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述第一結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，并且其中所述MHC I類分子不包括α 3結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述二硫鍵包含所述抗原決定簇中的半胱氨酸殘基和所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域包含βI結(jié)構(gòu)域，所述半胱氨酸殘基包含半胱氨酸17、半胱氨酸79或它們的組合。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的組合物，其中所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)連接包含肽接頭。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽接頭的長度為至少6個(gè)氨基酸。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗原決定簇包含肽抗原。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述抗原決定簇包含8-35個(gè)氨基酸。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗原決定簇包括M0G35-55、胰島素Β:9-23或PLP139-151。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗原決定簇的半胱氨酸殘基包含非天然存在的半胱氨酸，所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基包含非天然存在的半胱氨酸，或者它們的組合。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的組合物，其中所述重組MHC多肽在溶液中的聚集傾向降低。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述重組MHC多肽包括DR2MHCβ Ia I多肽，所述重組MHC多肽含有一個(gè)或多個(gè)疏水性殘基被極性殘基或荷電殘基置換，其中所述一個(gè)或多個(gè)殘基選自SEQ ID NO: 11的V102、I104、A106、F108和L110，從而與未改性的重組MHC多肽相比在溶液中的聚集降低。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的組合物，還包含可藥用載體。
13.一種治療或抑制受試者中選自以下的疾病的方法:自身免疫性疾病、視網(wǎng)膜疾病、葡萄膜炎、中風(fēng)和由藥物成癮引起的認(rèn)知損傷或神經(jīng)精神障礙，所述方法包括:給予所述受試者有效量的權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的組合物,從而治療或抑制所述疾病。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述自身免疫性疾病選自:多發(fā)性硬化、I型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳糜瀉、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性貧血、重癥肌無力、視神經(jīng)炎和愛迪生氏病。
15.一種治療或抑制受試者中I型糖尿病的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的含有分離的重組MHC多肽以及抗原決定簇的組合物，從而治療或抑制受試者中的I型糖尿病，所述分離的重組MHC多肽包含共價(jià)連接的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類β I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類a I結(jié)構(gòu)域，并且其中所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述第一結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，并且其中所述MHC II類分子不包括α 2結(jié)構(gòu)域或β 2結(jié)構(gòu)域，所述抗原決定簇通過二硫鍵與所述重組MHC多肽的第一結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗原決定簇包含胰島素。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的方法，其中所述抗原決定簇包含胰島素B:9-23或胰島素 B: 16-23。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述胰島素B:9-23包含SEQID NO: 1、3和7_9中任一個(gè)的氨基酸序列。
19.一種產(chǎn)生組合物的方法，所述方法包括: 在足以在抗原決定簇和分離的重組MHC多肽之間形成二硫鍵的條件下，將所述抗原決定簇與所述重組MHC多肽接觸，從而產(chǎn)生所述組合物，所述分離的重組MHC多肽包含共價(jià)連接的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中: 所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類β I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC II類α I結(jié)構(gòu)域，并且其中所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述第一結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，并且其中所述MHC II類分子不包括α 2結(jié)構(gòu)域或β 2結(jié)構(gòu)域；或 所述第一結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α I結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是哺乳動(dòng)物MHC I類α 2結(jié)構(gòu)域，并且其中所述第二結(jié)構(gòu)域的氨基端與所述第一結(jié)構(gòu)域的羧基端共價(jià)連接，并且其中所述MHC I類分子不包括ci3。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述足以形成二硫鍵的條件包括在將所述抗原決定簇在ρΗ6.5 的 IOOmM NaP04
21.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1的組合物的試劑盒，包括: 重組MHC多肽或編碼所述重組MHC多肽的核酸；和 用于提供足以在所述重組MHC多肽和抗原決定簇之間形成二硫鍵的條件的包含一種或多種組分的溶液。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述溶液包含pH6.5的100mMNaP04、150mM NaCl,0.05%SDS 和 0.01%NaN3。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的試劑盒，還包含抗原決定簇。
24.由權(quán)利要求19的方法產(chǎn)生的組合物。
全文摘要
本文公開了含有通過二硫鍵與抗原決定簇共價(jià)連接的MHC I類或MHC II類重組體T細(xì)胞受體配體RTL多肽的穩(wěn)定復(fù)合物。還公開了制備該組合物的方法和使用方法，例如用于治療或抑制疾病，例如自身免疫性疾病。
文檔編號A61K39/00GK103221424SQ201180052661
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者G·G·伯羅斯 申請人:俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)