專利名稱：含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物及其制造方法。
背景技術(shù)：
在磷脂中，已知磷脂酰絲氨酸在腦中具有生理機(jī)能。作為制造磷脂酰絲氨酸的方法，已知有使磷脂酶D作用于磷脂酰膽堿從而得到磷脂酰絲氨酸的方法(專利文獻(xiàn)I和專利文獻(xiàn)2) 。另一方面，作為磷脂之一的溶血磷脂是指I個(gè)脂肪酸鍵合于甘油骨架而成的磷月旨，由于溶血磷脂的分子量比一般磷脂小，可以認(rèn)為其在體內(nèi)的吸收性高。因此，具有溶血磷脂和磷脂酰絲氨酸這兩者的結(jié)構(gòu)的溶血磷脂酰絲氨酸在體內(nèi)易于被吸收，可以期待其具有優(yōu)異的生理活性。在溶血磷脂中，2-?；?溶血磷脂在甘油骨架的sn-Ι位不具有脂肪酸，僅在sn_2位具有脂肪酸。已知與僅sn-Ι位具有脂肪酸的1-?；?溶血磷脂相比，2-酰基-溶血磷脂的界面張力、表面張力和乳化穩(wěn)定性優(yōu)異(例如，專利文獻(xiàn)3)。2-?；?溶血磷脂通過(guò)將磷脂sn-Ι位的酯鍵水解、分離出脂肪酸而得到。作為進(jìn)行sn-Ι位酯鍵的水解的酶，已知有磷脂酶Al，專利文獻(xiàn)4中公開(kāi)了使用提取自魚(yú)類的卵巢中的磷脂酶Al，將磷脂轉(zhuǎn)化為2-酰基-溶血磷脂的方法。另外，專利文獻(xiàn)5中公開(kāi)了使用由微生物產(chǎn)生的磷脂酶Al，將磷脂轉(zhuǎn)化為2-酰基-溶血磷脂的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)平9-121879號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2002-218991號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)平9-227895號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi)2006-197842號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本特開(kāi)2006-325485號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題然而，使用磷脂酰膽堿或磷脂酰絲氨酸作為磷脂的情況下，存在以下問(wèn)題:即使利用磷脂酶Al進(jìn)行sn-Ι位的脂肪酸的水解反應(yīng)，磷脂酶Al對(duì)磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)性也差、磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)低。因此，本發(fā)明的目的在于，在制造含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物時(shí)，提高利用磷脂酶Al由磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)。用于解決問(wèn)題的方案本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改良磷脂酶Al的酶反應(yīng)條件，磷脂酶Al對(duì)磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)性提高，可以提高溶血化率。
即，本發(fā)明提供一種含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法，其包括:(a)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有磷脂酰絲氨酸的組合物的工序、以及(b)在選自由下述(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使磷脂酶Al作用于前述含有磷脂酰絲氨酸的組合物，從而得到含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序，其中，(I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽，(II)為樹(shù)膠(gum)類，(III)為乳化劑。
另外，本發(fā)明提供一種含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法，其包括:(c)在選自由下述(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使磷脂酶Al作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰膽堿的組合物的工序、以及(d)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于所述含有2-酰基-溶血磷脂酰膽堿的組合物，從而得到含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序，其中，(I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽，(II)為樹(shù)膠類，(III)為乳化劑。
根據(jù)這些方法，通過(guò)在選自⑴、(II)和(III)中的特定添加劑的存在下進(jìn)行磷脂酶Al的酶反應(yīng)，磷脂酶Al對(duì)磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)性提高，可以提高由磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)。
優(yōu)選的是，添加劑至少包含⑴、且I價(jià)陽(yáng)離子的鹽的濃度為0.25 2.0M0通過(guò)在鹽濃度處于該范圍的添加劑的存在下進(jìn)行酶反應(yīng)，可以進(jìn)一步提高溶血化率。
另外，優(yōu)選的是，添加劑至少包含(I)、且I價(jià)陽(yáng)離子的硫酸鹽為硫酸銨和/或硫酸鈉。添加劑為硫酸銨和/或硫酸銨時(shí)，可以進(jìn)一步提高溶血化率。
另外，優(yōu)選的是，添加劑至少包含(II)、且樹(shù)膠類為選自由黃原膠、瓜爾豆膠、羅望子膠、他拉膠、阿拉伯膠和刺槐豆膠組成的組中的一種以上。另外，優(yōu)選的是，添加劑至少包含(III)、且乳化劑為選自由蔗糖脂肪酸酯系乳化劑、聚甘油脂肪酸酯系乳化劑和聚山梨酯系乳化劑組成的組中的一種以上。通過(guò)這些添加劑也可以進(jìn)一步提高溶血化率。
另外，含有磷脂酰膽堿的原料優(yōu)選衍生自海產(chǎn)品和/或衍生自植物。衍生自海產(chǎn)品的磷脂酰膽堿多是在sn-2位包含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不飽和脂肪酸而構(gòu)成的，所得到的2-?；?-溶血磷脂酰絲氨酸為在sn-2位鍵合有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等高度不飽和脂肪酸而成的2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸。另外，使用衍生自植物的磷脂酰膽堿作為原料時(shí)，可以提高溶血化率。
另外，本發(fā)明提供一種含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，相對(duì)于固體成分以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)含有26 51%的溶血磷脂。更優(yōu)選相對(duì)于固體成分以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)含有37 51%的溶血磷脂。另外，含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物中的溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)優(yōu)選為40 73%，更優(yōu)選為57 73%。另外，2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸優(yōu)選為在sn-2位鍵合有高度不飽和脂肪酸的2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸，該高度不飽和脂肪酸優(yōu)選為二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸具有改善記憶學(xué)習(xí)能力等的生理活性，因此可以認(rèn)為鍵合有這些脂肪酸的2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸也具有同樣的生理活性。這樣的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物是根據(jù)上述制造方法首次得到的。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的方法，在制造含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物時(shí)，可以提高利用磷脂酶Al由磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)。


圖1是對(duì)本發(fā)明方法所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法進(jìn)行說(shuō)明的流程圖。
具體實(shí)施例方式以下，適當(dāng)參照所附的附圖，對(duì)本發(fā)明的方法詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。圖1是對(duì)本實(shí)施方式所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法進(jìn)行說(shuō)明的流程圖。本實(shí)施方式的方法可以大致分為圖1所示的途徑I的方法和途徑2的方法。途徑I和途徑2在以下方面是共通的:它們都是使用含有磷脂酰膽堿的原料作為原料，使用磷脂酶Al (PLAl)和磷脂酶D (PLD)作為酶，得到含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物作為最終產(chǎn)物。不同點(diǎn)是進(jìn)行PLAl和PLD的酶反應(yīng)的順序。也就是說(shuō)，在途徑I中，先進(jìn)行PLD的酶反應(yīng)(工序(a))，使PLAl對(duì)通過(guò)PLD的酶反應(yīng)而生成的產(chǎn)物起作用(工序(b))。另外，在途徑2中，先進(jìn)行PLAl的酶反應(yīng)(工序(c))，使PLD對(duì)通過(guò)PLAl的酶反應(yīng)而生成的產(chǎn)物起作用(工序(d))。本說(shuō)明書(shū)中只要沒(méi)有特別說(shuō)明，途徑I和2中可以使用相同的原料，也可以使用相同的酶(PLD或PLA1)。以下，關(guān)于途徑I和途徑2的方法，首先從途徑I的方法開(kāi)始進(jìn)行說(shuō)明。<關(guān)于途徑1>途徑I的方法包括:(a)在絲氨酸的存在下，使PLD作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有磷脂酰絲氨酸的組合物的工序、以及(b)使PLAl作用于含有磷脂酰絲氨酸的組合物，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序。首先，對(duì)工序(a)進(jìn)行說(shuō)明。工序(a)中所用的含有磷脂酰膽堿的原料只要富含磷脂酰膽堿就沒(méi)有特別限定。例如，可以使用作為一般的油脂制造原料而已知的大豆、菜種、亞麻、玉米、棉籽、向日葵、米胚芽、大麥、燕麥、紅花等衍生自植物的原料，以及魚(yú)油、魚(yú)肉、魚(yú)卵、魚(yú)的內(nèi)臟類、貝身、貝的內(nèi)臟類、牛肉、牛腦、豬肉、雞肉和蛋黃等衍生自動(dòng)物的原料。進(jìn)而，也可以將利用公知的方法由這些原料提取出的磷脂作為含有磷脂酰膽堿的原料而使用。原料所包含的磷脂酰膽堿優(yōu)選在sn-2位鍵合有高度不飽和脂肪酸。作為該高度不飽和脂肪酸并沒(méi)有特別限定，不飽和脂肪酸的碳原子數(shù)優(yōu)選16以上，更優(yōu)選18以上，進(jìn)一步優(yōu)選20以上。另外，不飽和脂肪酸的雙鍵的數(shù)目?jī)?yōu)選2以上，更優(yōu)選4以上，進(jìn)一步優(yōu)選5以上。另外，不飽和脂肪酸優(yōu)選為n-3脂肪酸或n-6脂肪酸，更優(yōu)選為n-3脂肪酸。具體而言，高度不飽和脂肪酸優(yōu)選 為二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，更優(yōu)選為DHA0作為包含具有DHA的磷脂酰膽堿的原料,例如可列舉出由墨魚(yú)、磷奸、金槍魚(yú)、鰹魚(yú)、鯖魚(yú)、沙丁魚(yú)、秋刀魚(yú)、竹莢魚(yú)、鮭魚(yú)子、扇貝和貽貝等魚(yú)類和貝類的組織提取而成的衍生自海產(chǎn)品的原料；由牛腦、基因重組豬和蛋黃等動(dòng)物組織提取而成的原料；以及由產(chǎn)生DHA的海洋細(xì)菌、藻類(小球藻屬等)等微生物提取而成的原料。因?yàn)槟~(yú)或磷蝦的磷脂大量含有在sn-2位鍵合有DHA的磷脂酰膽堿，進(jìn)一步優(yōu)選衍生自墨魚(yú)或磷蝦的原料。上述原料可以單獨(dú)使用或組合多種使用。
本發(fā)明的制造方法中，含有磷脂酰膽堿的原料可以溶解或懸浮于適合PLD的酶反應(yīng)的溶劑后使用。作為這樣的溶劑，例如可列舉出氯仿、醚、水、乙酸乙酯、石油醚、己烷、四氫呋喃、吡啶、二氯甲烷和緩沖液。這些溶劑中，優(yōu)選使用選自氯仿、水和醚中的至少一種。通常而言，據(jù)說(shuō)在磷脂的酶反應(yīng)中，醚具有活化磷脂酶的效果。然而，將目標(biāo)產(chǎn)物用于食品用途的情況下，由于對(duì)生物體無(wú)害，進(jìn)一步優(yōu)選使用水。上述溶劑按照目標(biāo)產(chǎn)物的用途等可以單獨(dú)使用或適當(dāng)組合多種而使用。
工序(a)中所用的磷脂酶D(PLD)對(duì)磷脂或溶血磷脂起作用，引起磷脂?；D(zhuǎn)化反應(yīng)，將鍵合于磷脂的磷酸基的膽堿轉(zhuǎn)化為絲氨酸。PLD存在于放線菌以及圓白菜、菠菜、花生等植物中，對(duì)于本發(fā)明的制造方法，只要磷脂?；D(zhuǎn)化反應(yīng)的效率良好就沒(méi)有特別限定，均可以使用。作為這樣的PLD，具體而言，可列舉出磷脂酶D (名糖產(chǎn)業(yè)公司制造)、磷脂酶D (Nagase ChemteX Corporatio n 制造)、憐脂酶 D (生化學(xué)工業(yè)公司制造)、PhospholipaseD(旭化成公司制造)和PLD(Biomol International, Inc.制造)等。對(duì)于本發(fā)明，優(yōu)選可列舉出磷脂酶D (名糖產(chǎn)業(yè)公司制造)和Phospholipase D (旭化成公司制造)。
工序(a)中，為了在絲氨酸的存在下使PLD作用于含有磷脂酰膽堿的原料，例如，可以使含有磷脂酰膽堿的原料溶解于反應(yīng)溶劑從而制作反應(yīng)溶液，向該反應(yīng)溶液中添加絲氨酸，向其中添加PLD。作為PLD的添加量，相對(duì)于Ig含有磷脂酰膽堿的原料優(yōu)選20 500單位，更優(yōu)選50 200單位，進(jìn)一步優(yōu)選100單位。作為酶反應(yīng)的反應(yīng)條件并沒(méi)有特別限定，例如，可以在酶的適合反應(yīng)條件的范圍內(nèi)作用。例如，作為反應(yīng)溫度優(yōu)選20 70°C，更優(yōu)選30 50°C，進(jìn)一步優(yōu)選40°C。另外，例如，作為反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選I 48小時(shí)，更優(yōu)選8 24小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選18小時(shí)。例如，作為反應(yīng)溶劑可以從以上所說(shuō)明的溶劑中選擇。對(duì)于本發(fā)明，優(yōu)選由水或緩沖液等水系溶劑和醚等有機(jī)溶劑構(gòu)成的2層體系的反應(yīng)，但在將目標(biāo)產(chǎn)物用于食品用途的情況下，優(yōu)選水或緩沖液等水系溶劑的反應(yīng)體系。例如，反應(yīng)PH優(yōu)選pH4.5 7.0，更優(yōu)選pH5.0 6.5，進(jìn)一步優(yōu)選pH5.5。另外，作為絲氨酸的添加量，相對(duì)于Ig含有磷脂酰膽堿的原料可以優(yōu)選使用0.5 2g,更優(yōu)選使用0.7 1.5g,進(jìn)一步優(yōu)選使用lg。另外，也可以向反應(yīng)溶液中加入PLD的反應(yīng)活化劑。作為這樣的反應(yīng)活化劑,例如可列舉出氯化鈣。使用氯化鈣作為反應(yīng)活化劑的情況下，相對(duì)于Ig含有磷脂酰膽堿的原料，氯化鈣以氯化鈣二水合物的形式，可以優(yōu)選使用0.5 2g，更優(yōu)選使用0.7 1.5g，進(jìn)一步優(yōu)選使用lg。
酶反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行適當(dāng)提取、濃縮、干燥等操作，可以由反應(yīng)溶液得到含有磷脂酰絲氨酸的組合物。
接著，對(duì)工序(b)進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的(b)工序中所用的磷脂酶Al (PLAl)對(duì)磷脂起作用，水解磷脂sn-Ι位的酯鍵并使鍵合于sn-Ι位的脂肪酸游離，從而生成2-?；?溶血磷脂。PLAl存在于動(dòng)物的胰臟和肝臟、魚(yú)類的卵巢、微生物等，對(duì)于本發(fā)明的制造方法，只要是水解sn-2位的酯鍵并使脂肪酸游離的情況較少、且能夠以高收率得到2-?；?溶血磷脂就沒(méi)有特別限定，均可以使用。作為這樣的PLA1，具體而言，可列舉出Aspergillus屬、Pseudomonas 屬、Shewanella 屬、Pseudoalteromonas 屬、Vibrio 屬和 Serratia 屬微生物產(chǎn)生的PLA1,以及由鰹魚(yú)、金槍魚(yú)、鯖魚(yú)、鮭魚(yú)、鱒魚(yú)和鱈魚(yú)等魚(yú)類的卵巢提取而成的PLA1。優(yōu)選磷脂酶Al (三菱化學(xué)公司制造)、Lecitase Ultra(注冊(cè)商標(biāo)，Novozymes.C0.Ltd.制造)、Lecitase Novo (注冊(cè)商標(biāo),Novozymes.C0.Ltd.制造)以及日本特開(kāi) 2006-325485 號(hào)中記載的可以由Pseudomonas sp.(HFK10020株)培養(yǎng)上清得到的PLAl等。若相對(duì)于磷脂過(guò)量添加PLAl,則不僅磷脂中的sn-Ι位的酯鍵會(huì)水解,連sn_2位的脂肪酸的酯鍵也會(huì)水解，存在目標(biāo)2-酰基-溶血磷脂的收量降低的可能，因此作為PLAl的添加量，相對(duì)于Ig含有磷脂酰絲氨酸的組合物優(yōu)選20 500單位，更優(yōu)選50 200單位，進(jìn)一步優(yōu)選100單位。工序(b)中，對(duì)于本發(fā)明的方法，通過(guò)在選自由下述的(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使PLAl作用，可以提高利用PLAl由磷脂轉(zhuǎn)化為2-酰基-溶血磷脂的比例(溶血化率)。(I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽，(II)為樹(shù)膠類，(III)為乳化劑。添加劑(I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽，因?yàn)槿苎首兊酶撸@些鹽中特別優(yōu)選I價(jià)陽(yáng)離子的硫酸鹽。I價(jià)陽(yáng)離子的硫酸鹽中，因?yàn)槿苎蔬M(jìn)一步變高，添加劑(I)優(yōu)選硫酸銨和/或硫酸鈉。例如，使用硫酸銨作為添加劑(I)時(shí)，優(yōu)選的是，硫酸銨在反應(yīng)體系中的濃度優(yōu)選約
0.25 2.0M，更優(yōu)選約1M。另外，例如，使用硫酸鈉作為添加劑(I)時(shí)，優(yōu)選的是，硫酸鈉在反應(yīng)體系中的濃度優(yōu)選約0.25 2.0M，更優(yōu)選約0.75M。通過(guò)加入這樣高濃度的鹽類，可以極大提高溶血化率。添加劑(II)為樹(shù)膠類。作為這樣的樹(shù)膠類，因?yàn)槿苎首兊酶撸瑑?yōu)選選自由黃原膠、瓜爾豆膠、羅望子膠、他拉膠、阿拉伯膠、刺槐豆膠組成的組中的一種以上。另外，若并用添加劑⑴和添加劑(II)，與單獨(dú)使用添加劑⑴或(II)的情況相比，可以進(jìn)一步提高溶血化率，因此優(yōu)選并用添加劑(I)和添加劑(II)。作為與添加劑(II)并用的添加劑(I)，優(yōu)選硫酸鹽，更優(yōu)選硫酸鈉或硫酸銨。另外，作為并用的添加劑(II)，優(yōu)選阿拉伯膠。添加劑(III)為乳化劑。作為這樣的乳化劑，因?yàn)槿苎首兊酶?，?yōu)選選自由蔗糖脂肪酸酯系乳化劑、聚甘油脂肪酸酯系乳化劑和聚山梨酯系乳化劑組成的組中的一種以上。另外，這些乳化劑優(yōu)選HLB (親水親油平衡，Hydrophile-Lipophile Balance)值為10以上。另外，若并用添加劑⑴和添加劑(III)，與單獨(dú)使用添加劑⑴或(III)的情況相比，可以進(jìn)一步提高溶血化率，因此優(yōu)選并用添加劑(I)和添加劑(III)。作為與添加劑
(III)并用的添加劑(I)，優(yōu)選硫酸鹽，更優(yōu)選硫酸鈉或硫酸銨。另外，作為并用的添加劑
(III)，優(yōu)選聚甘油脂肪酸酯系乳化劑或聚山梨酯系乳化劑。工序(b)中，為了在選自由(1)、(11)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下使PLAl作用于含有磷脂酰絲氨酸的組合物，例如，可以使(a)中所得到的含有磷脂酰絲氨酸的組合物溶解于反應(yīng)溶劑從而制作反應(yīng)溶液，向該反應(yīng)溶液中添加上述添加劑，向其中添加PLA1。作為酶反應(yīng)的反應(yīng)條件并沒(méi)有特別限定，例如，可以在酶的適合反應(yīng)條件的范圍內(nèi)作用。例如，作為反應(yīng)溫度優(yōu)選10 50°C，更優(yōu)選30 50°C。關(guān)于反應(yīng)時(shí)間，2-酰基-溶血磷脂產(chǎn)量隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，若超過(guò)適宜的反應(yīng)時(shí)間，則PLAl不僅會(huì)水解磷脂的sn-Ι位的酯鍵，還會(huì)引起sn-2位的酯鍵的水解，導(dǎo)致目標(biāo)2-?；?溶血磷脂的收率下降，因此優(yōu)選在適宜的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使PLAl作用。適宜的反應(yīng)時(shí)間是指1 24小時(shí),更優(yōu)選I 4小時(shí)。例如，作為反應(yīng)溶劑可列舉出由醚或乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和水等水系溶劑構(gòu)成的2層體系，或者水等水系溶劑的反應(yīng)體系。特別優(yōu)選使用醚作為溶劑，但在將目標(biāo)產(chǎn)物用于食品用途的情況下，優(yōu)選水等水系溶劑的反應(yīng)體系。例如，反應(yīng)PH優(yōu)選pH4 8，更優(yōu)選PH4.5 6.5，進(jìn)一步優(yōu)選pH6.5。
酶反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行適當(dāng)提取、濃縮、干燥等操作，可以由反應(yīng)溶液得到含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物。
<關(guān)于途徑2的方法>
接著，對(duì)途徑2的方法進(jìn)行說(shuō)明。途徑2的方法包括:(c)使磷脂酶Al (PLAl)作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰膽堿的組合物的工序、以及(d)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D (PLD)作用于含有2-酰基-溶血磷脂酰膽堿的組合物，得到含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序。
工序(c)是利用PLAl由磷脂得到2-?；?溶血磷脂的工序，可以使用與工序(b)相同的反應(yīng)條件。也就是說(shuō)，對(duì)于本發(fā)明的方法，在工序(c)中，通過(guò)在選自由(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使PLAl起作用，可以提高將磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)。PLAl可以使用工序(b)的說(shuō)明中所列舉出的物質(zhì)，添加劑(I)、(II)和(III)分別為工序(b)的說(shuō)明中所列舉出的添加劑(I)、(II)和(III)。另外，含有磷脂酰膽堿的原料可以使用工序(a)的說(shuō)明中所列舉出的原料。酶反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行適當(dāng)提取、濃縮、干燥等操作，可以由反應(yīng)溶液得到含2-?；?溶血磷脂酰膽堿的組合物。
工序(d)是將工序(C)中所得到的2-?；?溶血磷脂酰膽堿的磷酸基所鍵合的膽堿通過(guò)PLD的作用轉(zhuǎn)化為絲氨酸的工序，可以使用與工序(a)相同的反應(yīng)條件。例如，PLD、絲氨酸和反應(yīng)活化劑可以分別使用工序(a)的說(shuō)明中所列舉出的物質(zhì)。酶反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行適當(dāng)提取、濃縮、干燥等操作，可以由反應(yīng)溶液得到含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，使用途徑I或途徑2的任意方法，均可以提高PLAl對(duì)磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)性，可以提高磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂的比例(溶血化率)，以高收益得到目標(biāo)2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中的“溶血化率”可以根據(jù)實(shí)施例所記載的方法來(lái)決定。
本發(fā)明的方法中，為了得到含有2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，可以使用途徑I或途徑2的任意方法。
<關(guān)于2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸>
根據(jù)上述方法而得到的含有2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物優(yōu)選相對(duì)于固體成分的溶血磷脂含量較高。因?yàn)樵谥|(zhì)中溶血磷脂也具有優(yōu)異的生理活性機(jī)能。例如，相對(duì)于固體成分以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)含有26 51%的溶血磷脂，更優(yōu)選含有37 51%。另外，優(yōu)選組合物中的溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例較高。例如，溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)優(yōu)選為40 73%，更優(yōu)選為57 73%。需要說(shuō)明的是，上述“溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例”可以用(溶血磷脂 的含量)/(總磷脂的含量)X 100%來(lái)決定?！翱偭字暮俊焙汀叭苎字暮俊狈謩e可以根據(jù)實(shí)施例所記載的方法來(lái)決定。
進(jìn)而，組合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸優(yōu)選包含具有特定生理活性機(jī)能的脂肪酸。作為這樣的具有特定生理活性機(jī)能的脂肪酸，可列舉出高度不飽和脂肪酸。高度不飽和脂肪酸作為體內(nèi)的生理活性物質(zhì)而發(fā)揮作用。高度不飽和脂肪酸更優(yōu)選二十二碳六烯酸(DHA)和/或二十碳五烯酸(EPA)。已知這些高度不飽和脂肪酸各自具有改善記憶學(xué)習(xí)能力等的生理活性機(jī)能。這些高度不飽和脂肪酸中優(yōu)選DHA。DHA多含于魚(yú)類和貝類等海產(chǎn)品中，是生理活性機(jī)能特別優(yōu)異的高度不飽和脂肪酸。根據(jù)本發(fā)明的方法而提供的組合物所包含的2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸等溶血磷脂作為生理活性物質(zhì)而發(fā)揮作用。因此，配混根據(jù)本發(fā)明的方法所得到的組合物，可以提供賦予了生理活性機(jī)能的食品飲料和藥品。該情況下，根據(jù)本發(fā)明的方法所得到的上述組合物的溶血磷脂在組合物中的含量較高，因此即使組合物的配混量為少量也可以得到較高效果。另外，DHA、EPA等高度不飽和脂肪酸鍵合于組合物中所包含的2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的sn-2位時(shí)，可以提供賦予了改善記憶學(xué)習(xí)能力等優(yōu)異的生理活性機(jī)能的食品飲料和藥品。實(shí)施例以下，舉出實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限定。需要說(shuō)明的是，實(shí)施例中若無(wú)特別說(shuō)明，則“％”表示“w/v%”。以下所記載的總磷脂含量、溶血磷脂含量和溶血化率的分析方法是根據(jù)以下測(cè)定方法而得到的值。1.<總磷脂含量的分析方法>總磷脂含量根據(jù)以下方法來(lái)決定。(A):試樣溶液的測(cè)定波長(zhǎng)為500nm下的吸光度(B):總磷脂標(biāo) 準(zhǔn)液的測(cè)定波長(zhǎng)為500nm下的吸光度總磷脂含量(質(zhì)量％) = (A) / (B) X 100 (質(zhì)量%)將使試樣溶解于鹽酸甲醇并使其成為20mg/mL而成的溶液在65 °C下加熱30分鐘。返回至室溫后，向溶液中加入等量的水，接著加入等量的己烷，充分?jǐn)嚢杌旌?。將溶液離心分離(3000轉(zhuǎn)，5分鐘)后，將10 μ L溶液的下層添加至1.0mL下述組成的總磷脂分析用酶顯色試劑中。使該溶液在37°C下顯色20分鐘后，對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)為500nm下的吸光度(A)進(jìn)行測(cè)定?？偭字治鲇妹革@色試劑的組成:
權(quán)利要求
1.一種含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法，其包括: (a)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有磷脂酰絲氨酸的組合物的工序、以及 (b)在選自由下述(1)、(11)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使磷脂酶Al作用于所述含有磷脂酰絲氨酸的組合物，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序，其中， (I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽， (II)為樹(shù)膠類， (III)為乳化劑。
2.—種含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法，其包括: (c)在選自由下述(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使磷脂酶Al作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰膽堿的組合物的工序、以及 (d)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于所述含有2-?；?溶血磷脂酰膽堿的組合物，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序，其中， (I)為選自由I價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽， (II)為樹(shù)膠類，(III)為乳化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，所述添加劑至少包含所述(I)，所述I價(jià)陽(yáng)離子的鹽的濃度為0.25 2.0M。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述添加劑至少包含所述(I)，所述I價(jià)陽(yáng)離子的硫酸鹽為硫酸銨和/或硫酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述添加劑至少包含所述(II)，所述樹(shù)膠類為選自由黃原膠、瓜爾豆膠、羅望子膠、他拉膠、阿拉伯膠和刺槐豆膠組成的組中的一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述添加劑至少包含所述(III)，所述乳化劑為選自由蔗糖脂肪酸酯系乳化劑、聚甘油脂肪酸酯系乳化劑和聚山梨酯系乳化劑組成的組中的一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述含有磷脂酰膽堿的原料衍生自海產(chǎn)品和/或衍生自植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6中的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述含有磷脂酰膽堿的原料衍生自海廣品。
9.一種含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，相對(duì)于固體成分以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)含有26 51%的溶血磷脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，相對(duì)于固體成分以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)含有37 51%的溶血磷脂。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，所述含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物中的溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)為40 73%。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，所述含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物中的溶血磷脂相對(duì)于總磷脂的比例以質(zhì)量基準(zhǔn)計(jì)為57 73%。
13.根據(jù)權(quán)利要求9 12中的任一項(xiàng)所述的含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，所述2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸為sn-2位鍵合有高度不飽和脂肪酸的2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的含2-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其中，所述高度不飽和脂肪酸為二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求9 14中的任一項(xiàng)所述的含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物，其通過(guò)權(quán)利要求1 8中的任一項(xiàng)所述的方法得到。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的制造方法，其包括(a)在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D作用于含有磷脂酰膽堿的原料，從而得到含有磷脂酰絲氨酸的組合物的工序、以及(b)在選自由下述(I)、(II)和(III)組成的組中的一種以上添加劑的存在下，使磷脂酶A1作用于含有磷脂酰絲氨酸的組合物，從而得到含有2-?；?溶血磷脂酰絲氨酸的組合物的工序，其中，(I)為選自由1價(jià)陽(yáng)離子的、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽組成的組中的一種以上鹽，(II)為樹(shù)膠類，(III)為乳化劑。
文檔編號(hào)A61K31/685GK103140587SQ201180047811
公開(kāi)日2013年6月5日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者矢澤一良, 諏佐智之, 后藤祥二, 田代靖人, 川島順市, 今村茂行 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京海洋大學(xué), 株式會(huì)社明治