專利名稱：通過(guò)再生牙齒單元的移植來(lái)復(fù)原牙槽骨的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)再生牙齒單元的移植來(lái)復(fù)原牙槽骨的方法等。
背景技術(shù)：
牙齒由存在于牙齒周圍的牙周組織支撐。作為一種器官，牙齒本身最外層為琺瑯質(zhì)，內(nèi)層則具有稱為牙本質(zhì)的硬組織，進(jìn)而于其內(nèi)側(cè)有產(chǎn)生牙本質(zhì)的成牙質(zhì)細(xì)胞，中心部為牙髓。另一方面，牙周組織具有牙槽骨骨骼作為基座，在連接牙槽骨與牙根的部分，牙根的周圍有琺瑯質(zhì)以及牙周膜，以覆蓋牙槽骨的除與牙根相連部分以外的外層而形成牙齦。發(fā)生于牙周組織的疾病有牙齦因發(fā)炎而產(chǎn)生的牙齦炎，發(fā)炎深至牙周組織而產(chǎn)生的牙周炎，進(jìn)而發(fā)展至牙槽骨溶解而減少的牙槽膿溢(pyorrhea alveolaris)等。牙槽骨不幸溶解時(shí)即難以支持牙齒，進(jìn)而喪失牙齒。另外，因經(jīng)年持續(xù)的牙槽骨吸收，亦會(huì)變?yōu)殡y以支持牙齒。

另一方面,在牙齒本身患有疾病而失去牙齒時(shí),常會(huì)進(jìn)行移植物治療。此時(shí)為移植移植物，必須有可支持移植物的牙槽骨，而當(dāng)牙槽骨不足時(shí)，無(wú)法進(jìn)行移植物治療。另外，即使進(jìn)行移植物治療時(shí)仍具有充分的骨組織，但已知在移植物移植后，牙槽骨的吸收仍持續(xù)進(jìn)行。因此，目前對(duì)復(fù)原或再生已喪失的牙槽骨的技術(shù)已逐漸產(chǎn)生興趣。近年來(lái)使用GTR法(guidedtissue regeneration :引導(dǎo)組織再生)及Emdogain (注冊(cè)商標(biāo))治療牙周病。GTR法是在進(jìn)行牙周外科手術(shù)后，通過(guò)插入間隔膜，防止對(duì)牙齦上皮的牙槽骨側(cè)的侵入，可促進(jìn)牙周膜及牙槽骨等牙周組織垂直再生的方法。而Emdogain (注冊(cè)商標(biāo))是以牙釉基質(zhì)蛋白質(zhì)為主成分的藥劑，是使被破壞的牙周組織再生的方法。然而，任一種方法均難以促進(jìn)牙槽骨垂直地再生，特別對(duì)于大型牙槽骨再生，其效果并不充分。本發(fā)明人著眼于牙齒再生并發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用至今已知的間葉系細(xì)胞與上皮系細(xì)胞(其中，這些細(xì)胞中至少一種是衍生自牙胚的細(xì)胞)，在由例如膠原蛋白凝膠等所構(gòu)成的支持載體內(nèi)部，使實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的第一細(xì)胞凝集塊，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第二細(xì)胞凝集塊緊密接觸而配置，然后通過(guò)在該支持載體內(nèi)部培養(yǎng)第一及第二細(xì)胞凝集塊，可制得可有效誘導(dǎo)細(xì)胞分化且具備特有的細(xì)胞配置及方向性的再生牙胚及再生牙齒單元(例如參照專利文件I)。進(jìn)而，利用口腔內(nèi)上皮細(xì)胞及其初代培養(yǎng)細(xì)胞做為上皮系細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文件2)，利用羊膜衍生細(xì)胞作為間葉系細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文件3)，將全能干細(xì)胞經(jīng)分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞用作間葉系細(xì)胞時(shí)(例如參照專利文件4)，均顯示可獲得同樣具備特有的細(xì)胞配置及方向性的再生牙胚及再生牙齒單元。該再生牙齒在咬合及硬度等方面已顯示可與天生的牙齒同樣使用(例如參照專利文件5)。[在先技術(shù)文獻(xiàn)][專利文件]專利文件I :國(guó)際公開第2006/129672號(hào)公報(bào)
專利文件2 :特開2008-29756號(hào)公報(bào)專利文件3 :特開2008-206500號(hào)公報(bào)專利文件4 :特開2008-200033號(hào)公報(bào)專利文件5 :國(guó)際公開第2010/021340號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于復(fù)原牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨。
解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人為解決上述問(wèn)題反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙齒缺損部位，通過(guò)移植再生牙齒單元，相較于移植再生牙齒單元前，可使牙槽骨復(fù)原。亦即，本發(fā)明涉及一種用于對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法(牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨復(fù)原方法)，其包括將再生牙齒單元移植至該牙齒缺損的部位的步驟。在本發(fā)明的對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，該動(dòng)物為非人類的哺乳動(dòng)物。 本發(fā)明的對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，其包括下述步驟(a)制作再生牙胚的步驟，(b)將該再生牙胚置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制作再生牙齒單元的步驟，(C)將所述再生牙齒單元移植至哺乳動(dòng)物的牙齒缺損部位的步驟。本發(fā)明的牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨復(fù)原方法的一個(gè)實(shí)施方式，其包括下述步驟(a)制作再生牙胚的步驟，(b)將所述再生牙胚置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制作再生牙齒單元的步驟，所述哺乳動(dòng)物是與顎骨復(fù)原對(duì)象不同的個(gè)體，(C)將該再生牙齒單元移植至作為顎骨復(fù)原對(duì)象的哺乳動(dòng)物的牙齒缺損部位的步驟。本發(fā)明的牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨復(fù)原方法的一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體以緊密接觸的方式配置在支持載體內(nèi)部而對(duì)該再生牙胚進(jìn)行培養(yǎng)和維持，且間葉系細(xì)胞與上皮細(xì)胞中至少一方來(lái)自牙胚。本發(fā)明的牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨復(fù)原方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述(b)步驟是對(duì)配置于哺乳動(dòng)物活體內(nèi)的間隔構(gòu)件內(nèi)部的再生牙胚進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨復(fù)原方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述(b)步驟中，從哺乳動(dòng)物外部施加機(jī)械性的刺激。另外，根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，本發(fā)明也涉及用于上述牙槽骨復(fù)原方法的牙槽骨復(fù)原用再生牙齒單元。根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，本發(fā)明也涉及上述牙槽骨復(fù)原方法中使用的再生牙齒單元制作用再生牙胚。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)移植再生牙齒單元，復(fù)原哺乳動(dòng)物的牙槽骨。特別本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施方式涉及先前技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的牙槽骨在垂直方向的復(fù)原。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)移植使用間隔構(gòu)件所制作的再生牙齒單元的方法，即使于動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，亦可在不會(huì)受到來(lái)自該動(dòng)物的組織等過(guò)多壓力的情況下獲得再生牙齒周邊的牙周組織廣為發(fā)育的再生牙齒單元，而通過(guò)移植該再生牙齒單元，可使被移植的動(dòng)物的牙槽骨更好地復(fù)原。另外，作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)移植使用間隔構(gòu)件所制作的再生牙齒單元的方法，可在預(yù)防牙齒伸長(zhǎng)至所需程度以上的同時(shí)，促進(jìn)牙周組織發(fā)育而長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，且通過(guò)移植該再生牙齒單元，可使被移植的動(dòng)物的牙槽骨更好地復(fù)原。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，通過(guò)調(diào)整間隔構(gòu)件的大小及形狀為適合牙齒缺損部位的大小及形狀，通過(guò)移植使用該間隔構(gòu)件所培養(yǎng)制作的再生牙齒單元，可使再生 牙齒單元移植更容易成功，且使被移植的動(dòng)物的牙槽骨更好地復(fù)原。進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)移植由施加機(jī)械性的刺激所制作的再生牙齒單元的方法，即使在動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，也可獲得具有充分牙周組織的再生牙齒，通過(guò)移植該再生牙齒單元，可使被移植的動(dòng)物的牙槽骨更好地復(fù)原。


圖I是顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中在使用間隔構(gòu)件制造再生牙齒單元時(shí)，在配置于小鼠腎被膜下的間隔構(gòu)件內(nèi)進(jìn)行活體內(nèi)培養(yǎng)的再生牙胚的外觀的照片。圖2是使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元的顯微CT圖像。圖3是未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元的顯微CT圖像。圖4是表示于CT圖像上測(cè)定及計(jì)算使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(控制)、未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(非控制)、及天然牙齒的齒冠部的長(zhǎng)徑/短徑比的結(jié)果O圖5是表示于CT圖像上測(cè)定使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(控制)及未使用間隔構(gòu)件制作的再生牙齒單元(非控制)的長(zhǎng)度的結(jié)果。圖6是在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚期間施加機(jī)械性刺激而制作的再生牙齒單元與未施加刺激而制作的再生牙齒單元的HE染色照片。圖7是于CT圖像上測(cè)定在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚期間施加機(jī)械性刺激而制作的再生牙齒單元，與未施加刺激而制作的再生牙齒單元的牙周膜的寬度的結(jié)果。圖8是顯示將根據(jù)本發(fā)明方法制造的再生牙齒單元移植至顎骨的情形。圖9是顯示將根據(jù)本發(fā)明方法制造的再生牙齒單元移植至顎骨后O天、第14天、第30天的CT圖像。圖10是顯示將根據(jù)本發(fā)明方法制造的再生牙齒單元移植至顎骨后第30天的HE染色照片。圖11是示意性表示再生牙胚配置于間隔構(gòu)件內(nèi)的狀態(tài)的平面圖及側(cè)視圖。圖12是向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元的(a)立體圖像、(b)CT圖像、(C)CT剖面圖像。
圖13上排是未向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元的情況，下排是已向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元的情況，自左方依序?yàn)橐浦埠蟮贠天、第14天、第30天及經(jīng)過(guò)40天后缺損部位(移植部位)周邊的情形。圖14是缺損部位(移植部位)周邊于移植45天后的照片，其中左側(cè)為對(duì)照組，SP未向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元之情況，右側(cè)為移植例，即已向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元的情形。照片中虛線是表示移植時(shí)牙槽骨上端部的線，實(shí)線是表示移植45天后牙槽骨上端部的線。圖15是表示移植后于45天間再生牙槽骨量的圖示。左側(cè)為對(duì)照組，亦即未向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元之情況，右側(cè)為移植例，亦即已向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元時(shí)，再生的牙槽骨的骨量。圖16上排是對(duì)照組，亦即未向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元之情況，下排是移植例，亦即已向大型骨缺損模型移植再生牙齒單元時(shí)，缺損部位(移植部位)周邊之CT外觀圖像。左側(cè)圖像為移植O天后、中央為移植49天后。右側(cè)的圖是移植49天后的CT圖 像的放大圖，上排及下排均以虛線表示移植例的在移植49天后通過(guò)缺損部位(移植部位)牙槽骨上方的水平線。右側(cè)上排圖中將對(duì)照組缺損部位牙槽骨的上端部，與移植例的牙槽骨的上端部之垂直方向的差異以示意性的兩個(gè)箭頭表示。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所涉及的顎骨復(fù)原方法的第一個(gè)實(shí)施方式，是復(fù)原牙齒缺損的動(dòng)物的牙槽骨的方法，包括將再生牙齒單元移植至該牙齒缺損部位之步驟。本說(shuō)明書中，“牙齒”是具備內(nèi)層為牙本質(zhì)層且外層為琺瑯質(zhì)層的連續(xù)的組織，亦意指具有齒冠及牙根且具備方向性的組織。牙齒的方向性可根據(jù)齒冠及牙根的配置而特定。齒冠及牙根可基于形狀及組織染色等以目視確認(rèn)。齒冠是指具有琺瑯質(zhì)與牙本質(zhì)層構(gòu)造的部分，而牙根則未存在有琺瑯質(zhì)的層。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)組織染色等而容易地確定出牙本質(zhì)及琺瑯質(zhì)。另外，琺瑯質(zhì)因存在有成軸質(zhì)細(xì)胞可加以確定，而成軸質(zhì)細(xì)胞的存在則可通過(guò)有無(wú)軸原蛋白確認(rèn)。另一方面，牙本質(zhì)可通過(guò)存在有成牙質(zhì)細(xì)胞而確定，成牙質(zhì)細(xì)胞的存在則可通過(guò)有無(wú)牙本質(zhì)涎蛋白而確認(rèn)。釉原蛋白及牙本質(zhì)涎蛋白的確認(rèn)可使用該領(lǐng)域已知的方法容易地實(shí)施，例如可舉出原位雜交、抗體染色等。本說(shuō)明書中，牙齒的“缺損”是指不管缺損的原因，牙齒未存在于應(yīng)存在的場(chǎng)所的狀態(tài)。這包括了牙齒由于牙周病等疾病自然脫落之外，為了牙科治療而人為地拔除牙齒的情況等。“牙齒的缺損部位”，“缺損部位”及“缺損部”是指因拔牙等牙齒缺損而在牙齦中形成的部位，并未特別限制其形狀。另外，“牙齒的缺損部位”除了因牙齒缺損而產(chǎn)生的孔以外，亦包含為了植入物治療而通過(guò)削去牙槽骨等行為使人為的缺損部位的形狀改變之情況，及因牙槽骨吸收而自然地使缺損部位的形狀產(chǎn)生變化之情況。另外，只要能夠埋設(shè)再生牙齒單元即可，并未特別限制缺損部位及目標(biāo)牙齒的種類。本說(shuō)明書中缺損如臼齒般的大的牙齒時(shí)、缺損多個(gè)并排的小的牙齒時(shí)、或無(wú)論牙齒的顆數(shù)、在相當(dāng)于該范圍內(nèi)發(fā)生缺損時(shí)，均稱作“大型缺損”及“廣泛性缺損”。缺損部一般位于顎骨或口腔的牙槽骨等。本發(fā)明的牙槽骨的復(fù)原方法中，移植再生牙齒單元的對(duì)象，亦即牙齒缺損的哺乳動(dòng)物，只要是原本具有牙齒之哺乳動(dòng)物則無(wú)特別限制。牙齒缺損的動(dòng)物優(yōu)選是以與從中摘出用于制造再生牙齒的牙胚的動(dòng)物同種的動(dòng)物，更優(yōu)選是與摘出牙胚之個(gè)體相同的個(gè)體?？膳e出包括牛、馬、豬、犬、貓、小鼠等。也優(yōu)選是非人類的哺乳動(dòng)物。本說(shuō)明書中，“再生牙齒單元”是指通過(guò)培養(yǎng)再生牙胚并使再生牙胚所含的各種細(xì)胞分化后所得到的由牙齒與支持該牙齒的牙周組織所構(gòu)成的單元。再生牙齒單元中牙齒部分具有處于在作為下述牙齒發(fā)育階段的牙蕾與牙齒之間的階段的構(gòu)成。另外，牙周組織包含牙周膜與牙槽骨?！霸偕?齒單元”只要包含再生的牙齒的部分及再生的牙周組織的部分即可，其制造方法并未特別限定。作為再生牙齒單元的一種制作方法，可通過(guò)于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚而獲得再生牙齒單元。作為再生牙齒單元的另一個(gè)制作方法，可通過(guò)對(duì)再生牙胚進(jìn)行某種程度的長(zhǎng)時(shí)間的器官培養(yǎng)，而獲得再生牙齒單元。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)目視及CT (計(jì)算機(jī)斷層掃描)圖像等容易地確定出牙槽骨之形態(tài)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用已知的機(jī)器攝影獲得CT圖像及CT剖面圖像。CT攝影可使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用3D顯微X射線CT R mCT (Rigaku)，例如于90kV，150mA，斷層厚度IOmm之條件下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可于CT攝影后使用適當(dāng)?shù)膱D像解析軟件進(jìn)行圖像構(gòu)建及解析等。圖像解析軟件可使用例如小動(dòng)物用圖像匯整軟件i-VIEW type R，以及高分辨率3D/4D圖像解析軟件Imaris(Bitplane)。另外,本領(lǐng)域技術(shù)人員除前述外亦可使用相似機(jī)器設(shè)定至適當(dāng)?shù)臈l件，及利用相似圖像解析軟件進(jìn)行CT攝影及解析。牙周膜及牙骨質(zhì)可通過(guò)組織染色等容易地確定出形態(tài)。染色方法可使用例如一般的蘇木精-伊紅(HE)染色。進(jìn)行組織染色時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可先通過(guò)將樣品以4%多聚甲醒(Paraformaldehyde PFA)固定，再以10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫I丐，以石臘包埋，其后，制作厚度8 μ m的連續(xù)切片等步驟后，再進(jìn)行HE染色。另外本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可使用前述以外的一般的方法進(jìn)行組織染色，及進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。本說(shuō)明書中，“牙胚”是牙齒的可決定未來(lái)牙齒形狀的初期胚，即指在牙齒發(fā)育階段一般所使用的自蕾狀期(Bud stage)至鐘狀期(Bell stage)的那些，特別是為未發(fā)現(xiàn)蓄積作為牙齒硬組織特征的牙本質(zhì)及琺瑯質(zhì)的組織。另一方面，“牙蕾”是指較“牙胚”階段為后的階段期的組織，即自開始蓄積作為牙齒硬組織特征的牙本質(zhì)及琺瑯質(zhì)的階段開始，至牙齒自牙齦萌發(fā)出而表現(xiàn)一般牙齒功能之前的階段之組織。本說(shuō)明書中，“再生牙胚”是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，人工形成的牙胚。本說(shuō)明書中，“移植”是指于牙齒缺損部位配置再生牙齒單元并使其固定。移植時(shí)，優(yōu)選使再生牙齒單元的牙周組織部位配置于缺損部，且使牙齒的齒冠部分朝向口腔內(nèi)的位置。將再生牙齒單元配置于缺損部之后，優(yōu)選遵循一般的處理進(jìn)行縫合等。另外，當(dāng)喪失牙齒伴隨有牙槽骨量降低時(shí)，可對(duì)缺損部位使用GTR法(guided tissue regeneration :組織再生誘導(dǎo)法)等，亦可并用為了埋設(shè)植入物而在臨床上使用的已知的方法。本說(shuō)明書中，牙槽骨的“復(fù)原(回復(fù))”是指與再生牙齒單元移植前相比，缺損部位的骨量增大之意。一定范圍內(nèi)的骨量變化，例如可通過(guò)于應(yīng)測(cè)定骨量變化的部位，進(jìn)行經(jīng)時(shí)性的顯微CT攝影，再通過(guò)以整合的圖像處理軟件進(jìn)行解析，測(cè)定移植前及移植后該部位的骨體積之方法而測(cè)定。本發(fā)明之牙槽骨的骨量變化例如可使用該方法，通過(guò)測(cè)定缺損部位的頰側(cè)牙槽骨在移植前后的牙槽骨的體積而獲得。另外牙槽骨的復(fù)原是亦可由形態(tài)學(xué)方面確認(rèn)。亦即，若缺損部位在下顎，可發(fā)現(xiàn)牙槽骨的上端部位朝向上顎方向生長(zhǎng)，與移植前狀態(tài)相比變?yōu)槁∑馉顟B(tài)，反之，若缺損部位在上顎，可發(fā)現(xiàn)牙槽骨的下端部位朝向下顎方向生長(zhǎng)，與移植前狀態(tài)相比變?yōu)槁∑馉顟B(tài)。牙槽骨的復(fù)原亦可稱之為牙槽骨的再生。本說(shuō)明書中將該牙槽骨的復(fù)原及牙槽骨的再生，稱為牙槽骨垂直方向的復(fù)原及再生，或牙槽骨的垂直復(fù)原及再生。另外，牙槽骨是指顎骨中牙齒的周邊位置，且由于無(wú)法嚴(yán)格區(qū)別牙槽骨的邊界，本說(shuō)明書中牙槽骨的復(fù)原亦可包含牙槽骨周邊的顎骨的復(fù)原。以下將說(shuō)明本發(fā)明中所使用的再生牙齒單元。再生牙齒單元是通過(guò)制作及培養(yǎng)再生牙胚，可使再生牙齒的周圍形成牙周組織。再生牙胚可為以任一種方法制作的牙胚，例如可以按照包括使用間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞(其中至少一方來(lái)自牙胚)，使實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體以緊密接觸的方式配置之步驟，及于支持載體內(nèi)部培養(yǎng)第一及第二細(xì)胞集合體的步驟的方法而進(jìn)行制作。另外，在本說(shuō)明書中，為區(qū)別兩種細(xì)胞集合 體，盡管為便利起見將實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體稱為第一細(xì)胞集合體，但也可將實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體稱為第一細(xì)胞集合體，任一個(gè)細(xì)胞集合體被稱為第一細(xì)胞集合體均可，并不重要。本發(fā)明中“間葉系細(xì)胞”是指來(lái)自間葉組織的細(xì)胞及培養(yǎng)該細(xì)胞所得之細(xì)胞，“上皮系細(xì)胞”是指來(lái)自上皮組織的細(xì)胞及培養(yǎng)該細(xì)胞所得之細(xì)胞。另外，本發(fā)明中“牙周組織”是以牙齒為中心形成于外層的牙槽骨及牙周膜。對(duì)于牙槽骨及牙周膜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)組織染色等容易地確定其形態(tài)。“使實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體，與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體以緊密接觸的方式配置的步驟”，例如可參照專利文件I至4記載及特開2008-29757號(hào)公報(bào)的記載，本說(shuō)明書參照各文獻(xiàn)的公開內(nèi)容，合并且組合至此處。上述的第一細(xì)胞集合體及第二細(xì)胞集合體，可分別實(shí)質(zhì)上僅由間葉系細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)上僅由上皮系細(xì)胞構(gòu)成。“實(shí)質(zhì)上僅由間葉系細(xì)胞構(gòu)成”于本發(fā)明中，是指使某細(xì)胞集合體處于可實(shí)現(xiàn)與僅由間葉系細(xì)胞構(gòu)成時(shí)相同的功能，且盡量不含有除了成為間葉系細(xì)胞的細(xì)胞以外的物質(zhì)之狀態(tài)?！皩?shí)質(zhì)上僅由上皮系細(xì)胞構(gòu)成”情況亦相同。細(xì)胞集合體是指細(xì)胞呈現(xiàn)緊密接觸狀態(tài)，可為組織，亦可為由零散的細(xì)胞所調(diào)制的細(xì)胞凝集塊。使用組織時(shí)，優(yōu)點(diǎn)為可獲得細(xì)胞配置及形狀正確的牙齒，但有時(shí)會(huì)受限于可取得的量。由于細(xì)胞凝集塊亦可使用培養(yǎng)細(xì)胞，相較之下較易取得，所以是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的方法，即使使用細(xì)胞凝集塊，亦可獲得細(xì)胞配置及形狀正確的再生牙齒。構(gòu)成細(xì)胞集合體的間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞中至少一方是來(lái)自牙胚。借此，可再現(xiàn)在活體內(nèi)的細(xì)胞配置，且可有效地形成具有特殊構(gòu)造及方向性的牙齒。更優(yōu)選間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞均來(lái)自牙胚。該牙胚，從細(xì)胞分化階段的幼小性及均質(zhì)性的角度考慮，優(yōu)選是處于自蕾狀期至帽狀期的牙胚。作為來(lái)自除牙胚以外的間葉系細(xì)胞，亦可使用來(lái)自活體內(nèi)其他的間葉系組織的細(xì)胞。優(yōu)選為不含有血液細(xì)胞的骨髓細(xì)胞及間葉系細(xì)胞，更優(yōu)選是口腔內(nèi)間葉系細(xì)胞及顎骨內(nèi)部的骨髓細(xì)胞、來(lái)自頭神經(jīng)嵴細(xì)胞的間葉系細(xì)胞、可分化為該間葉系細(xì)胞的間葉系前驅(qū)細(xì)胞及其干細(xì)胞等。使用來(lái)自羊膜細(xì)胞用作為間葉系細(xì)胞的實(shí)例可參見專利文件3，使用經(jīng)分化誘導(dǎo)的全能干細(xì)胞的實(shí)例則記載于專利文件4，其公開的全文均作為本說(shuō)明書之參照而合并至此處。來(lái)自除牙胚以外的上皮系細(xì)胞，亦可使用來(lái)自活體內(nèi)其他的上皮系組織之細(xì)胞。優(yōu)選為皮膚及口腔內(nèi)的黏膜及牙齦的上皮系細(xì)胞，更優(yōu)選是皮膚及黏膜等可分化為經(jīng)分化的例如角化或錯(cuò)角化的上皮系細(xì)胞的未成熟的上皮系前驅(qū)細(xì)胞，例如非角化上皮細(xì)胞及其干細(xì)胞等。使用口腔內(nèi)上皮細(xì)胞及其初代培養(yǎng)細(xì)胞用作為上皮系細(xì)胞的實(shí)例可見專利文件2，其公開的全文均作為本說(shuō)明書之參照而合并至此處。牙胚及其他組織可采自哺乳動(dòng)物的靈長(zhǎng)類(例如人類、猴子等)、有蹄類(例如豬、牛、馬等)、小型嚙齒類哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔子等)，還可自犬、貓等各種動(dòng)物的顎骨采集。牙胚及組織的采取可直接適用一般用于采取組織的條件，在無(wú)菌狀態(tài)下取出，再保存于適當(dāng)?shù)谋４嬉杭纯?。另外，人類的牙胚可舉出第3大臼齒亦即為智齒的牙胚，除此之夕卜，還可舉出胎兒牙胚。從利用自家組織的觀點(diǎn)而言，以使用智齒的牙胚為優(yōu)選。另外，小鼠以使用胎齡10日至16日的牙胚為優(yōu)選。
調(diào)制來(lái)自牙胚的間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞時(shí)，首先將自周圍組織隔離的牙胚，依照形狀，分離成牙胚間葉組織及牙胚上皮組織。此時(shí)為容易進(jìn)行分離，亦可使用酶。酶可舉出分散酶(dispase)、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等。本發(fā)明中細(xì)胞凝集塊是指來(lái)自間葉組織或上皮組織的凝集細(xì)胞，可通過(guò)對(duì)將間葉組織或上皮組織分散后獲得的細(xì)胞進(jìn)行凝集，或?qū)υ擃惣?xì)胞進(jìn)行初代或繼代培養(yǎng)而獲得的細(xì)胞進(jìn)行凝集而調(diào)制。為了分散細(xì)胞，亦可使用分散酶、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。在調(diào)制細(xì)胞凝集塊前為獲得足夠的細(xì)胞數(shù)而進(jìn)行經(jīng)分散細(xì)胞的初代或繼代培養(yǎng)時(shí)，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可使用一般用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如可使用Dulbecco氏改良培養(yǎng)基(DMEM)等。為促進(jìn)細(xì)胞增殖可添加血清，或可添加取代血清的物質(zhì)例如FGF、EGF、PDGF等細(xì)胞增殖因子及轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清時(shí)之濃度，可依據(jù)當(dāng)時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)適當(dāng)?shù)丶右宰兏?，但一般可使用約10%。有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)，可適用一般的培養(yǎng)條件，例如于約37°C的溫度下置于5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。另外亦可適當(dāng)?shù)靥砑渔溍顾氐瓤股?。為使?xì)胞凝集，可例如將細(xì)胞懸濁液進(jìn)行離心處理。關(guān)于間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊，為確保二者于緊密接觸時(shí)有確實(shí)的細(xì)胞相互作用，優(yōu)選分別使其預(yù)先處于高密度狀態(tài)。高密度狀態(tài)是指具有與構(gòu)成組織時(shí)相同程度的密度，例如為5X107個(gè)/ml I X 109 個(gè)/ml，以 I X 108 個(gè)/ml I X 109 個(gè)/ml 為優(yōu)選，2X 108 個(gè)/ml 8X108 個(gè)/ml最佳。并未特別限定使細(xì)胞凝集塊處于高密度的方法，例如可將細(xì)胞通過(guò)離心處理后，使其凝集沉淀的方法而進(jìn)行。離心處理因不會(huì)損及細(xì)胞活性且可簡(jiǎn)便地高密度化而優(yōu)選。離心處理以給予離心力300Xg 1200Xg的旋轉(zhuǎn)數(shù)為優(yōu)選，500Xg IOOOXg為更優(yōu)選，時(shí)間以3分鐘 10分鐘為優(yōu)選。低于300Xg的離心處理，會(huì)有細(xì)胞密度無(wú)法充分提高的傾向，反之，較1200Xg為高的離心處理，有時(shí)會(huì)使細(xì)胞受損。通過(guò)離心分離調(diào)制高密度的細(xì)胞凝集塊時(shí)，一般可使用細(xì)胞離心分離用的試管等容器，調(diào)制細(xì)胞懸濁液后再進(jìn)行離心分離，留下作為沉淀物的細(xì)胞而盡可能去除上清液即可。此時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞以外的成份(例如培養(yǎng)液、緩沖液)優(yōu)選少于或等于細(xì)胞容量，最優(yōu)選未含有除目標(biāo)細(xì)胞以外的成分。將該高密度的細(xì)胞集合體以后述方法于支持載體內(nèi)使其緊密接觸，細(xì)胞緊密的接觸，可有效發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用。
目的為培養(yǎng)第一及第ニ細(xì)胞集合體所使用的支持載體，優(yōu)選不使細(xì)胞分散，且具備可保持細(xì)胞集合體緊密狀態(tài)的保持力。緊密接觸狀態(tài)是指上述之高密度的間葉系細(xì)胞及上皮系細(xì)胞之細(xì)胞集合體，在間葉系細(xì)胞與上皮系細(xì)胞的接觸面附近，亦維持相似程度的高密度狀態(tài)?？杀３志o密狀態(tài)的支持載體，例如使用膠原蛋白吋，以最終濃度為2mg/ml 3mg/ml來(lái)使用，亦即根據(jù)JIS-K6503-1996所述的方法(使用12. 7mm直徑的柱塞，測(cè)定下壓4mm所需要的荷重)，以可形成120g 250g的凝膠強(qiáng)度的濃度，以提供適合使用的適當(dāng)硬度。其他種類的支持載體，若為通過(guò)相同的評(píng)價(jià)方法可得相同的強(qiáng)度者，即可用作本發(fā)明之支持載體。另外可通過(guò)混合ー種或多種支持載體，獲得具有相當(dāng)于目標(biāo)凝膠強(qiáng)度的硬度之支持載體。作為支持載體，可使用與后述在間隔構(gòu)件內(nèi)配置的支持載體相同者。并未特別限定將第一及第ニ細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)的方法，細(xì)胞集合體為細(xì)胞凝集塊時(shí)，可例如將上述通過(guò)離心所得之沉淀物，以微注射針筒等插入支持載體內(nèi)而配置。細(xì)胞集合體為組織時(shí)，可使用注射針筒的針的前端等配置于支持載體內(nèi)的任意位置上。本發(fā)明中，并未限制將第一及第ニ細(xì)胞集合體與支持載體以緊密接觸的方式配置 的方法，例如，可將其中一種細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)之后，再通過(guò)將其他的細(xì)胞集合體以壓放在前述細(xì)胞集合體上方的方式配置，可使二者緊密接觸。更具體而言，通過(guò)適當(dāng)?shù)刈兏С州d體內(nèi)上述注射針筒的針的前端之位置，可將ー種細(xì)胞集合體壓放在其他細(xì)胞集合體之上。且細(xì)胞集合體使用上皮系組織或間葉系組織吋，以使該組織原本于牙胚中與間葉系組織或上皮系組織接觸的面，與另外的細(xì)胞集合體接觸而配置為優(yōu)選。另外，優(yōu)選在配置后包括固化支持載體的步驟。借此可使細(xì)胞進(jìn)ー步凝集，使細(xì)胞呈現(xiàn)更高密度狀態(tài)。例如使用膠原蛋白時(shí)，可通過(guò)于培養(yǎng)溫度下靜置數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘以進(jìn)行固化。此時(shí)，細(xì)胞集合體內(nèi)除細(xì)胞以外的成份愈少，愈可實(shí)現(xiàn)更高密度狀態(tài)。本發(fā)明中，“在支持載體的內(nèi)部培養(yǎng)第一及第ニ細(xì)胞集合體的步驟”，例如可以是專利文件I至4及特開2008-29757號(hào)公報(bào)所公開的步驟，該文獻(xiàn)公開之全文均作為本說(shuō)明書之參照而合并至此處。培養(yǎng)期可依配置于支持載體內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞集合體的狀態(tài)、培養(yǎng)條件、動(dòng)物種類等而異，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇。移植至口腔內(nèi)時(shí)為使其萌發(fā)為具功能性的牙齒，以至少培養(yǎng)I天為優(yōu)選，3天以上為更優(yōu)選。通過(guò)拉長(zhǎng)培養(yǎng)期，可使例如牙本質(zhì)及琺瑯質(zhì)的蓄積、齒冠的形成、以及牙根的形成，通過(guò)形成再生牙胚而推迸。為獲得所期望的狀態(tài)，可培養(yǎng)例如6天以上、30天以上、50天以上、100天以上或300天以上，亦可于培養(yǎng)途中，改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。在支持載體內(nèi)部的培養(yǎng)步驟，可単獨(dú)培養(yǎng)內(nèi)含第一及第ニ細(xì)胞集合體的支持載體，亦可于其他動(dòng)物細(xì)胞等的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。単獨(dú)培養(yǎng)支持載體時(shí)，培養(yǎng)條件可使用一般用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞之條件。另外于培養(yǎng)時(shí)可添加來(lái)自哺乳動(dòng)物的血清，亦可添加已知為可有效促進(jìn)該細(xì)胞増殖與分化的各種細(xì)胞因子。該細(xì)胞因子可舉出例如FGF、BMP等。從細(xì)胞集合體的氣體交換與營(yíng)養(yǎng)供給的角度考慮，以及從不與其他動(dòng)物細(xì)胞接觸及混和，且可全程于體外條件下進(jìn)行的角度而言，支持載體內(nèi)部的培養(yǎng)，以進(jìn)行器官培養(yǎng)為優(yōu)選。器官培養(yǎng)一般是使多孔性膜漂浮于適合動(dòng)物細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基上，再于該膜上裝載內(nèi)含第一及第ニ細(xì)胞集合體的支持載體后進(jìn)行培養(yǎng)。此處所使用的多孔性膜以具有許多約0. 3 5 Ii m的孔為優(yōu)選，例如可舉出Cell Culture Inserts (商品名)及IsoporeFilters (商品名)。本發(fā)明中使用的再生牙齒單元的制造方法中，在制作再生牙胚時(shí)，可將該再生牙胚置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)，可促進(jìn)再生牙齒的分化誘導(dǎo)及形成牙周組織，可形成具有更適合于本發(fā)明的牙周組織的再生牙齒單元。根據(jù)本發(fā)明的方法所得的牙齒，具有內(nèi)側(cè)為牙本質(zhì)，外側(cè)為琺瑯質(zhì)之牙齒特有細(xì)胞配置(構(gòu)造)，更優(yōu)選是于正確位置上具有牙齒的前端(齒冠)與牙根的方向性的牙齒，可充分達(dá)成牙齒的功能。因此，可廣泛利用為牙齒的替代物。另外，亦可用作為闡明牙齒的發(fā)育過(guò)程的研究工具。進(jìn)而，通過(guò)延長(zhǎng)培養(yǎng)期，除了牙齒以外，亦可使其形成支持固定牙齒于顎骨上的牙槽骨及牙周膜等牙周組織。借此可更加提高移植后的牙齒的實(shí)用性。 另外，亦可僅分離該牙周組織而加以利用。本發(fā)明使用的再生牙齒單元，可根據(jù)缺損部的大小及欲使其再生的牙齒的大小，制作調(diào)節(jié)適當(dāng)大小的牙齒。例如制作再生牙胚時(shí)，使前述的間葉系細(xì)胞集合體與前述的上皮系細(xì)胞集合體接觸而配置時(shí)，可使各細(xì)胞集合體形成近似的柱狀，此時(shí)，通過(guò)控制該柱的軸向的接觸長(zhǎng)度，形成具有期望長(zhǎng)度的単一方向的牙齒。例如通過(guò)使前述間葉系細(xì)胞集合體與前述上皮系細(xì)胞集合體的接觸長(zhǎng)度，為期望的再生牙齒齒冠寬度的±25%，可制作具有期望長(zhǎng)度的再生牙齒。構(gòu)成本發(fā)明使用的再生牙齒單元的牙齒，具有內(nèi)側(cè)為牙本質(zhì)，外側(cè)為琺瑯質(zhì)的牙齒特有細(xì)胞配置(構(gòu)造)，更優(yōu)選是于正確位置上具有牙齒的前端(齒冠)與牙根的方向性的牙齒，且可充分達(dá)成牙齒功能的牙齒。因此，可廣泛利用為天然牙齒的替代物。進(jìn)而本發(fā)明使用的再生牙齒單元，除了牙齒之外，具有將牙齒在顎骨上支持固定化的牙槽骨及牙周膜等牙周組織，借此，可進(jìn)而提高移植后顎骨的復(fù)原性。本發(fā)明其他實(shí)施方式有關(guān)的顎骨的復(fù)原方法所使用的再生牙齒單元，在哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，可使用間隔構(gòu)件進(jìn)行培養(yǎng)。更具體是在制作再生牙胚后，可將再生牙胚配置于間隔構(gòu)件內(nèi)，并將含再生牙胚的間隔構(gòu)件移植至哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)。本說(shuō)明書中，間隔構(gòu)件是在哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，用作防止再生牙胚的伸長(zhǎng)超過(guò)所需程度以上，配置成覆蓋再生牙胚的器具。另外，間隔構(gòu)件于例如在腎被膜下等活體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，可達(dá)到防止被膜的壓カ及活體內(nèi)的組織對(duì)再生牙胚施加過(guò)多壓カ之效果。只要間隔構(gòu)件的形狀可達(dá)成該目的，可為任何形狀。亦即，間隔構(gòu)件的形狀，只要可確保使具有期望的再生牙齒單元的尺寸(主要為長(zhǎng)度及厚度)的再生牙齒單元生長(zhǎng)的內(nèi)部空間即可。再生牙齒單元的長(zhǎng)度是指，從再生牙齒單元的牙齒部分未來(lái)為咬合面的部位，至未來(lái)為根尖的部位的長(zhǎng)度。在未來(lái)為根尖的部位的周圍形成牙周組織時(shí)，是指至其前端(距離未來(lái)為咬合面部位最遠(yuǎn)的部位)之距離。再生牙齒單元長(zhǎng)度的近似最大允許值是指在哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚后，所獲得的再生牙齒單元的長(zhǎng)度的可被允許的最大值。該近似最大允許值可根據(jù)移植再生牙胚的對(duì)象及部位，由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)丶右詻Q定。再生牙齒單元的厚度一般而言是指再生牙齒單元的齒冠部的厚度，但在未來(lái)為根尖的部位的周圍形成牙周組織時(shí)，是指具有牙周組織的部分的厚度。如同人類的牙齒，齒冠部的橫截面一般并非為完全的正方形或長(zhǎng)方形，不如說(shuō)是依據(jù)長(zhǎng)徑與短徑而定義。由于根據(jù)以往的發(fā)現(xiàn)，可相當(dāng)程度地控制再生牙胚的伸長(zhǎng)方向，因此于間隔構(gòu)件的內(nèi)部，可將于配置再生牙胚組合物時(shí)的再生牙胚組合物本身的方向，及于間隔構(gòu)件內(nèi)部的相對(duì)位置，依照期望伸長(zhǎng)的方向安排，且可任意調(diào)整。因此，為獲得期望的尺寸，可考慮再生牙胚組合物伸長(zhǎng)的方向，來(lái)設(shè)計(jì)間隔構(gòu)件的三維尺寸。一般而言，間隔構(gòu)件的內(nèi)部空間必須比期望的再生牙齒單元大。換言之，間隔構(gòu)件的內(nèi)部空間，可達(dá)成防止再生牙齒單元伸長(zhǎng)至最大允許值以上的作用。以下針對(duì)間隔構(gòu)件的形狀為上下開ロ的圓筒狀(環(huán)狀)之情況進(jìn)行說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以本說(shuō)明書之公開內(nèi)容為基礎(chǔ)，而可容易地設(shè)計(jì)具有期望形狀之間隔構(gòu)件。形狀為上下開ロ的圓筒狀(環(huán)狀)時(shí)，由于上下的開ロ部互通，可充分確保來(lái)自間隔構(gòu)件外部的營(yíng)養(yǎng)供給通路，而使得能夠形成再生牙齒單元。 另外，使用該圓筒狀(環(huán)狀)的間隔構(gòu)件時(shí)，使再生牙胚的伸長(zhǎng)方向?yàn)閳A筒環(huán)的橫向(亦即為圓筒的徑向)時(shí)，可將圓筒的縱向(亦即為圓筒的高度)，以可獲得期望的再生牙齒單元咬合面的厚度而設(shè)定，且不超過(guò)最大允許值。另外，可將圓筒的縱向(亦即為圓筒的高度)，以可獲得期望的再生牙齒單元牙周組織的厚度而設(shè)定，且不超過(guò)最大允許值。此時(shí)所期望的厚度及最大允許值，可根據(jù)對(duì)象動(dòng)物牙齒缺損部的大小及形狀而決定。再生牙齒單元的牙周組織形狀以形成為匹配作為移植對(duì)象的缺損部的大小及形狀，移植易成功，且容易實(shí)現(xiàn)骨整合而為優(yōu)選。為防止再生牙齒單元伸長(zhǎng)至所需程度以上的長(zhǎng)度，可將圓環(huán)的內(nèi)徑設(shè)定為期望的再生牙齒單元長(zhǎng)度的近似最大允許值。使用該圓筒狀的間隔構(gòu)件吋，以環(huán)的內(nèi)徑方向作為伸長(zhǎng)方向，以縱向(高度方向)作為再生牙齒單元的齒冠寬度而配置再生牙胚時(shí)，筒的高度于培養(yǎng)人類牙齒時(shí)以例如3-15mm為優(yōu)選，5-12mm為更優(yōu)選，培養(yǎng)小鼠牙齒時(shí)以例如0. 4-2. Omm為優(yōu)選，0. 6-1. 8mm為更優(yōu)選，其內(nèi)徑(內(nèi)直徑)于培養(yǎng)人類牙齒時(shí)以10-30mm為優(yōu)選，15-26mm為更優(yōu)選，培養(yǎng)小鼠牙齒時(shí)以0. 9-2. Omm為優(yōu)選，I. 2-1. 9mm為更優(yōu)選。進(jìn)而利用近似圓筒狀的間隔構(gòu)件時(shí)，將再生牙胚未來(lái)為咬合面之部位配置至間隔構(gòu)件的一面內(nèi)壁附近而面向此內(nèi)壁，且將未來(lái)為根尖的部位配置為朝向筒的內(nèi)徑方向，再生牙胚不會(huì)受到來(lái)自活體內(nèi)組織的過(guò)多壓力，且可防止再生牙胚伸長(zhǎng)至需要以上，并可與外部連通可確保物質(zhì)供給路徑。再生牙胚的咬合面不會(huì)因壓カ而損壞，可以自然形狀生長(zhǎng)，牙齒會(huì)往筒的直徑方向伸長(zhǎng)，一般在到達(dá)相對(duì)側(cè)壁之前，或到達(dá)后，可以未達(dá)最大允許值的長(zhǎng)度阻止其伸長(zhǎng)。再生牙胚可通過(guò)間隔構(gòu)件避免來(lái)自筒的水平方向的壓力，同時(shí)，可藉由間隔構(gòu)件的上端及下端免除大部分的來(lái)自上下方向的壓カ。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可不限于圓筒狀，達(dá)成本說(shuō)明書期望的目的，或可依據(jù)需求達(dá)成其他目的，在活體內(nèi)制造再生牙齒單元時(shí)，可使用具有任意的期望的形狀的間隔構(gòu)件。例如可舉出以底面為橢圓或多角形的對(duì)象，或球狀物來(lái)取代圓筒，但并未限定于此。本發(fā)明之間隔構(gòu)件的構(gòu)造使得，在內(nèi)部配置的再生牙胚可與間隔構(gòu)件外部連通。由于再生牙胚可接受來(lái)自哺乳動(dòng)物活體內(nèi)組織之營(yíng)養(yǎng)等供給，及受到動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞激素的作用，必須確保該物質(zhì)到達(dá)間隔構(gòu)件的再生牙胚之供給路徑。由于可與外部連通，不管間隔構(gòu)件的形狀、大小、個(gè)數(shù)如何，均可形成足夠物質(zhì)供給的孔。例如，具有如筒狀的部分的大孔為優(yōu)選，另外對(duì)間隔構(gòu)件整體而言，以具有如篩網(wǎng)般多數(shù)的小孔為優(yōu)選。另外，間隔構(gòu)件的材質(zhì)若可供物質(zhì)穿透，則有孔無(wú)孔均可。本發(fā)明使用的再生牙齒單元，在使用間隔構(gòu)件制造再生牙齒單元時(shí)，培養(yǎng)再生牙胚時(shí)所用之哺乳動(dòng)物，只要能夠在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚，則無(wú)特別限定，亦可為非哺乳動(dòng)物。例如牛、馬、豬、犬、貓、小鼠，以豬、小鼠為優(yōu)選。特別優(yōu)選是與牙胚組織相同種類的動(dòng)物。移植至與牙胚組織不同種的動(dòng)物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，以使用改造為免疫缺陷的動(dòng)物為優(yōu)選。適合活體內(nèi)育成的部位，為使動(dòng)物細(xì)胞的器官及組織盡可能的正常發(fā)育，以腎被膜下、腸系膜、皮下等為優(yōu)選。移植后的培養(yǎng)期依移植時(shí)牙齒的大小與要發(fā)育的牙齒的大小而異，一般可為3天 400天。例如移植至腎被膜下吋，雖依移植時(shí)牙胚的大小與使再生的牙齒的大小而異， 但以7天 60天為優(yōu)選。并未特別限定間隔構(gòu)件的材質(zhì)，優(yōu)選對(duì)來(lái)自活體組織的壓カ具有充分的硬度，例如可舉出金、銀、鐵、銅、鋁、聚こ烯、樹脂、牙科用樹脂、牙科用粘固劑等。本發(fā)明之再生牙齒單元的制造方法中，將再生牙胚配置于間隔構(gòu)件內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)之步驟，以在間隔構(gòu)件內(nèi)填滿支持載體，再將再生牙胚配置于支持載體內(nèi)進(jìn)行為優(yōu)選。支持載體只要可于其內(nèi)部培養(yǎng)細(xì)胞，則無(wú)特別限制，例如以凝膠狀、纖維狀、固體狀者為優(yōu)選，通過(guò)使用相關(guān)的支持載體，可進(jìn)而防止于活體內(nèi)對(duì)再生牙胚施加過(guò)多的壓力。本發(fā)明使用再生牙齒單元制造時(shí)所使用的支持載體可舉出例如膠原蛋白、瓊膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、CellMatrix (商品名)、Mebiolgel (商品名)、Matrigel (商品名)、彈性蛋白、纖維蛋白、層黏蛋白(Iaminin)、細(xì)胞外間質(zhì)混合物、聚こ醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/こ醇酸共聚合物(PLGA)等。其中，以具有適當(dāng)?shù)挠捕燃氨３至Φ哪z原蛋白、瓊膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、CellMatrix、Mebiolgel>Matr i ge I、細(xì)胞外間質(zhì)混合物、纖維蛋白、層黏蛋白為優(yōu)選。例如可使用液體狀的支持載體，在配置再生牙胚后再使其硬化。例如，以膠原蛋白溶液充滿間隔構(gòu)件內(nèi)部，在膠原蛋白溶液內(nèi)配置再生牙胚后，通過(guò)于37°C的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，可使膠原蛋白凝膠化。接著，可再將置于間隔構(gòu)件的再生牙胚，配置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方式，以間隔構(gòu)件制造本發(fā)明所使用的再生牙齒單元的方法，在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，由于牙齒不會(huì)于活體內(nèi)受到壓力而損毀，可使其成長(zhǎng)為自然的形狀，可容易地制造適合缺損部位形狀的牙齒。另外，使用間隔構(gòu)件制造的再生牙齒單元，不僅牙齒部分，由于牙周組織部分亦不會(huì)于活體內(nèi)受到壓力而損毀，可使牙周組織充分發(fā)育，可制造形成牙槽骨更多的再生牙齒單元。因此，使用間隔構(gòu)件制造之再生牙齒單元，可適用為最適合用于復(fù)原牙槽骨的再生牙齒單元。作為本發(fā)明之另ー實(shí)施方式，本發(fā)明所使用之再生牙齒單元的特征在干，是根據(jù)包含在哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚的步驟的方法而制造，其中，在培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，自哺乳動(dòng)物的外部施加機(jī)械性的刺激。通過(guò)施加機(jī)械性的刺激，可促進(jìn)再生牙齒單元的牙周膜的形成。機(jī)械性的刺激可舉出例如震動(dòng)、壓迫、摩擦等，但并未限定于這些方式。例如可給予聲波程度的頻率(例如約20000Hz 40000Hz)的震動(dòng)。因此，認(rèn)為通過(guò)移植施加機(jī)械性刺激后促進(jìn)牙周膜形成的
再生牙齒單元，可更好地促進(jìn)牙槽骨的復(fù)原。本發(fā)明的使用間隔構(gòu)件的再生牙齒單元的制造方法中，在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚吋，以自哺乳動(dòng)物的外部施加機(jī)械性的刺激為優(yōu)選。本發(fā)明之牙槽骨的復(fù)原方法中，根據(jù)所要移植的再生牙齒單元的牙齒再生階段，若已發(fā)現(xiàn)齒冠形成，以將齒冠配置于口腔內(nèi)側(cè)為優(yōu)選。處于未發(fā)現(xiàn)形成齒冠之階段吋，以將相當(dāng)于齒冠部位的上皮細(xì)胞層或再生牙胚的上皮細(xì)胞層配置至口腔內(nèi)側(cè)為優(yōu)選。借此，可使牙齒的前端(齒冠)位于口腔內(nèi)側(cè)，與周圍的牙齒具同樣的方向性，可期望再生牙齒單元的牙周組織部分與顎骨發(fā)生骨整合。本發(fā)明所使用的再生牙齒單元可用于修補(bǔ)動(dòng)物的缺損牙齒的方法中。修復(fù)動(dòng)物缺損牙齒的方法包括將前述再生牙齒單元移植至牙齒缺損部位之步驟?？芍圃爝m合缺損部位 大小及形狀的再生牙齒單元再進(jìn)行移植。根據(jù)使用間隔構(gòu)件制造再生牙齒單元的方法，在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，由于牙齒不會(huì)于活體內(nèi)受到壓力而損毀，可使其成長(zhǎng)為自然的形狀，而可容易地制造適合缺損部位形狀的牙齒。另外，為移植至缺損部位，期望制作與缺損牙齒具有相同長(zhǎng)度的再生牙齒時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的牙齒制造方法，可控制牙齒長(zhǎng)度的最大值。牙齒長(zhǎng)度超過(guò)最大允許值時(shí)，無(wú)法直接移植該牙齒，而小于最大允許值時(shí)，在移植后可獲得使其成長(zhǎng)為期望長(zhǎng)度的再生牙齒。本說(shuō)明書中所使用的用語(yǔ)，是為了說(shuō)明特定的實(shí)施方式而使用，并無(wú)限定發(fā)明之意圖。本說(shuō)明書中所使用之“包含(包括、具有、具備)”等用語(yǔ)，除了根據(jù)上下文應(yīng)作其他理解的情況之外，是指所記述的事項(xiàng)(部材、步驟、要素、數(shù)字等)為存在之狀態(tài)，不排除其他事項(xiàng)(部材、步驟、要素、數(shù)字等)的存在。若為無(wú)特別定義，本說(shuō)明書中所使用之術(shù)語(yǔ)(包含技術(shù)用語(yǔ)及科學(xué)用語(yǔ))，具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛理解的相同的意義。此處使用之用語(yǔ)若未特別明示出相異的定義，則應(yīng)被解釋為具有本說(shuō)明書及相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中的意義與整合性的意義，不應(yīng)被理想化，或被解釋為過(guò)于形式的意義。本發(fā)明的實(shí)施方式有時(shí)需參照示意圖而說(shuō)明，但使用示意圖時(shí)，為明確地進(jìn)行說(shuō)明，有時(shí)采取夸張的表現(xiàn)。第一、第二等用語(yǔ)是為了表現(xiàn)各種要素而使用，請(qǐng)理解該要素不應(yīng)被限定于該用語(yǔ)。由于該用語(yǔ)是僅使用于為了區(qū)別一要素與其他要素，例如將第一要素記作第二要素，同樣的，將第二要素記作第一要素，亦未脫離本發(fā)明之范圍。[實(shí)施例]以下參照實(shí)施例更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。然而本發(fā)明可通過(guò)各實(shí)施方式而具體化，不可被解釋為限定于此處所記載之實(shí)施例。<實(shí)施例I :使用間隔構(gòu)件的再生牙齒單元之制作>作為本發(fā)明使用的再生牙齒單元的制作方法的ー個(gè)實(shí)例，是在制作再生牙胚后，在哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行活體內(nèi)培養(yǎng)，并制作再生牙齒單元。于腎被膜下移植時(shí)，為了避免腎被膜壓カ的影響，適合牙齒缺損部形狀，且為了可制作牙周組織充分發(fā)育的再生牙齒單元，使用間隔構(gòu)件進(jìn)行再生牙胚之活體內(nèi)培養(yǎng)。切斷微量吸管尖(HRI_110NEW，MolecularBio Products, SanDiego, CA, USA)以形成內(nèi)徑(內(nèi)直徑)為1.3_，高1.3_之環(huán)狀(圓筒狀)而制作間隔構(gòu)件，并于內(nèi)部填滿膠原蛋白溶液后使用。對(duì)于再生牙胚，為了促進(jìn)向牙根方向伸長(zhǎng)，使齒冠側(cè)接近間隔構(gòu)件的壁面而配置，并于37°C之CO2培養(yǎng)箱(三洋電機(jī)，大阪，日本)中進(jìn)行培養(yǎng)，使膠原蛋白硬化。其次將含再生牙胚的間隔構(gòu)件移植至7周大的C57BL/6小鼠的兩側(cè)腎被膜下。腎被膜下移植是于腎臟被膜上切割2 3mm的切ロ，剝離腎臟被膜與腎實(shí)質(zhì)，再于其間插入含再生牙胚的間隔構(gòu)件而進(jìn)行。比較例是將器官培養(yǎng)7天之再生牙胚以不使用間隔構(gòu)件的方式移植至腎被膜下。移植時(shí)的照片如圖I所示。另外，移植時(shí)間隔構(gòu)件與再生牙胚的 位置關(guān)系示意圖標(biāo)于圖11。于移植3周后，進(jìn)行顯微CT攝影，使用整合圖像處理軟件解析圖像數(shù)據(jù)。于齒冠部以最大徑作為長(zhǎng)徑，與長(zhǎng)徑正交的最大徑定義為短徑，井分別測(cè)量其長(zhǎng)度，及計(jì)算其比例。使用間隔構(gòu)件進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)例示于圖2，未使用而進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)例示于圖3。使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之再生牙齒單元，接近正常牙齒的形態(tài)，反之未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之再生牙齒單元，長(zhǎng)徑相對(duì)于短徑極端的長(zhǎng)，為扁平形狀。針對(duì)各7例的使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之群(控制群)及未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之群(非控制群)測(cè)量其長(zhǎng)短徑，求得的長(zhǎng)徑/短徑比結(jié)果示于圖4 (右側(cè))。再生牙齒單元之長(zhǎng)徑/短徑比，在使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之群(控制群實(shí)施例)為1.46±0. 16mm，未使用間隔構(gòu)件培養(yǎng)之群(非控制群比較例)為2. 30±0. 35mm。圖4(左側(cè))，是成年小鼠的下顎第一、第二、第三臼齒(M1、M2、M3)的齒冠部并以最大徑作為長(zhǎng)徑，與長(zhǎng)徑正交的最大徑定義為短徑并測(cè)定，亦顯示求得之長(zhǎng)徑/短徑比結(jié)果。Ml、M2、M3 之長(zhǎng)徑 / 短徑比分別為 I. 61 ±0. 05mm(n = 5)、I. 09±0. 04mm(n = 5)、I. 12±0. 04mm(n = 5)。自上述結(jié)果可知，相對(duì)于未使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)之再生牙齒單元為扁平形狀，使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)之再生牙齒單元，并不會(huì)形成扁平形狀，且二者的長(zhǎng)徑/短徑比之間存在顯著性差別。另外，確認(rèn)使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)之再生牙齒單元的長(zhǎng)徑/短徑比與天然牙齒相同(Student’s-t test,*p < 0. 0001)。另外不僅再生牙齒單元的齒冠部分如此，再生牙齒單元的牙周組織部分與未使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)相比，使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，不會(huì)形成扁平形狀，確認(rèn)可獲得牙周組織向圖中的齒冠的短徑方向及長(zhǎng)徑方向兩方向擴(kuò)散形狀的再生牙齒單元(參照?qǐng)D2及圖3之右圖)。因此，牙周組織的形狀亦可通過(guò)改變間隔構(gòu)件的形狀(于本實(shí)施例中是間隔構(gòu)件的圓筒的高度)而控制。通過(guò)調(diào)整間隔構(gòu)件的大小及形狀，可制作具有沿著缺損部位的形狀的牙周組織的再生牙齒單元并進(jìn)行移植，可使移植成功，亦有助于移植的動(dòng)物牙槽骨的復(fù)原。另外，認(rèn)為通過(guò)使用間隔構(gòu)件，可獲得牙周組織向齒冠的短徑方向及長(zhǎng)徑方向兩方向擴(kuò)散形狀的再生牙齒単元，再生牙齒因牙槽骨而有更強(qiáng)固的支持。摘出移植至腎被膜下30天、第60天的再生牙齒單元，進(jìn)行顯微CT攝影，使用整合圖像處理軟件解析并測(cè)定長(zhǎng)度。未包含顯微CT圖像上形成的牙槽骨的范圍，測(cè)量牙齒的咬合頭至根尖的長(zhǎng)度。結(jié)果示于圖5。于未使用間隔構(gòu)件的非控制群咬合頭-根尖長(zhǎng)于第30天為1.07±0. 20mm (n = 6)，第60天為I. 70±0. 26mm (n = 6)，牙齒長(zhǎng)度的增加具有顯著性。反之，通過(guò)間隔構(gòu)件的控制群，在第30天為1.01±0. 19mm(n = 13)，第60天為
I.02±0. Ilmm(n = 10)，未發(fā)現(xiàn)因移植天數(shù)之長(zhǎng)度增加(Student’s-t test,*p < 0. 0001)。自上述結(jié)果可知，使用間隔構(gòu)件于活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，可任意調(diào)節(jié)再生牙齒的長(zhǎng)度。<實(shí)施例2 :施加機(jī)械性刺激的再生牙胚之活體內(nèi)培養(yǎng)>遵循實(shí)施例I之方法，將使用間隔構(gòu)件進(jìn)行器官培養(yǎng)之再生牙胚與該間隔構(gòu)件一起移植至腎被膜下，機(jī)械性的刺激是自移植至腎被膜下第7天開始，以聲波電動(dòng)牙刷(頻率31，000取001む(商標(biāo))，國(guó)際牌)于小鼠背部皮膚給予3. 9X IO4Pa的壓力。(5分鐘/日)。對(duì)照群未施加機(jī)械性的刺激，在30天的移植期后摘出作為比較對(duì)象。對(duì)摘出之再生牙齒單元進(jìn)行與實(shí)施例I相同方法的顯微CT攝影，使用3D圖像解 析軟件并測(cè)定牙周膜腔的寬度(有時(shí)僅簡(jiǎn)稱作“牙周膜之寬”)。具體而言以3D圖像上再生牙齒單元的牙根表面與形成的牙槽骨之距離為牙周膜腔的寬度，長(zhǎng)徑及短徑的剖面圖，分別測(cè)定6個(gè)點(diǎn)。其后將牙齒以4%多聚甲醒(Paraformaldehyde PFA)固定,再以10%こニ胺四こ酸ニ鈉(EDTA)脫鈣，以石蠟包埋。其后，制作厚度Sym的連續(xù)切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。組織學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果示于圖6。圖中B代表牙槽骨，D為牙本質(zhì)，P為牙周膜，圖中文字P相鄰的線條表示牙周膜的寬度。另外圖中右下角比例尺是表示IOOy m。有刺激群的牙周膜形成較無(wú)刺激群為厚，并未發(fā)現(xiàn)牙周膜區(qū)域的細(xì)胞有規(guī)則的排列。另外CT圖像上測(cè)量牙周膜的寬度的結(jié)果示于圖7。有刺激群之牙周膜的寬度為108. 5±30. 6iim(n = 33)，無(wú)刺激群之牙周膜的寬度為68. 7± 14. I y m(n = 12)(Student，s_t test,*p < 0. 0001)。自上述結(jié)果可明確得知，在活體內(nèi)培養(yǎng)再生牙胚時(shí)，通過(guò)自外部施加機(jī)械性的刺激，可獲得具有充分牙周膜組織之再生牙齒單元。<實(shí)施例3 :活體內(nèi)培養(yǎng)所得之再生牙齒單元之顎骨移植>拔除4周齡C57BL/6小鼠下顎第一臼齒，并給予3天治愈期。其后，在相同部位進(jìn)行牙齦切開與剝離，使用牙科用微馬達(dá)(Viva-Mate Plus，中西，東京，日本)切削牙槽骨，形成近遠(yuǎn)中徑lnrni，頻舌徑0. 8mm的移植窩。遵循實(shí)施例1，使用間隔構(gòu)件于腎被膜下培養(yǎng)30天，并且遵循實(shí)施例2，在培養(yǎng)期間施加機(jī)械性刺激制作再生牙齒單元，將該單元埋入顎骨移植窩內(nèi)，并以8-0尼龍縫線(Bearmedic,千葉，日本)縫合牙銀。圖8是表示形成移植窩及移植再生牙齒單元之情況。移植再生牙齒單元至小鼠后的0天、第14天、第30天，以與上述相同方式進(jìn)行顯微CT攝影，并評(píng)價(jià)移植片與接受者的牙槽骨結(jié)合之情形。之后將含移植片之顎骨以4% PFA固定，再以10 %蟻酸-檸檬酸鈉脫鈣液進(jìn)行脫鈣，以石蠟包埋后，制作厚度8 u m的連續(xù)切片，并以染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。圖9為CT圖像，圖10為HE染色照片。如圖9所示，在移植第14天發(fā)現(xiàn)移植片與接受者的下顎第二白齒牙槽骨間有部分的結(jié)合，在移植第30天發(fā)現(xiàn)幾乎整個(gè)周邊均與骨整合。圖中箭頭是表示再生牙齒單元。
如圖10所示，在移植第30天的組織圖像中，再生牙齒與下顎第二臼齒的牙周中隔牙槽骨融合，顯示再生牙齒單元介由骨結(jié)合而與移植部位的牙槽骨整合之可能性。另外根據(jù)組織分析，雖發(fā)現(xiàn)因移植而出現(xiàn)偶發(fā)癥，即再生牙齒的牙髓一部分鈣化(16例中3例)，再生牙齒單元的牙周膜于移植后仍維持，且未發(fā)現(xiàn)黏連(Dental ankylosis) (16例中0例)。圖中箭頭是表示通過(guò)骨結(jié)合而發(fā)生骨整合，比例尺是表示100 ym，BT代表再生牙齒，NT代表天然的下顎第二臼齒。自前述結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明之制造方法所制造的再生牙齒單元，移植至顎骨后生長(zhǎng)良好。<實(shí)施例4 :對(duì)廣泛性骨缺損模型之再生牙齒單元移植>拔除4周齡C57BL/6小鼠下顎第一臼齒，并給予3天治愈期。其后，在相同部位進(jìn)行牙齦切開與剝離，使用牙科用微馬達(dá)(Viva-Mate Plus，中西，東京，日本)切削牙槽骨，形成近遠(yuǎn)中徑(mesiodistal diameter) 2. 5 3mm,頰舌徑2mm,深度3mm的三面性廣泛性 骨缺損模型。將遵循實(shí)施例1，配置于間隔構(gòu)件內(nèi)的再生牙胚于腎被膜下培養(yǎng)50-60天所制作之再生牙齒單元，移植至骨缺損部位，并以8-0尼龍縫線(Bearmedic，千葉，日本)縫合牙齦。圖12是移植后再生牙齒單元的實(shí)體圖像，CT外觀圖像及CT剖面圖像。對(duì)移植再生牙齒單元之小鼠，在第0天、第14天、第30天、第40天進(jìn)行顯微CT攝影，并評(píng)價(jià)移植片及植入物于牙槽骨內(nèi)的結(jié)合，以及頰側(cè)牙槽骨的垂直的骨再生。顯微CT攝影是于再生牙齒單元，以及移植再生牙齒單元的顎骨，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用3D顯微X射線CTR_mCT (Rigaku)，以90kV，150mA,剖面厚度IOmm之條件下進(jìn)行，可使用圖像解析軟件小動(dòng)物用圖像匯整軟件i-VIEW type R，以及高分辨率3D/4D圖像解析軟件Imaris(Bitplane)進(jìn)行圖像構(gòu)建及解析。圖13是對(duì)照(未移植再生牙齒單元)及實(shí)施例(移植再生牙齒單元)于0天、第14天、第30天、第40天的CT圖像。使用顯微CT圖像，觀察于剛進(jìn)行移植及移植45天后的再生牙齒單元吋，與未移植再生牙齒單元之對(duì)照比較，因移植再生牙齒單元而發(fā)現(xiàn)頰側(cè)牙槽骨量顯著性復(fù)原，同時(shí)顯示再生牙齒單元已整合。圖14是表示對(duì)照(未移植再生牙齒單元)及實(shí)施例(移植再生牙齒單元)于移植后第45天的CT圖像。圖像中剛移植后的牙槽骨上端部以虛線表示，移植后第45天的牙槽骨上端部以實(shí)線表示。進(jìn)而，針對(duì)對(duì)照(未移植再生牙齒單元)及實(shí)施例(移植再生牙齒單元)，測(cè)定移植45天的牙槽骨再生量。亦即于缺損部位或移植部位進(jìn)行經(jīng)時(shí)的CT攝影，通過(guò)使用整合畫面圖像處理軟件進(jìn)行解析，測(cè)定自移植前至移植后増加的牙槽骨體積，測(cè)定再生的牙槽骨量。測(cè)定結(jié)果示于圖15。根據(jù)測(cè)定牙槽骨的再生量，在移植再生牙齒單元的實(shí)例中，與未移植再生牙齒單元的對(duì)照組相比，顯示牙槽骨再生量有顯著性増加。進(jìn)而于其他的實(shí)施方式中，針對(duì)對(duì)照(未移植再生牙齒單元)及實(shí)施例(移植再生牙齒單元)，在移植第0天、第49天的CT圖像示于圖16。圖16的右圖將移植49天后之牙槽骨上端部的水平線，在對(duì)照及實(shí)施例的照片中以虛線表示。対照的CT圖像中，實(shí)際的牙槽骨的上端部與實(shí)施例之牙槽骨的上端部的垂直方向的差，通過(guò)ニ個(gè)箭頭表示。如圖所示，顯示通過(guò)移植再生牙齒單元至牙齒缺損部，可使牙槽骨在垂直方向復(fù)原。由該結(jié)果可知，對(duì)于一般植入物與牙胚移植無(wú)法解決的廣泛性骨缺損，通過(guò)移植再生牙齒單元，暗示可再生缺損部的牙槽骨，同時(shí)通過(guò)骨性結(jié)合亦可使牙齒再生。
權(quán)利要求
1.用于對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，該方法包括將再生牙齒單元移植至所述牙齒缺損的部位的步驟。
2.如權(quán)利要求I所述的用于對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，其中，所述動(dòng)物是非人類的哺乳動(dòng)物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，該方法包括下述步驟， (a)制作再生牙胚的步驟， (b)將所述再生牙胚置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制作再生牙齒單元的步驟， (c)將所述再生牙齒單元移植至哺乳動(dòng)物的牙齒缺損部位的步驟。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，該方法包括下述步驟， (a)制作再生牙胚的步驟， (b)將所述再生牙胚置于哺乳動(dòng)物的活體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以制作再生牙齒單元的步驟，所述哺乳動(dòng)物是與顎骨復(fù)原對(duì)象不同的個(gè)體， (c)將該再生牙齒單元移植至作為顎骨復(fù)原對(duì)象的哺乳動(dòng)物的牙齒缺損部位的步驟。
5.如權(quán)利要求3 4中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，其中 該再生牙胚是通過(guò)將實(shí)質(zhì)上由間葉系細(xì)胞構(gòu)成的第一細(xì)胞集合體與實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成的第二細(xì)胞集合體以緊密接觸的方式配置于支持載體內(nèi)部而進(jìn)行培養(yǎng)及維持的，且間葉系細(xì)胞與上皮細(xì)胞中至少一方來(lái)自牙胚。
6.如權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，其中 該(b)步驟是對(duì)配置于哺乳動(dòng)物活體內(nèi)的間隔構(gòu)件內(nèi)部的所述再生牙胚進(jìn)行培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法，其中 該(b)步驟中，從哺乳動(dòng)物外部施加機(jī)械性的刺激。
8.牙槽骨復(fù)原用再生牙齒單元，其用于權(quán)利要求I 7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法。
9.再生牙齒單元制作用再生牙胚，其用于權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的對(duì)牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了對(duì)牙齒缺損的哺乳動(dòng)物的牙槽骨進(jìn)行復(fù)原的方法。所述方法包括將再生牙齒單元移植至所述牙齒缺損部位的步驟。所述再生牙齒單元的特征在于除了齒冠部分以外還具有牙周組織部分。
文檔編號(hào)A61L27/00GK102869389SQ20118001776
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者辻孝, 中尾一久, 大島正充 申請(qǐng)人:株式會(huì)社器官再生工學(xué)