專利名稱：用于通用疫苗的流感病毒組合物和方法
用于通用疫苗的流感病毒組合物和方法
相關申請的交叉引用
本申請要求于2010年I月26日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/298，354的優(yōu)先權權益。該申請的全部內容特此在本文中通過引用并入。
聯邦主持的研究或開發(fā)的說明
不適用背景技術
流感仍然是感染每年億萬人的大范圍流行病。大約每十年，流感A病毒的抗原性不同的毒株(antigenically distinct strain)出現在動物中并傳播至人類,其中其造成廣泛的疾病、痛苦、經濟損失和死亡。目前針對流感A病毒疫苗和治療處理的方法不足以應對很多問題。這些問題部分涉及多種和新出現的病毒毒株(一種或多種)的基因組、基因表達產物和抗原決定簇的多樣和變化的屬性。當流感A病毒移動通過部分免疫人群時，它們不斷經歷抗原性漂移——一種導致改變的抗原表位的突變過程。同時，具有新型血凝素 (HA)和/或神經氨酸酶(NA)糖蛋白抗原的新毒株偶然從動物供應源(reservoir)中被引入人并在稱為抗原性轉變的過程中適應了人至人傳播。這些變化的和新的毒株可在具有相對不熟悉該新抗原的免疫系統的人群中顯示增加水平的毒力和/或快速傳播?，F有疫苗方法尤其具有總是落后于新抗原性不同流感A病毒毒株出現的缺點。本發(fā)明的實施方式涉及預防流感病毒的很多血清學上不同毒株(serologically distinct strain)的新型疫苗組合物和方法。本公開提供了顯著改進并滿足了流感疫苗領域的重要需求。發(fā)明內容
通常，本文使用的術語和短語具有它們本領域公認的意思，其可通過參考本領域技術人員已知的標準教科書、雜志參考文獻和上下文發(fā)現。提供以下定義，以使它們在本發(fā)明上下文中的具體使用清楚。
在某些疫苗實施方式的上下文中，“廣泛保護的”指的是誘導預防不同流感病毒的能力，例如，預防多種血清學不同的流感病毒毒株?！爸泻涂贵w”在本領域中被理解，并且對于某些例子來說指的是來自宿主動物、能夠預防或抑制病毒感染的免疫球蛋白。針對某些實施方式，當討論血凝素糖蛋白結構時，“干區(qū)”是關于流感HA蛋白的HA2域。
以下縮寫是適用的。HA，血凝素糖蛋白；NA，神經氨酸酶糖蛋白；TT，破傷風類毒素；BSA，牛血清白蛋白；KLH，匙孔血藍蛋白。
本發(fā)明的實施方式涉及用于預防和治療流感病毒感染和疾病的組合物和方法的改進。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元和載體分子的綴合物， 該綴合物具有結構式FXl
CX-LX3-{[LX2]-[PX1-LX1-PX2]}m (FXl)；
其中5
PXl為第一合成肽，
PX2為第二合成肽，
LXl為第一連接物，用于共價連接第一肽至第二肽；
其中PX1-LX1-PX2形成構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元；
LX2為第二連接物，用于連接雙鏈肽單元至載體分子，
LX3為第三連接物或直接鍵，用于連接載體分子至第二連接物LX2，
CX為免疫原性載體分子，和
m為大于或等于I的整數；
其中PXl和PX2合成肽各自獨立地包括對應于流感病毒血凝素(HA)蛋白干區(qū)的適合的肽序列，其中適合的序列由整合在卷曲螺旋模板中的15至40個氨基酸的天然或合成HA2域片段組成，并且其中構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元PX1-LX1-PX2包括α -螺旋結構。在一個實施方式中，PX1-LX1-PX2組分包括卷曲螺旋結構。在一個實施方式中，域片段的長度為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或40個氨基酸。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供綴合物，其中第一肽PXl和第二肽ΡΧ2的流感病毒血凝素HA2域片段各自獨立地為源于天然或合成HA2域片段的片段，所述天然或合成HA2 域片段對應于下列肽的氨基酸殘基的至少一個序列Ρ3，氨基酸391-411 ；Ρ4,409-429 ；Ρ5, 423-445 ；Ρ6,455-476 ； 1Α, WSN HA (342-360) ；3A,WSN HA (391-411) ；4Α, WSN HA (409-429)； 5A,WSN HA (423-445) ；6A,WSN HA (455-476) ;3M1 [也被稱為 3M]，WSN HA (381-411) ;3M2 [也被稱為 3M*]，WSNHA (381-411) ；3MP, PR8 HA (381-409) ；5P, PR8 HA (423-448) ；6P, PR8 HA(455-476);或其變異；其中殘基編號相對于H3N2流感病毒毒株的全序列。
在實施方式中，例如，兩個精氨酸殘基(R)任選地被添加以提高合成肽和綴合物的溶解度。因此，在不同的實施方式中，提供給定的與血凝素肽片段有關的序列，其中該序列位于RR的側翼，以指示精氨酸殘基。因此，在實施方式中，肽組分PXl和PX2可分別各自被認為進一步包括RR組分。
在實施方式中，選自
-Arg、-(Arg) 2> - (Arg) 3、_ (Arg) 4、-Lys、- (Lys) 2、- (Lys) 3、- (Lys) 4、-Arg-酰胺、-(Arg) 2-酰胺、-(Arg) 3_ 酰胺、-(Arg) 4_ 酰胺、-Lys-酰胺、-(Lys) 2_ 酰胺、-(Lys) 3_ 酰胺、-(Lys)4-酰胺、
-Cys-Arg、-Cys-(Arg) 2、-Cys- (Arg) 3> -Cys- (Arg) 4> -Cys-Lys、-Cys- (Lys) 2 、-Cys-(Lys)3、_Cys_(Lys)4、-Cys-Arg-酉先胺、-Cys-(Arg)2~ 酉先胺、-Cys-(Arg)3~ 酉先胺、-Cys- (Arg) 4-酉先胺、-Cys-Lys-酉先胺、-Cys-(Lys)2-酉先胺、-Cys-(Lys)3-酉先胺和--Cys-(Lys)4-酰胺的組分任選地被加入一個或兩個肽組分PXl和PX2中的C末端。因此在不同的實施方式中，提供給定的與血凝素肽片段有關的序列，其中該序列位于這些組分之一的側翼。因此，在實施方式中，肽組分PXl和PX2可分別各自被認為進一步包括這些組分之一。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供綴合物，其中PXl和PX2的適合的肽序列各自獨立地為以下序列中的至少一個
5A. T, CAALNKKIDDLFLDIffTLNAELLVLL(SEQ ID NO:I)；CN 102939101 A書明說3/44 頁
·
6A. T, CLNLKNLIEKLKSQIKNLAKEI(SEQ ID NO:2)；ΙΑ. Τ, CAALRGLIGALAGFIEGLffTGIRR(SEQ ID NO:3)3Α· T，CAALTNKINSLIEKINTLFTAIGK(SEQ ID NO:4)4A. T, CAALGKEIMNLEKRIENLNKKIDD(SEQ ID NO:5)3M1. T/3M. T, IKSLQNAINGLTNKINSLIEKINTLFTACRR(SEQ IDNO:6)； 3Μ2·Τ/3Μ*·Τ， IKSLQNAINRLTNKINSLIEKINTLFTACRR(SEQ IDNO:7) 3MP. T, IKSLQNAINRLTNKINTLIEKINTLFTACRR(SEQ ID NO:8)；5P. T, IENLNKKIDDLFLDIffTLNAEILVLLENCRR(SEQ ID NO:—)；6P. T, IRTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR(SEQ ID NO:_)；5P. T_alt, LNKKIDDLFLDIffTLNAELLVLLENCRR(SEQ ID NO:9)；6P. T_alt, ISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR(SEQ ID NO:10)；或其變異。在某些情況，T”標志指模板化肽序列，而“_alt”標志指可選序列。 在一個實施方式中，本發(fā)明提供肽化合物或綴合物，其中所述變異是這樣的變體序列與參比序列至少為 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。在一個實施方式中，所述變異為保守置換或允許相對于參比序列有I至5個改變。
在一個實施方式中，卷曲螺旋模板具有肽序列，其中在對應于HA2域片段的至少兩個七殘基單元中異亮氨酸殘基在七殘基螺旋單元的“a”位，亮氨酸殘基在七殘基螺旋單兀的“d”位。在一個實施方式中,模板為美國專利6，872, 806中描述的模板,或根據Lu和 Hodges, 2002 (J Biol Chem 277:23515-24)中描述的模板。在一個實施方式中，肽例如PXl 或PX2肽的肽片段包括重復的七殘基序列(迪cde fg)n。在具體的實施方式中，η等于2 至10。在優(yōu)選的實施方式中，η至少為2。在優(yōu)選的實施方式中，η為2、3、4、5或6。
在一個實施方式中，構象穩(wěn)定的模板化雙鏈肽單元能夠形成一種或多種表位，所述表位模擬一種或多種天然血凝素分子的處于融合前構象的主干中區(qū)域的結構。
在一個實施方式中，第一肽PXl和第二肽ΡΧ2各自具有相同的肽序列，并且單元被稱為同型雙鏈肽結合物或綴合物。在一個實施方式中，第一肽PXl和第二肽ΡΧ2為不同的肽。在第一肽PXl和第二肽ΡΧ2為不同肽的實施方式中，所述結合物或綴合物可稱為異型雙鏈模板化結合物或綴合物。在一個實施方式中，異型雙鏈卷曲螺旋包含兩個不同的表位。 在優(yōu)選的異型雙鏈綴合物實施方式中，每個α螺旋的長度相同，并且“a”和“d”位是全符合狀態(tài)(即，一個肽的“a”匹配另一個肽的“a”，并且對于“d”也同樣)。在一個實施方式中，異型雙鏈綴合物是多表位合成肽綴合物的基礎。例如，這種異型雙鏈模板化綴合物可為包含至少兩個不同表位的單免疫原，由源于相同流感HA蛋白的處于其融合前構象的主干的不同α螺旋區(qū)域的至少兩個不同表位組成。
在異型雙鏈綴合物的一個實施方式中，本發(fā)明提供了綴合物，其中第一肽PXl和第二肽 ΡΧ2 選自第一對 3ΜΡ PR8 HA2 (381-409) (SEQID NO: 198)和 5Ρ PR8 HA2 (420-448) (SEQ ID NO: 199);第二對 3MPPR8 HA2 (381-409) (SEQ ID NO: 202)和 6Ρ PR8 HA2 (448-476) (SEQ IDNO: 203);和第三對 5Ρ PR8 HA2 (420-448) (SEQ ID NO: 206)和 6Ρ PR8HA2 (448-476) (SEQ ID NO: 207);其中對于每對的每個成員，模板化序列在圖14中提供并任選地包括側翼 RR組分。根據本文教導，附加的對和變體在進一步實施方式中考慮。7
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了構象穩(wěn)定的雙鏈肽化合物，該化合物具有結構式 FX2
[PX1-LX1-PX2] (FX2);其中
PXl為第一合成肽，
PX2為第二合成肽，
LXl為第一連接物，用于共價連接第一肽至第二肽；
其中PX1-LX1-PX2形成構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元；
其中PXl和PX2合成肽各自獨立地包括對應于流感病毒血凝素蛋白干區(qū)的適合的肽序列，其中適合的序列由整合在卷曲螺旋模板中的15至40個氨基酸的天然或合成HA2域片段組成，并且其中構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元PX1-LX1-PX2包括α -螺旋結構。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供進一步包括第二連接物LX2的化合物，其中化合物具有結構式FX3
[LX2]-[PX1-LX1-PX2] (FX3);其中
LX2為第二連接物，用于連接雙鏈肽單元至載體分子，例如巨分子，諸如蛋白質或底物(substrate)。在一個實施方式中，LX2被附連至PXl的N末端。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供在藥學可接受制劑中包括綴合物或化合物的組合物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供包括綴合物或化合物和佐劑的組合物。
在本發(fā)明的一個實施方式中，綴合物的載體分子為蛋白質。該蛋白質可為匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、破傷風類毒素、霍亂亞單元B，來自流感嗜血桿菌(H. influenza)的蛋白D、或白喉類毒素。在本發(fā)明的另一個實施方式中，綴合物的載體分子為非蛋白質部分。該非蛋白質部分可為多糖，諸如藻酸(藻酸鹽)。在進一步的實施方式中，載體分子選自匙孔血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)和牛血清白蛋白(BSA)。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了誘導對抗流感病毒HA蛋白的免疫應答的方法， 包括用本文描述的組合物、綴合物或化合物接觸哺乳動物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了預防流感病毒感染或減弱流感病毒感染的毒力的方法，包括向對象施用本文描述的有效量的組合物、綴合物或化合物。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了分子，其是能夠結合至本文綴合物或化合物的抗體、其片段或其他抗原識別分子，其中所述結合為與構象穩(wěn)定的模板化雙鏈肽單元的表位的結合。在一個實施方式中，IgG分子或其片段為人源化的或全人的。在一個實施方式中，該分子為單克隆抗體。在一個實施方式中，該分子為這類分子的多克隆組合物的一部分。在一個實施方式中，該分子能夠中和流感病毒。在一個實施方式中，該分子能夠抑制體外流感病毒的傳染性。在一個實施方式中，該分子能夠抑制體內流感病毒的傳染性。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了流感感染的治療方法，其包括施用有效量的分子至有需要的對象。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了本文綴合物、化合物或組合物在藥物制造中的用途。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了本文綴合物、化合物或組合物在用于制造預防或治療流感病毒感染的藥物中的用途。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了本文綴合物、化合物或組合物用于預防或治療流感病毒感染的用途。
在一個實施方式中，連接物LXl出現在位于PXl和PX2的N末端上的殘基之間，或出現在位于PXl和PX2的C末端上的殘基之間。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了綴合物或化合物，其中連接物LXl為PXl和PX2 的含硫氨基酸殘基之間的二硫橋鍵。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了綴合物或化合物，其中連接物LXl為 R1 (-NH2)-R2-R3 (-NH2)形式的化合物，其中R1和R3可獨立地為C1-C8烴基、C1-C8烷基、C1-C8 雜烷基、HOOC-C1-C8烴基或HOOC-C1-C8烷基，R2可為C1-C8亞烴基、C1-C8亞烷基、C1-C8雜亞烷基(優(yōu)選C1-C8亞烷基)或不存在。在另一個實施方式中，連接物LXl為HOOC-(CH2) X-CH(NH2) - (CH2) y-CH(NH2) - (CH2)「H，其中x、y和z相互獨立地為O和6之間的整數，包括O 和6在內。在另一個實施方式中，連接物LXl為2，3-二氨基丙酸。在這些實施方式中，連接物LXl通過在PXl和LXl氨基之一之間的C末端酰胺鍵和在PX2和LXl的其他氨基之間的C末端酰胺鍵被附連至PXl和PX2的C末端。
在實施方式中，雙鏈、構象穩(wěn)定的卷曲螺旋肽免疫原引起對流感HA2區(qū)中α-螺旋表位的特異的抗體，其將天然蛋白鎖定在其融合前構象中，影響膜融合行為并由此減少或預防有效的病毒感染和疾病。在一個實施方式中，抗體通過減少或抑制膜融合行為影響膜融合行為。
在一個實施方式中，本發(fā)明的綴合物被分離或純化。
在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物為肽化合物。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了藥物制劑，其包括本發(fā)明的組合物，諸如本發(fā)明的綴合物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了合成本發(fā)明組合物或其藥物制劑的方法。在一個實施方式中，藥物制劑包括一種或多種賦形劑、載體和/或其他組分，如在本領域所理解的。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物的有效量可為治療有效量。
在一個實施方式中，本發(fā)明的肽組合物利用重組方法或合成技術制備。在一個實施方式中，本發(fā)明的核酸組合物利用重組方法或合成技術制備。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于治療醫(yī)療病況的方法，包括對有需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的組合物，諸如本發(fā)明的綴合物。在一個實施方式中，醫(yī)療病況為流感疾病。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供藥物，其包括有效量，例如治療有效量的本發(fā)明的一種或多種組合物或綴合物。在一個實施方式中，
本發(fā)明提供了制造用于治療本文描述疾病的藥物的方法。
不希望被任何具體的理論所限制，在此可具有對與本發(fā)明相關的基本原理或機理的相信或理解的討論。應認識到，無論任何解釋或假設的最終正確性如何，但本發(fā)明的實施方式可以是可操作和有用的。


圖I說明了流感病毒粒子。中和抗體被結合至三聚血凝素(HA)糖蛋白上的受體結合域。四聚神經氨酸酶(NA)糖蛋白也被插入病毒包膜。在病毒粒子中描繪了八個基因組片段(根據niaid. nih. gov/topics/Flu/Research/basic/,從美國國立變態(tài)反應與傳染病研究所(NIAID)獲得的公共域圖像)。
圖2說明了人、動物和禽的流感A病毒中HA的16個亞型中的系統發(fā)生關系。
圖3說明了 HA2介導的流感A病毒包膜與宿主膜(頂部)進行融合的模型。三聚 HA2中的螺旋區(qū)顯示為彩色柱體。圖3A說明了流感HA的HA2域的融合前構象。在酸性pH 和37°C下，HA2區(qū)再折疊，以延伸疏水融合肽(紅色)進入宿主細胞膜(步驟2至4)。撤2中的第二主構象改變(步驟4至6)將宿主和病毒膜吸引在一起以形成融合孔(最后一步)， 允許病毒基因組片段或核殼體進入細胞質，以開始復制循環(huán)。
圖4說明了制備流感基模板-載體蛋白綴合物的策略。模板中用流感血凝素片段的天然序列代替的殘基位置用星號指示。對于雙鏈、α-螺旋卷曲螺旋形成物，形成 4-3/3-4疏水重復的殘基被下劃線。位置“a”和“d”在重復的七殘基序列(gb ciefg)n的背景下被指示。在橫截面視圖中，螺旋的方向是進入頁面，從N末端至C末端，多肽鏈平行并全符合。箭頭指示疏水核中殘基a和a’以及d和d’之間的疏水相互作用。在示意性模型中，陰影圓指示在二硫橋連的雙鏈卷曲螺旋免疫原的前螺旋上的替代位置。
圖5說明了模板化肽免疫原的產生。在二硫橋連的雙鏈模板中，一條鏈包含光活化交聯劑(BB，苯甲?；?苯甲?；?、正亮氨酸(nL)，以確定在連接后肽與載體的比率，和連接物和肽之間的柔性甘氨酸殘基。DTNP—二硫代硝基吡啶，用于形成1:1的二硫橋連肽。 雙鏈模板被連接至載體蛋白(對于免疫，為KLH或其他合適蛋白，或對于抗體評估，為BSA坐、寸/ ο
圖6說明了流感病毒在其融合前的構象和某些表位中的三聚HA刺突(spike)。圖 (6A)顯示了在流感A Hl的WSN毒株主干的螺旋或部分螺旋區(qū)中的表位3、5和6。該結構針對小鼠適合的毒株A/PR/8/24。關于這些表位,構象穩(wěn)定的多鏈肽免疫原3A、5A和6A在圖 (6B)中示出。在中間圖形上，在相同朝向的空間填充模型顯示了表位暴露于干區(qū)的表面。
圖7說明了測試由利用肽綴合物免疫產生的抗體賦予的保護的實驗結果。產生針對肽綴合物的兔抗體制劑并用于小鼠的被動免疫。隨后利用小鼠適合的流感病毒在鼻內對小鼠進行攻擊。y軸顯示了隨時間(X軸)的百分比存活。代表性數據根據兩個獨立的實驗進行描述。
圖8說明了在流感A H1、H2和H5蛋白的主干中表位3、5和6中的序列外觀。表位以方框示出。相同的殘基用綠色突出，保守殘基用灰色突出，并且非保守殘基用白色突出。 表位3包括螺旋A標明的整個域。垂直虛黃線(和倒三角形)的右邊為與肽免疫原3A有關的片段的殘基。免疫原3M包括所有的螺旋A/表位3片段。螺旋A在Sui等，2009 (Nat Struct Mol Biol 16:265-73)中被描述，包括在其中圖4被稱為aA螺旋。
圖9說明了選擇的表面暴露的表位和流感HA蛋白的α-螺旋肽。黃色方框說明綴合至載體蛋白的雙鏈、構象穩(wěn)定的模板化卷曲螺旋肽。
圖10說明了 TT-連接的流感肽基免疫原的產生。
圖11說明了流感病毒HA蛋白和某些肽的外域結構。(A)中描述的融合單體具有138個殘基，和⑶中的融合三聚物具有414個總殘基。Ρ3=殘基391-411 ;Ρ4=殘基 409-429 ；Ρ5=殘基423-445 ；Ρ6=殘基455-476 (基于Η3Ν2全序列的殘基編號)。
圖12說明了 HAtl融合前結構和某些肽的外域。融合前的分子具有494個殘基。
圖13說明了利用對各種流感肽免疫原的兔抗體制劑的流感攻擊研究的結果(對于標明3Α、5Α、6Α的免疫原，一些數據可從圖7中的數據復制)。
圖14說明了包含兩個模板化α螺旋不同表位的異型雙鏈卷曲螺旋的例子。
發(fā)明詳述
本發(fā)明可通過以下非限制性描述進一步理解。
在一個實施方式中，本發(fā)明包括雙鏈肽綴合物，用于在對象中產生免疫應答。“對象”意味著脊椎動物，諸如禽或哺乳動物，優(yōu)選人?！皞€體”與“對象”同義。
如在此所用的，“疫苗”為用于誘導個體中免疫應答的免疫原性制劑。疫苗可具有多于一個的免疫原性成分。疫苗可用于預防和/或治療目的。疫苗不必必須預防病毒感染。不被理論所限制，當疫苗如本文描述的被施用時，本發(fā)明的疫苗可以以下方式影響個體的免疫應答病毒感染以較少量(包括完全沒有)發(fā)生，或病毒感染的生物或生理影響被減輕。
如在此所用的，術語“表位”指的是分子(或分子聯合)，包含能夠引起免疫應答的區(qū)和/或包含能夠特異與抗體結合的區(qū)。表位例如可從先前不知特異性結合至抗體的蛋白質的部分中選擇。
“特異結合”指的是以不大于大約10_6M的解離常數結合，優(yōu)選不大于大約10_7M，更優(yōu)選不 大于大約10_8M，還要更優(yōu)選不大于大約10_9M，甚至更優(yōu)選不大于大約ICTkiM,或可選地具有至少大約106/M的親和性，優(yōu)選至少大約107/M，更優(yōu)選至少大約108/M，還要更優(yōu)選至少大約109/m，甚至更優(yōu)選至少大約IO10ZM0
物質的“有效量”或“足夠量”為足以引起期望的生物作用的量，諸如有益結果，包括臨床效果，并因此，“有效量”取決于其被應用的背景。在本發(fā)明的背景中，疫苗的有效量的例子為足以誘導個體中免疫應答(例如，抗體產生)的量。有效量可在一次或多次給藥中施用。
免疫應答的“刺激”或“誘導”可包括體液和/或細胞免疫應答。在一方面，其指的是應答的增加，與當完全沒有提供疫苗時的免疫應答相比，該應答的增加可由引起和/或提聞應答廣生。
如在此所用和本領域廣泛理解的，“治療”是獲得有益或期望結果的方法，包括臨床結果。為了本發(fā)明的目的，有益或期望的臨床結果包括但不限于，一種或多種癥狀的減輕或改善，感染程度的減少，感染狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)，感染狀態(tài)的改善或緩和，以及病毒滴度(titer)的降低(不管是可檢測的還是不可檢測的)?！爸委煛币部梢馕吨c如果不接受治療所預期的存活相比延長了存活。病毒感染(諸如流感感染)的癥狀對本領域技術人員是已知的并可包括但不限于發(fā)燒、咳嗽、流涕、充血、肌肉痛、哮鳴、惡心和疲勞。
“保護性免疫應答”可包括任何提供有益或期望的臨床結果的免疫應答。提高個體存活率可被認為是保護性免疫應答。
I.基于構象限制的肽免疫原的通用流感疫苗。
介紹和綜述
流感是主要的全球公共健康難題。盡管數種不同的流感疫苗和藥物可用于預防和治療流感，但僅在美國每年就有25，000, 000-50, 000, 000例流感和30，000至40，000例死亡。全球每年有大約10億例流感和多達500，000例死亡。因為季節(jié)性因素，控制季節(jié)性流感A病毒是令人畏縮的難題該病毒傳播得非常迅速；潛伏期短；病毒血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)糖蛋白的抗原性持續(xù)改變，以致每年都必須配制新疫苗；容易選擇抗藥突變體；基因組片段的高頻重新分配允許病毒毒株之間和之中的抗藥性或毒力決定因素的轉移；并且病毒感染對再次感染不引起長期免疫力。
除了季節(jié)性流感A外，當攜帶來自動物或禽的HA和/或NA基因的新病毒毒株適于能夠從人到人傳播時，流行病偶然產生。如果人群缺乏對新病毒毒株的HA和NA抗原的免疫力，則它們可能以令人驚訝的速度和災難在全世界傳播。最近人獸互傳流感爆發(fā)的例子為禽流感的H5N1毒株，其在人中具有>60%死亡率，但幸運的是沒有很好地從人到人傳播， 以及2009年3月在墨西哥被人們首先認識到的遠不致命的豬流感HlNl毒株。到2009年 6月，該HlNl毒株已經傳播至美國所有的50個州和全球范圍內至少73個國家。為了預防每年共流通的季節(jié)性流感的多抗原性變化毒株并提供預防出現的流感A的流行病毒株，急切需要開發(fā)流感疫苗的新方法。
我們確定，識別構象依賴性表位的抗肽抗體，特別是包括流感A的HA糖蛋白在內的I級病毒融合糖蛋白的融合前構象，可阻斷導致膜融合和病毒進入的受體-誘導和/ 或酸性PH-誘導構象變化。我們測試了以下假設用源于流感A HA主干中的高度保守的 α -螺旋序列的構象限制肽進行免疫將證明提供長效、廣泛可交叉反應預防很多流感A病毒毒株的可能性。
通常很難或不可能進行人對象中流感感染的研究。因此我們針對小鼠模型中的流感疫苗開發(fā)和測試了組合物和方法。我們產生了穩(wěn)定、合成的雙鏈α-螺旋肽模板的綴合組合物，其引起對流感A病毒HA糖蛋白的干區(qū)中的高度保守螺旋表位的構象依賴性抗體。
我們針對在小鼠中提供被危險甚至致命的流感感染的難題的免疫預防的能力，研究了綴合組合物誘導抗體應答的能力。這些實驗證明，事實上由幾種新型構象限制的同型雙鏈模板化肽免疫原引起的抗體的確保護小鼠抵抗異型流感A(Hl)毒株的致死性攻擊。在本發(fā)明的實施方式中，這些和類似的組合物能夠提供不同HA型的流感A病毒的廣泛可交叉反應的預防。因此本發(fā)明的實施方式實際上實現了通用疫苗的名稱，其可提供對流感感染的同型和異型暴露的免疫力。
背景
流感對公共健康具有巨大的影響。在平均一年中，流感A病毒(圖I)迅速傳播，引起世界范圍的呼吸疾病的廣泛的季節(jié)性流行病，其導致至少50萬例死亡。增加人群中對病毒的免疫力選擇血凝素(HA)和/或神經氨酸酶(NA)基因中有突變的病毒。這些突變體病毒可隨后避開人群中的中和抗體。這種變體可變?yōu)樵谙乱粋€流感季節(jié)中傳播的主要毒株。 該“抗原性漂移”是為什么流感病毒是如此成功的人病原體的一個重要原因。對流感感染的免疫力很大程度上取決于對病毒HA和NA糖蛋白的抗體。感染引起占優(yōu)勢地為病毒毒株特異性的抗體，而不是廣泛交叉預防具有很多不同的HA和NA蛋白的病毒的抗體。因此，每年來自上一年的疫苗變?yōu)檫^時，并且流感疫苗必須被調整以合并預測在即將到來的流感季節(jié)中占優(yōu)勢的病毒毒株的HA和NA蛋白。每年開發(fā)新疫苗對抗這些預測的流行病毒株非常昂貴，并且這種疫苗有時不良地匹配實際傳播的病毒。
除了抗原性漂移外，抗原不同的流感A病毒毒株從禽或動物的傳染源偶然進入人群，引起“抗原性轉移”，即，引入通常先前還沒有傳染人的HA或NA型。人、禽和其他哺乳動物具有有至少16個血清學不同HA糖蛋白(Hl至Η16型)和9個不同神經氨酸酶糖蛋白 (Ν1-Ν9)的流感A病毒毒株。圖2顯示了來自人、禽和哺乳動物的流感A病毒中HA型的多樣性。人是Η1、Η2和Η3型的宿主。偶然地，來自動物或禽供應源的流感A毒株可傳染人并適應允許連續(xù)的人到人的傳播，如果人群缺少對這些HA和/或NA型的免疫力，就可能引起流行病。
人季節(jié)性流感的年傷亡人數大于10億例。在流行病年，當地球上所有的人都易于感染流感的新毒株時，例數高得多。流感毒株的毒力決定因素在幾種基因組片段中被發(fā)現。 一些人獸互傳的毒株，例如2009年的豬H1N1，沒有季節(jié)性流感A毒株危險，然而其他人獸互傳的毒株是高度危險的，例如H5N1禽流感殺死了多于60%的被傳染人，但不容易從人到人傳播。由世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)協調的全球監(jiān)視旨在檢測新型人獸互傳的流感病毒毒株并預測這種新流感A毒株是否將引起流行病。
利用常規(guī)方法，候選疫苗可被開發(fā)以預防從未在人中廣泛傳播的特異性人獸互傳的病毒毒株，或人獸互傳的病毒中的抗原性漂移可允許其避開候選疫苗，這是出現在疫苗設計、產生和分配的長過程后的事實。因此，每年開發(fā)和使用新流感疫苗是極其昂貴的，并常常是不充分有效的。目前，控制流感的單一最大難題是開發(fā)提供長效預防流感A病毒的異型毒株的通用疫苗。
幾種不同策略已經用于嘗試開發(fā)“通用”流感疫苗，其不像自然流感感染，提供了廣泛和長效預防具有很多不同HA和NA型的病毒毒株。見Subbarao 2006和Throsby 2008 ;同時見 Nabel, GI, Fauci, AS, Induction of Unnatural Immunity:Prospects For A Broadly ProtectiveUniversal Influenza Vaccine. Nat. Med 2010 Dec. 16(12) :1389-91。 這種疫苗將不必每年都被改變，并且將預防由抗原性漂移改變的毒株，以及預防新型人獸互傳的毒株。有效的、廣泛保護性疫苗將有助于減少不斷進行的人、禽和哺乳動物中流感監(jiān)視的需要，并類似地降低或消除與每年改變疫苗組合物有關的某些花費。這里我們描述了引起對抗流感A的廣泛交叉保護性抗體的新型免疫策略。
流感病毒HA糖蛋白的結構和功能。流感HA具有結合至病毒受體的N末端域(被稱為HA1K細胞膜上的N-乙酰神經氨酸和介導病毒包膜與宿主細胞內體膜的融合以開始感染的C末端域(被稱為HA2)。HA1的氨基酸序列顯示了不同病毒毒株或HA型之間的相當大的變異，而HA2中的序列更加高度保守。HA胞外域的晶體結構顯示了其為三聚物。已經勘查到HA1域上的引起毒株特異性中和抗體的表位接近其膜遠端的受體結合域。流感HA2域包含幾種七殘基重復，所述重復在酸性pH下將HA1結合至其受體之后經歷一系列大量的構象重排(見圖3)。
由gpl20和gp41組成的HIV-I包膜糖蛋白為I級病毒融合蛋白，類似于流感HA 的包膜糖蛋白。以包膜的融合域為目標的抗病毒肽藥物，諸如模擬HIV-I gp41的C-末端七殘基重復的恩夫韋地(enfuvirtide) (T-20,或商品名稱Fuzeon),可預防病毒糖蛋白中的構象變化并阻斷病毒的進入和感染。我們推斷，以流感融合域中的高度保守區(qū)為目標的抗體可能能夠鎖定HA蛋白在其融合前構象中，預防膜融合。
我們將HA2域(HA的主干)的融合前構象中高度保守的α -螺旋序列并入可顯示兩個拷貝的所選擇表位的高度穩(wěn)定的合成α-螺旋肽模板。可選地，我們注意到模板中的序列可顯示一種或多種獨特的構象依賴性表位，其模擬與融合過程有關的相關天然構象。 我們發(fā)現用針對HA主干上的3個不同表位中的每一個的兔抗體進行的被動免疫部分地保護了小鼠免受由用10 LD5tl的小鼠適合流感A/PR/8/34攻擊引起的死亡。
幾個研究組研究了結合至HA2的某些罕見的人抗體是否可預防HA2域中的構象變化，該構象變化對于病毒進入宿主細胞是必需的，并由此預防感染宿主細胞和選擇抗體逃逸突變體。見Ekiert 2009和Sui2009。這兩個研究中的抗體結合至三聚HA的主干內的被稱為螺旋A的相同α -螺旋域。
所有HA亞型的序列和結構分析揭示了該螺旋A表位的對應于流感A HA亞型的兩個基團的兩個變體(圖2)。結合至螺旋A的人抗體中和具有幾種不同HA型的流感A毒株， 包括1918年流行病Hl病毒和Η5禽流感病毒。然而，這些研究組或其他研究組都沒有開發(fā)出可對HA蛋白上的構象特異性表位產生抗體的免疫原。本發(fā)明部分涉及產生模板化同型雙鏈合成肽免疫原的重要開發(fā)。這些免疫原可引起針對HA主干中的螺旋A和其他α-螺旋表位的構象特異性抗體，具有預防被很多不同流感病毒毒株感染的潛力。
針對流感的合成肽疫苗的優(yōu)點。被流感病毒感染或利用流感病毒或全HA蛋白免疫產生病毒毒株特異性中和抗體，該抗體主要識別HA1域的超變區(qū)中包圍受體結合位點的表位。然而，最近已經鑒定了一些罕見的中和人單克隆抗體，其識別在HA的HA2域或主干中的高度保守表位螺旋A并干擾膜融合和病毒進入。這些罕見抗體可同時中和同型和異型流感毒株。重要的是，自然感染或利用流感病毒或全HA蛋白免疫都沒有有效地對螺旋A產生抗體。相比之下，本發(fā)明的免疫原性肽疫苗材料的實施方式能夠以此和與中和及免疫保護有關的流感AHA的其他高度保守抗原區(qū)為目標。
目前，每年必須配制所有商業(yè)可用的人流感疫苗，以包含三種目前傳播的流感A 和B的毒株的HA和NA糖蛋白。它們由含有胚胎的雞蛋中生長的病毒產生，或最近在歐洲， 在組織培養(yǎng)細胞中產生。雞蛋中有效疫苗的產生要求選擇具有合適的HA和NA蛋白的高產量、重排列病毒毒株?；畹臏p毒流感疫苗(LAIV)由感染病毒粒子組成并通過鼻途徑被施用，并且從雞蛋生長的病毒中純化的由HA和NA蛋白組成的滅活疫苗被腸道外施用。這些疫苗或流感病毒感染本身都沒有誘導對HA2的螺旋A區(qū)的強中和抗體應答。
利用病毒粒子或全長度HA蛋白之外的有吸引力的、產生針對流感病毒特異性毒株的中和抗體的備選方案是利用例如在HA的主干上的高度保守的構象依賴表位免疫，其可引起對其他流感病毒毒株具有廣泛特異性的中和抗體。
感興趣或小表位的所選擇蛋白片段可被合成為用于主動接種疫苗的肽免疫原或用于制備抗天然HA上預選表位的治療性單克隆抗體的肽免疫原。合成肽疫苗具有很多優(yōu)點。利用合成肽作為免疫原的主要優(yōu)點之一是可以以特異性表位為目標，諸如在天然蛋白中不是強免疫原性的表位。合成肽生產也相對便宜并可以高度純化形式獲得。合成肽疫苗的主要局限性是肽經常缺少完整蛋白中發(fā)現的特異構象，并可能不會引起識別病毒表面上天然蛋白的抗體。在天然蛋白中，感興趣蛋白片段的構象由第二級和第三級相互作用穩(wěn)定， 但溶液中僅有的相應的肽通常為非結構化的無規(guī)則的螺旋。利用合成肽作為代表表面環(huán)和轉角(turn)的免疫原產生針對蛋白表面暴露區(qū)的抗體已經成功。
然而，代表α -螺旋區(qū)的肽在溶液中通常是非結構化的并且不能產生識別天然蛋白中α-螺旋的抗體。因此，利用代表α-螺旋區(qū)的合成肽進行的免疫可產生僅識別非天然構象和不識別天然蛋白的抗體。因此，利用模板化構象穩(wěn)定的合成肽產生抗天然蛋白內的表位的高親和性、保護性抗體的重要方面，依賴于肽免疫原模擬天然蛋白中相應的B-細胞表位的三維結構的能力。因此，需要結構穩(wěn)定的免疫原用于產生識別特異構象——例如天然蛋白中關鍵區(qū)的α-螺旋——的抗體。這種蛋白包括I級病毒融合蛋白，例如，流感病毒HA蛋白。
流感疫苗的免疫原。代表蛋白的α-螺旋區(qū)的肽在溶液中通常是非結構化的，并且不引起識別天然蛋白中α-螺旋的抗體。蛋白中全部α-螺旋的大約50%是兩親性的， 即具有極性面和非極性面。α-螺旋的非極性表面通過折疊的天然蛋白疏水核內的疏水相互作用而穩(wěn)定α-螺旋構象。我們用肽基模板開發(fā)了流感免疫原，以便產生識別流感蛋白中特異α-螺旋的構象特異性抗體。流感疫苗模板的優(yōu)選實施方式具有平行雙鏈α-螺旋卷曲螺旋結構，其被設計以保持在異亮氨酸/亮氨酸疏水核和鏈間二硫橋鍵中的最大穩(wěn)定性。來自相關流感序列的表面暴露的螺旋殘基被插入模板(圖4)。在一個實施方式中，每個七殘基重復單元中七個殘基中的最少五個對應于所選擇的α-螺旋序列。雙鏈模板用于免疫以產生多克隆抗體，其不僅對感興趣序列是特異性的，而且對其α-螺旋構象是特異性的。設計該方法以產生針對目標蛋白和表位的α-螺旋區(qū)的特異性抗體。
在一個實施方式中，模板化流感免疫原通過固相肽合成法合成、純化、連接至載體蛋白，并用于免疫。制備用于免疫的模板_載體蛋白綴合物的綜述在圖5和圖10中示出。 該方法類似于將α -螺旋的分子表面從感興趣流感蛋白區(qū)移植入雙鏈、卷曲螺旋模板。
制備流感HlNl的HA2域中的構象限制的合成肽免疫原。基于HA2的X射線結構， 我們在HA2中或在HA融合前構象中的主干域中選擇了三個高度保守螺旋區(qū)，被稱為表位3、 5和6 (圖6Α)，以整合入雙鏈α -螺旋卷曲螺旋模板(圖6Β)。這些表位被暴露在HA融合前構象中的空間填充模型的表面上(圖6Α，右圖形)。
肽免疫原通過利用常規(guī)Fmoc (芴甲氧羰基)化學的固相合成方法制備，并且兩個批次利用乙酸酐(Ac)或Fmoc-6-肼基煙酸(HNA)進行去保護和N末端酰化。該兩個衍生肽通過RP-HPLC純化，并由氨基酸分析和電噴霧質譜(EMS)表征。兩個不同肽鏈之間優(yōu)選的二硫橋鍵形成(見圖5a和b)通過2，2’- 二硫嘧啶的控制進行。二硫橋連的雜雙鏈肽通過RP-HPLC純化并由EMS確認。用于免疫的模板化雙鏈肽被結合至匙孔血藍蛋白(KLH)， 并且用于分析肽-特異性抗血清的肽被結合至牛血清白蛋白(BSA)。綴合反應使用來自 Novabiochem(Gibbstown, NewJersey)的目錄號為 01-63-0121, 01-63-0120 的 HydraLink 偶聯試劑盒。每個載體分子的肽分子數利用正亮氨酸(肽)與苯基丙氨酸(載體)的摩爾比，通過氨基酸分析確定。通常，在4:1的平均肽與KLH的摩爾比下，綴合物的濃度在O. 6 至O. 9mg/ml的范圍內。生物綴合系統在方案I中示出。
用于綴合的方案I。
案丨-生物綴合系統HsN-HydraLink 6-Fmoc-HNA 反應物 8-Fmoc-肼甚姻酸Hh H^N~ KLHHydraLink SFB 反應物4-甲酰苯甲酸琥珀酰亞胺_sNH.NH-,
抗肽抗體的產牛、純化和表征。簡單地說，對于每個免疫原，三只新西蘭白兔在兩個肌肉部位進行免疫。最初劑量包含50 μ g具有弗氏完全佐劑的KLH-肽綴合物。在第7、 28和50天的加強劑量包含在弗氏不完全佐劑中的50 μ g綴合物。血清在第58天收集，并且抗體用G蛋白親和性層析法進行純化。利用包被有BSA-肽綴合物的平板的酶聯免疫吸附測定(ELISA)顯示了這些是強免疫原，并且抗體具有對它們各自卷曲螺旋模板的高特異性。
用針對構象穩(wěn)定的α -螺旋HA2肽的血清被動免疫小鼠和對流感病毒攻擊的應答。我們接下來測試針對來自流感HA2的構象限制α-螺旋肽的我們的兔抗體是否賦予了流感病毒的預防。我們使用了流感的小鼠模型。十只BALB/c小鼠在相對于病毒攻擊的第_1、1和3天，用Img的抗體通過腹膜內途徑進行被動免疫。對照動物接受了預免疫兔抗體，或僅接受緩沖液。在第O天，用10 LD5tl(IO5PFU)的小鼠適合的HINl流感A病毒、毒株 PR/8/34或緩沖液鼻內攻擊小鼠。每天監(jiān)控重量變化和死亡率，持續(xù)2周。圖7顯示了用 PBS治療的I O只小鼠中的9只和用預免疫抗體治療的所有小鼠在第7天死亡。
在顯著的對比下，針對圖6所示的同型雙鏈構象穩(wěn)定的α -螺旋HA2肽，分別地， 用抗體6Α或5Α被動免疫后，10 LD50的流感病毒攻擊的小鼠中40%和60%存活(圖7)。組織病理學在死亡或如方案要求在失去多于15%的體重后被安樂死的所有被測試小鼠肺中顯示了炎癥。病毒滴度在用抗體5Α和6Α治療的小鼠的肺中顯著降低。KLH
該實驗說明，肽基流感免疫原能夠誘導免疫應答，所述免疫應答產生足以在被動轉移后賦予抵抗流感攻擊的顯著保護的抗體。針對在HA2域中或在流感A HlNl的PR/8/34 毒株的HA主干中的某些構象穩(wěn)定的α -螺旋肽的抗體可保護小鼠免受同型病毒毒株的攻擊。這些肽的氨基酸序列在流感毒株中是相對保守的(圖8)。因此該抗肽抗體具有同時提供預防異型流感A病毒的潛力。免疫原可用作直接疫苗材料，用于刺激宿主應答，所述應答產生識別在流感血凝素I級病毒融合糖蛋白的融合域中的構象依賴性表位的抗體。接種疫苗的對象將因此通過它們結合融合前構象的血凝素的抗體，阻斷病毒_細胞膜融合和病毒進入需要的受體誘導的和/或PH-誘導的構象變化，而具有抑制流感病毒感染的能力。疫苗材料也具有在不同流感病毒毒株中提供交叉保護的潛力。由于肽基免疫原模擬的表位的保守性，免疫原的長期相關性和效力使得它們能夠產生受抗體水平影響的免疫應答，與更易受到由免疫避開策略和流感病毒使血凝素蛋白其他區(qū)突變的靈活性產生的減少相比，所述抗體水平保持相對高、有用和/或不變。
在優(yōu)選實施方式中，破傷風類毒素(TT)被用作合成肽免疫原的載體蛋白。載體TT 對于人對象中的使用是相容的。匙孔血藍蛋白(KLH)可用于替代實施方式中。
在優(yōu)選實施方式中，肽免疫原涉及模仿在HA2的α-螺旋區(qū)中或在主干域中暴露于HA融合前構象表面的表位。在流感感染期間，HA中導致膜融合的構象變化(圖3)通常在酸性PH下發(fā)生在內體內。在疫苗組合物中選擇高度保守、表面暴露的α-螺旋表位允許所得抗體在中性PH下結合至病毒粒子上的這些保守HA表位，但可能不預防病毒附著。保護性抗體可與病毒一起被攜帶入內體，在內體中，它們將HA鎖定在其融合前構象中，阻斷 HA中酸觸發(fā)的導致病毒包膜與內體膜融合的構象變化，并預防病毒感染的開始。
在實施方式中，產生合成肽流感A疫苗。對于肽設計和合成，以某些保守α _螺旋表位為目標。這些表位被暴露于HA2的表面或HA融合前構象的主干域。例如,表位5、6和 3Μ(被修飾以包括所有的螺旋Α)被用作肽免疫原設計的基礎(見圖8和9)。
螺旋A，HA的氨基酸381-408，是用于模擬流感A毒株的天然表位的具體目標。在本文描述的數據中，肽3Α(氨基酸391-411)被用作合成HA肽免疫原，以引起兔抗體。兔血清 IgG抗體顯示了當被轉移至用致死性攻擊量的流感病毒感染的小鼠時賦予免疫力的一些能力；觀察到大約10-20%保護的水平。其他肽免疫原與增加的效力有關，并產生具有誘導有用免疫應答的能力的更進一步肽免疫原。例如，設計同型雙鏈模板化綴合的肽免疫原—— 標為3ΜΡ(見圖9)，以包括螺旋A的所有區(qū)。
用于構造模板化二硫橋連的多鏈卷曲螺旋肽的一般方法在圖5和圖10中示出。為了說明的目的，天然螺旋肽序列3ΜΡ、5Ρ和6Ρ (圖9)被模板化，以形成圖9所示的構象穩(wěn)定的卷曲螺旋免疫原。在七殘基重復單元的情況下，天然序列的位置a和d中的殘基分別被異亮氨酸和亮氨酸(lie和Leu)所取代。這些模板化肽通過圖5所示的固相方法合成。
肽基組合物的免疫原性通過共價連接至載體蛋白建立或提高。盡管匙孔血藍蛋白 (KLH)是有效的，但其他載體諸如破傷風類毒素可更適于某些應用，例如，用于人對象。用于連接肽免疫原至TT的示例性方案在圖10示出。小鼠適合的流感A/PR/8/34病毒HA的模板化肽3MP、5P和6P被連接至TT載體蛋白，以產生雙鏈、構象穩(wěn)定的合成肽免疫原。
碘代乙?；趐H6下，利用碘代乙酸酐被引入肽免疫原的α-氨基。載體蛋白 TT通過Traut’ s試劑(2-亞氨基硫燒(2-iminothiolane))用巰基衍生。該小連接物可17減少產生抗連接物抗體或額外化學毒性的可能性。該反應導致在肽和載體TT之間形成穩(wěn)定的硫醚鍵。綴合化學也由Kao和Hodges進行了描述(見Chem Biol Drug Des. 2009 Jul; 74 (I) : 33-42)?？衫闷渌Y合方法，如在本領域中所理解的。
在用流感病毒攻擊前，TT-肽綴合物用于免疫兔并用作小鼠中的活性疫苗。為了針對肽特異性和構象特異性抗體篩選兔抗體，雙鏈、卷曲螺旋的HA肽被連接至BSA，而不是 TT0 BSA是方便的銜接分子，因為其容易被ELISA孔吸收并被固定在生物傳感器芯片上。被連接至載體蛋白的每個肽的量通過氨基酸分析確定。通過計算被并入合成肽N末端連接物的正亮氨酸(nL)的摩爾數，并使用已知的TT或BSA的氨基酸組成，綴合至TT或BSA的合成肽的總量以及合成肽/載體蛋白的摩爾比被確定。肽/載體蛋白的比率優(yōu)選被控制為大約 6:1。
對如本文所示用模板化雙鏈合成HA肽免疫原進行的兔免疫，
KLH-綴合肽的免疫原性通過施用佐劑(弗氏完全佐劑和不完全佐劑)提高。利用Alhyd丨Ogel (Superfos, Denmark ;氫氧化招)作為佐劑，和O. 9%w/v磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)作為綴合物疫苗運載體，TT-肽綴合物被制成疫苗組合物。
模板化HA肽和天然HA肽的生物物理研究。進行生物物理研究，以表征模板化雙鏈卷曲螺旋肽，例如關于顯示α-螺旋結構中表位的能力。用作疫苗的肽的結構和穩(wěn)定性通過溫和緩沖液(PBS)和50%三氟代乙醇(TFE)中的圓二色(Cd)譜進行評估，并且也通過熱變性曲線圖形進行評估。模板化肽的低聚狀態(tài)通過分析超離心分析和尺寸排阻層析法進行檢查。
兔的免疫。簡單地說，對于每種TT-肽綴合物，將三只兔用50ug的綴合物和 Alhydrogel 氫氧化鋁佐劑在兩個肌肉部位進行免疫。加強免疫在第7、28和50天進行。 在第58天，兔被安樂死，收集包括血液的進一步樣品。血清IgG通過G蛋白親和性層析法進行分離。
表征抗模板化HA肽免疫原的兔抗體，例如關于肽_特異性、親和性和構象依賴性的屬性。分析可包括表征抗體是否對免疫肽是特異性的，識別肽免疫原的α-螺旋構象、在其融合前和/或融合后的構象中的可溶三聚流感HA蛋白和以其融合前的構象表達在細胞表面上的天然三聚流感HA蛋白。
酶聯免疫吸附測定(ELISA)。為了表征兔抗體對免疫肽的特異性，進行ELISA測定。連接至BSA的模板化雙鏈卷曲螺旋合成肽被包被在96孔聚苯乙烯板上。5%的BSA用于阻斷。兔IgG抗體或來自兔預免疫血清的IgG在PBS中系列的10倍稀釋液與結合的抗原一起溫育，并且結合的IgG用連接至辣根過氧化酶的山羊抗兔IgG進行檢測。每種兔抗體或正常血清也被僅僅針對免疫原和BSA進行測試，以確定抗體對合成肽免疫原的特異性。與氫氧化鋁佐劑一起施用的每個TT-連接的肽抗原的免疫原性的確定，通過在ELISA中給出正信號的抗體稀釋液指示。以高親和性結合至HA2或HA的主干域上的螺旋表位的抗體增加了攜帶病毒粒子進入內體的相對能力，并顯示了阻礙HA中酸性pH-誘導的構象變化的活性和病毒進入的預防。
類似地，進行ELISA以確定每個抗體是否都僅識別構象穩(wěn)定的雙鏈卷曲螺旋的肽免疫原或所述免疫原和具有天然表位序列單鏈肽二者。在該測定中，天然表位序列作為單鏈肽被連接至BSA，該單鏈肽將可能為非結構化的，因為其從天然蛋白中去除。一些對α-螺旋表位特異性的高親和性抗體可通過誘導其以呈現螺旋構象結合至單鏈、非結構化的肽抗原。對于具體的免疫原，一些由該免疫原產生的抗體可同時識別它和天然肽，但其他的可能對于免疫原是特異性的。
結合抗體至天然可溶或固定的三聚HA蛋白。表征了兔抗體與預免疫或天然兔IgG 相比的特異識別同型流感HA蛋白的天然融合前的構象中α-螺旋表位的能力。這通過 ELISA和/或流式細胞計實施。具有C-末端flag標簽的流感A/PR/8/34 HA的可溶三聚胞外域在人胚腎293T細胞中表達，并且被親和純化。如果維持在pH>7. O和4°C下，可溶HA 三聚物保持它們的天然融合前的構象。ELISA測定用于比較誘導的兔抗體與正常兔IgG結合至可溶三聚天然刺突胞外域上目標表位的融合前構象。全長度、膜-固定的重組小鼠適合的流感A/PR/8/34 HA蛋白被表達在293T細胞上，并通過流式細胞計測試兔抗體是否可結合至血漿膜上的天然同型HA蛋白三聚物。通過在用HA-表達和控制細胞溫育它們前，用神經氨酸酶預處理IgG，對于抗體與HA-表達細胞的結合不是由于HA的受體結合域對IgG 上唾液酸部分的識別的方面，可確保測定質量。
流式細胞計用于利用流感A的異型毒株評估抗肽抗體的交叉反應。從不同年齡的人或豬中分離的Hl病毒的全長度三聚HA蛋白被表達在293T細胞中，并針對結合至誘導抗體進行測試。流式細胞計也用于確定誘導抗體是否也結合至來自H2和H3流感A毒株的膜固定的HA蛋白。
針對可溶HA三聚物的抗肽抗體的交叉反應的評估。評估結合參數，包括關于流感 A的不同的HI、H2、H3和H5毒株。利用表面等離子共振技術，例如利用Biacore生物傳感器，定量抗血清對具有來自不同流感毒株的可溶HA三聚物的肽免疫原的結合親和性。相對于來自預免疫血清的免疫原或IgG中每一個的來自免疫血清的IgG被固定在生物傳感器芯片表面上。來自同型A/PR/8/34毒株的純化的可溶HA三聚物在被固定抗血清上流動。產生傳感圖，以說明結合的上下速率(onand off rate)和針對給定抗體制劑的相應親和性常數。盡管以我們的免疫原為目標的α-螺旋序列在流感A病毒中通常是高度保守的，但在表位3ΜΡ、5Ρ和6Ρ中具有少數保守和幾種非保守置換(圖9)。對這些置換就影響抗肽抗體的結合親和性以及中和活性的能力進行評估。針對來自流感A不同毒株的可溶HA三聚物與被固定免疫或預免疫兔IgG的結合親和性，對結果進行比較。
中和測定。針對同型和異型流感A病毒或包含同型或異型HA的逆轉錄病毒假型的中和，測試抗肽免疫原的抗體。針對同型流感A/PR/8/34 (HlNl)和異型流感A毒株，測試中和活性。微中和測定評估了兔抗肽抗體的流感病毒中和活性。在測定中，小鼠適合的流感A/PR/8/34的100 TCID50用相等體積的抗體4倍系列稀釋液(原液IgG濃度，2 mg/ ml)在37°C溫育lhr。Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞被添加至每個孔中，并且平板在包含胰蛋白酶的介質中溫育18小時。酸-醇固定細胞中的病毒抗原通過間接ELISA進行檢測， Mab針對流感A病毒的核殼體蛋白。對照包括用不含病毒的介質接種的孔，僅含病毒不含 IgG的細胞，和與來自預免疫兔血清的IgG的稀釋液混合的病毒。結果說明了抗體中和流感病毒的傳染性的能力?？贵w制劑的組合也可針對中和活性進行評估。在一個實施方式中， 用針對肽基化合物或綴合物的兩種或更多種不同的抗體產生結合組合物。
針對具有突變體HA蛋白的耐抗體的流感A/PR/8/34病毒的選擇，任選地進行測試。來自抗體中和實驗的終點稀釋液的病毒被放大并通過相同的抗體針對中和再次測試。對抗體中和耐性增加的病毒，如果有的話，可被認為是潛在的抗體逃逸突變體。例如通過測序研究來自這種病毒的HA基因，以便利用某些表位的抗體鑒定涉及對中和有耐性的突變。 在鑒定抗體逃逸突變體后，就這些病毒是否能用抗體中和成不同肽免疫原，進行進一步的確定。候選逃逸突變體病毒對用對不同表位的抗體進行中和的敏感性被用作評估抗體混合物的應用的一個因素。
微中和測定也用于測試抗一種或多種流感A HlNl病毒毒株的誘導抗體，所述毒株在圖8中示出，包括在2009年來自Mexico的豬和USA的人的流行病HlNl病毒。所圖解的 HlNl病毒毒株在幾十年期間，從在地理不同區(qū)域中的人或豬中分離。它們因此顯示了在HA 刺突的尖端上圍繞受體結合域的中和表位的顯著多樣性。然而，圖8顯示了 HA主干中的 α -螺旋表位3ΜΡ、5Ρ和6Ρ在HlNl毒株中是非常高度保守的。針對不同HlNl病毒的每個兔抗體的中和終點可被用作指示可能的交叉保護范圍的因素。也針對中和從不同年齡人中分離的流感Η2Ν2和Η3Ν2毒株的能力，測試抗體。針對組_1病毒的Hl和Η2毒株和組_2 病毒的Η3毒株產生額外的肽基化合物、綴合物和組合物(見圖2)。
針對阻礙逆轉錄病毒假型進入的能力，評估誘導為給定的肽化合物/綴合物的抗體，所述逆轉錄病毒假型包含具有不同HA型的人獸互傳的毒株的HA糖蛋白，包括從2009 年的禽或人克隆的禽流感Η5，和來自已經引起人感染的毒株的Η7和Η9蛋白。制成具有不同流感病毒的HA蛋白的鼠科逆轉錄病毒。利用包含不同HA蛋白和β_半乳糖苷酶或熒光素酶報告基因的假型，評估MDCK細胞的HA-依賴性轉換的抗體介導的抑制。也評估了來自流感B毒株的具有HA蛋白的假型的中和。也根據針對流感A表位的本文方法產生針對流感B表位的肽基免疫原。
被動免疫。針對抗流感病毒攻擊的效力，測試從合成化合物/綴合物中產生的抗體制劑。被動免疫通過由利用構象穩(wěn)定的表位5和6進行的免疫獲得的兔抗體制劑進行說明。在用10 LD50單位的小鼠適合的流感A/PR/8/34——同型毒株——鼻內攻擊的BALB/ c小鼠中，分別顯示在40%和60%水平下的保護。針對免疫原3Α的抗體在兩個復制病毒攻擊實驗中保護了 10-20%的小鼠。
這些體內保護研究的方案包括在第-I、+1和+3天，相對于病毒攻擊，用來自接種疫苗的兔或預免疫對照的IgG進行腹膜內接種。每天觀察病毒接種的動物，定期稱重。就死亡的平均時間，針對個體對象或治療組(針對給定免疫原，預免疫兔IgG比較免疫兔IgG) 進行確定。在病毒接種后第2和4天對肺中的感染病毒進行滴定，以及在第2、4、6、8和14 天，對存活者，對小鼠血清中的兔IgG進行滴定。在相關次的后接種時進行小鼠肺中組織病理學的檢查。
活性免疫。將小鼠用合成肽免疫原活性免疫，以在HA2中或在HA融合前構象的主干域中的螺旋表位為目標。評估了對危險流感A/PR/8/34病毒攻擊的保護程度或敏感性。
材料和方法。4周大的BALB/c小鼠組(n=10)用100 μ I進行腹膜內免疫，其包含500 μ g氫氧化鋁凝膠佐劑，加僅作為對照的PBS、TT、或10 μ g的TT-綴合肽3MP、5P或 6P(對應于大約I μ g的肽)。用相同免疫原的兩次或三次加強免疫在2周間隔時間給出。 剛好在每次加強前，在來自每個組的代表性動物中收集血液樣品。對肽免疫原的抗體滴度通過ELISA進行測試，其中肽免疫原連接至BSA。在微中和測定中針對中和同型流感A/ PR/8/34的能力，體外測試小鼠抗體。通過用10 LD50單位(105 TCID50)的流感A PR/8/34病毒進行鼻內接種而攻擊動物。在攻擊后，針對存活、重量損失和臨床表現，每天監(jiān)視動物， 持續(xù)14天。在接種后，肺中的病毒滴度在第2、4和6天確定，并且肺的組織病理學在用 TT-連接的肽對僅PBS或TT免疫的動物中進行比較。
在一個實施方式中，提供了混合疫苗，即肽基綴合物的組合。提供了相關方法，使用抗原材料的組合對哺乳動物免疫。
在具體的實施方式中，本文的免疫原性組合物經肌肉注射施用。在進一步的實施方式中，實施多次給藥。在一個實施方式中，本文的免疫原性組合物與常規(guī)流感疫苗例如季節(jié)性三價滅活制劑結合使用，不管是以整合的方式還是作為協調給藥的不同組分。在另一個實施方式中，免疫原性組合物與鼻內施用的改性活流感疫苗結合使用。
在實施方式中，本發(fā)明的通用疫苗能夠提供廣泛和/或長效保護，免受流感A、或流感B或C的人和/或人獸互傳毒株的一種或多種同型和異型毒株的感染。相對于目前本領域狀態(tài)中的疫苗，本文描述的疫苗具有更低的由于抗原性漂移或轉移而每年變?yōu)檫^時的傾向，并且廣泛預防目前和未來的流感毒株。這些新型疫苗的另一個優(yōu)點是降低目前在全球范圍中使用的、預測人中流感A病毒的新抗原型出現的昂貴流感監(jiān)視程序的需要。
在實施方式中，綴合物肽免疫原或這種肽免疫原的組合，能夠提供穩(wěn)定和廣泛保護的疫苗制劑，具有持續(xù)保護宿主抵抗多種流感毒株的益處。在進一步的實施方式中，免疫原可提高目前毒株特異性流感疫苗的屬性，例如，關于交叉保護。如果沒有取代每年或更經常開發(fā)新特異疫苗的需要，這種新型疫苗其也可補充，諸如在最近HlNl爆發(fā)的情況。在其他實施方式中，抗這些新型免疫原的抗體可被動施用，以預防或治療流感A病毒感染。
2.更多的肽基免疫原。
如本文所描述的，利用根據下表的序列產生肽基免疫原。如本領域理解的并根據本文的教導，使用序列變異。
表I表位權利要求
1.構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元和載體分子的綴合物，所述綴合物具有結構式FXlCX-LX3-{[LX2]-[PX1-LX1-PX2]}m (FXl)；其中PXl為第一合成肽，PX2為第二合成肽，LXl為第一連接物，用于共價連接所述第一肽至所述第二肽；其中PX1-LX1-PX2形成構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元；LX2為第二連接物，用于連接所述雙鏈肽單元至載體分子，LX3為第三連接物或直接鍵，用于連接所述載體分子至所述第二連接物LX2，CX為免疫原性的載體分子，和 m為大于或等于I的整數；其中所述PXl和PX2合成肽各自獨立地包括對應于流感病毒血凝素蛋白干區(qū)的適合的肽序列，其中所述適合的序列由在整合在卷曲螺旋模板中的15至40個氨基酸的天然或合成HA2域片段組成，并且其中所述構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元PX1-LX1-PX2包括α -螺旋結構。
2.根據權利要求I所述的綴合物，其中第一肽PXl和第二肽ΡΧ2的所述流感病毒血凝素HA2域片段各自獨立地為源于對應于以下肽的氨基酸殘基的至少一個序列的所述天然或合成HA2域片段的片段Ρ3，氨基酸 391-411 ；Ρ4,409-429 ；Ρ5,423-445 ；Ρ6,455-476 ；1Α, WSN HA(342-360)；3Α, WSN HA(391-411)；4Α, WSN HA(409-429)；5Α, WSN HA(423-445)；6Α, WSN HA(455-476)；3Μ1[也被稱為 3Μ], WSN HA (381-411)；3Μ2[也被稱為 3Μ*]，WSN HA (381-411)；3ΜΡ, PR8 HA (381-409)；5Ρ, PR8 HA(420-448)；6Ρ, PR8 HA(448-476)；或其變異；其中殘基編號相對于Η3Ν2流感病毒毒株的全序列。
3.根據權利要求I所述的綴合物，其中PXl和ΡΧ2的所述適合的肽序列各自獨立地為以下序列的至少一個5Α. Τ, CAALNKKIDDLFLDIffTLNAELLVLL(SEQ ID NO:I)；6Α. Τ, CLNLKNLIEKLKSQIKNLAKEI(SEQ ID NO:2)；ΙΑ. Τ, CAALRGLIGALAGFIEGLffTGIRR(SEQ ID NO:3)；3Α. Τ, CAALTNKINSLIEKINTLFTAIGK(SEQ ID NO:4)；4Α. T，CAALGKEMNLEKRIENLNKKIDD(SEQ ID NO:5)；3M1. T/3M. T, IKSLQNAINGLTNKINSLIEKINTLFTACRR(SEQ IDNO:6)；3Μ2· T/3M*. T，IKSLQNAINRTNKINSLIEKINTLFTACRR(SEQID NO:7)；3MP. T, IKSLQNAINRLTNKINTLIEKINTLFTACRR(SEQ IDNO:8)；5P. T, IENLNKKIDDLFLDIffTLNAEILVLLENCRR(SEQ IDNO:_)；6P. T, IRTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR(SEQ IDNO:_)；或其變異。
4.根據權利要求2或3所述的綴合物，其中所述變異為使得變體序列與參比序列至少為 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。
5.根據權利要求2或3所述的綴合物，其中所述變異是保守置換或允許相對于參比序列有I至5個改變。
6.根據權利要求I所述的綴合物，其中所述卷曲螺旋模板具有肽序列，其中在對應于所述HA2域片段的至少兩個七殘基單元中異亮氨酸殘基在七殘基螺旋單元中的“a”位和亮氨酸殘基在“d”位。
7.根據權利要求I所述的綴合物，其中所述構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元能夠形成模擬一種或多種天然血凝素分子的融合前構象的流感病毒結構的表位。
8.根據權利要求I所述的綴合物，其中所述第一肽PXl和第二肽PX2各自為相同的肽。
9.根據權利要求I所述的綴合物，其中所述第一肽PXl和第二肽PX2為不同的肽。
10.構象穩(wěn)定的雙鏈肽化合物，所述化合物具有結構式FX2[PX1-LX1-PX2] (FX2);其中PXl為第一合成肽，PX2為第二合成肽，LXl為用于共價連接所述第一肽至所述第二肽的第一連接物；其中PX1-LX1-PX2形成構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元；其中所述PXl和PX2合成肽各自獨立地包括對應于流感病毒血凝素蛋白干區(qū)的適合的肽序列，其中所述適合的序列由整合在卷曲螺旋模板中的15至40個氨基酸的天然或合成 HA2域片段組成，并且其中所述構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元PX1-LX1-PX2包括α -螺旋結構。
11.根據權利要求10所述的化合物，進一步包括第二連接物LX2，其中所述化合物具有結構式FX3 [LX2]-[PX1-LX1-PX2] (FX3);其中LX2為第二連接物，用于連接所述雙鏈肽單元至載體分子或底物。
12.組合物，其包括在藥學可接受制劑中的權利要求1-11中任一項所述的綴合物或化合物。
13.組合物，其包括權利要求1-11中任一項所述的綴合物或化合物和佐劑。
14.根據權利要求1-9中任一項所述的綴合物，其中所述載體分子選自匙孔血藍蛋白 (KLH)和破傷風類毒素(TT)。
15.誘導抗流感病毒的免疫應答的方法，包括用權利要求1-14中任一項所述的組合物、綴合物或化合物接觸哺乳動物。
16.減少有需要的個體中的流感病毒感染的方法，包括將有效量的權利要求1-14中任一項所述的組合物、綴合物或化合物施用給所述個體。
17.分子，其為能夠結合至權利要求1-11和14中任一項所述的綴合物或化合物的抗體、其片段或其他抗原識別分子，其中所述結合為與所述構象穩(wěn)定的雙鏈肽單元表位的結入口 ο
18.根據權利要求17所述的分子，其為人源化的或全人的。
19.根據權利要求17所述的分子，其為單克隆抗體。
20.根據權利要求17所述的分子，其為這類分子的多克隆組合物的一部分。
21.根據權利要求17所述的分子，其能夠中和流感病毒。
22.流感感染的治療方法，其包括施用有效量的根據權利要求17所述的分子至有需要的對象。
23.根據權利要求1-14和17-31中任一項所述的綴合物、化合物或組合物在制造藥物中的用途。
24.根據權利要求1-14和17-31中任一項所述的綴合物、化合物或組合物在用于制造預防或治療流感病毒感染的藥物中的用途。
25.根據權利要求1-14和17-31中任一項所述的綴合物、化合物或組合物用于預防或治療流感病毒感染的用途。
26.根據權利要求1-11中任一項所述的綴合物或化合物，其中所述連接物LXl為PXl 和PX2的含硫氨基酸殘基之間的二硫橋鍵。
27.根據權利要求1-11中任一項所述的綴合物或化合物，其中所述連接物LXl為R1 (-NH2) -R2-R3 (-NH2)形式的化合物，其中R1和R3可獨立地為C1-C8烴基、C1-C8烷基、HOOC-C1--C8烴基或HOOC-C1-C8烷基，R2可為Cr-C8亞烴基(優(yōu)選cr(〕8亞烷基)或不存在。
28.基本上如本文所述的本發(fā)明和任何具體的實施方式。
29.根據權利要求9所述的綴合物，其中所述第一肽PXl和第二I肽PX2選自第-一對 3MPPR8HA2 (381-409)(SEQIDNO: 198)和 5P PR8HA2 (420-448) (SEQIDNO:199)9第:二對 3MPPR8HA2 (381-409)(SEQIDNO:202)和 6P PR8HA2 (448-476)(SEQIDNO:203);和第三對5PPR8HA2 (420-448) (SEQIDNO:206)和 6P PR8HA2 (448-476) (SEQIDNO:207)；其中對于每對的每個成員，模板化序列提供在圖14中并且任選地包括側翼RR組分。
30.在有需要的個體中誘導抗體應答的方法，所述方法包括以足以在所述個體中誘導抗體應答的量將根據權利要求I所述的綴合物施用至有需要的個體。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述抗體應答是產生中和抗體。
全文摘要
基于模板化綴合物的用于抵抗流感病毒的多種血清學不同毒株的疫苗。流感表位被模板化在雙鏈卷曲螺旋中。
文檔編號A61K39/145GK102939101SQ201180015866
公開日2013年2月20日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權日2010年1月26日
發(fā)明者R·S·霍奇斯, K·V·霍爾姆斯, Z·顏, W·J·哈特索克, Z·錢, B·E·B·希爾什 申請人:科羅拉多大學董事會，法人