專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療瘢痕疙瘩的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物的制備方法，具體地說(shuō)是一種治療瘢痕疙瘩的中藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
瘢痕疙瘩(keloid)是皮膚損傷后的病理性傷口愈合過(guò)程，其最顯著特征是成纖維細(xì)胞持續(xù)活化產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成份，尤其是膠原的過(guò)度沉積，導(dǎo)致真皮纖維化。 皮膚損傷可繼發(fā)于痤瘡、毛囊炎、耳部打孔、燒傷或手術(shù)等。與增生性瘢痕局限于原傷口區(qū)域內(nèi)不同，瘢痕疙瘩病變明顯超出原損傷范圍，邊緣常呈蟹足狀，向周?chē)M織侵入性生長(zhǎng)， 且一般不會(huì)發(fā)生退化和攣縮，因此被認(rèn)為是一種皮膚的良性腫瘤。全身皮膚都可以發(fā)生瘢痕疙瘩，但三角肌、前胸、上背部、耳垂等部位尤好發(fā)生。瘢痕疙瘩是一種人類(lèi)特發(fā)性疾病， 發(fā)病存在種族差異，有色人種如黑人或黃色人種發(fā)病率較高，我國(guó)發(fā)病率為3.4%，是白種人的5-15倍，好發(fā)于青年，存在家族遺傳傾向。瘢痕疙瘩是一種難治性皮膚病，由于病因和發(fā)病機(jī)制不詳，該病目前尚無(wú)徹底治愈的方法，其治療主要為對(duì)癥治療，比如臨床主要采用瘢痕內(nèi)注射皮質(zhì)類(lèi)固醇、手術(shù)切除、 冷凍治療、放射治療、激光治療以及硅膠、壓力等治療方法，這些治療方法療效有限，并可引起各種并發(fā)癥，而且容易復(fù)發(fā)，是整形外科的棘手難題。中藥對(duì)病理性瘢痕的防治有著久遠(yuǎn)的歷史，對(duì)其機(jī)制也有獨(dú)特的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為它主要由氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者相輔相成所致，治療上主要是活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為主。研究發(fā)現(xiàn)丹參、川芎嗪、積雪草甙、漢防己甲素以及雷公藤提取物等可抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成，抑制細(xì)胞增殖和有絲分裂，使細(xì)胞周期停滯；展示了中醫(yī)藥在瘢痕疙瘩治療中的廣闊應(yīng)用前景。臨床上有學(xué)者將丹參注射液外敷或注入瘢痕疙瘩組織內(nèi)，治療瘢痕疙瘩取得了一定療效；黃芪為扶正固本的常用中藥，在臨床及實(shí)驗(yàn)性研究中有明顯的抗肝、腎纖維化作用，最近有研究報(bào)道黃芪注射液對(duì)兔增生性瘢痕有明顯治療作用。瘢痕疙瘩也是一種皮膚的纖維化疾病， 其病理特征與肝、腎纖維化類(lèi)似，都是ECM成分的合成及降解失衡，導(dǎo)致膠原等ECM成分過(guò)度沉積。該病雖然沒(méi)有生命危險(xiǎn)，但它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來(lái)精神上的巨大痛苦。因而，闡明瘢痕疙瘩的分子發(fā)病機(jī)理，針對(duì)其發(fā)病的特異性環(huán)節(jié)研究和開(kāi)發(fā)治療瘢痕疙瘩的新藥已成為迫切需要。瘢痕疙瘩目前尚無(wú)徹底治愈的方法，參考文獻(xiàn)黃芪對(duì)家兔增生性瘢痕轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1表達(dá)及其Smad 3信號(hào)途徑的影響.張艷，邱林，李明勇.中華燒傷雜志，第沈卷第5期.2010黃芪對(duì)兔耳增生性瘢痕作用的實(shí)驗(yàn)研究.張艷，邱林，吳清華.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第35卷第6期.2010丹參活性成分的現(xiàn)代中藥藥理研究進(jìn)展.柳麗，張洪泉.中國(guó)野生植物資源，第22 卷第6期.2003
丹參對(duì)培養(yǎng)的人瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和膠原形成的影響.王芊，曹德君.中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，第11卷第1期.2002丹參注射液治療瘢痕疙瘩40例.楊衛(wèi).中醫(yī)雜志，第43卷第6期.2002丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.付辛芳，劉曉紅.中國(guó)藥業(yè)，第15卷第1 期·2006Gauglitz GG, Korting HC, Pavicic T et al., Hypertrophic scarring and keloids :pathomechanisms and current and emerging treatment strategies. Mol Med, 2011. 17(1-2) :113-25.布文博，王焱，方方.瘢痕疙瘩的治療[J]國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志，第37卷第1 期·201
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種治療瘢痕疙瘩的中藥組合物及其制備方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提取黃芪和丹參中的有效成分并優(yōu)選合適的比例關(guān)系，從而制備得到能夠治療瘢痕疙瘩的中藥組合物。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案本發(fā)明治療瘢痕疙瘩的中藥組合物的特點(diǎn)在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為0.5-5 10-50 1-8 ；所述黃芪總皂苷有效部位中黃芪總皂苷的質(zhì)量含量不小于50% ；所述丹參總酚酸有效部位中丹參總酚酸的質(zhì)量含量不小于50% ；所述總丹參酮有效部位中總丹參酮的質(zhì)量含量不小于50%。本發(fā)明治療瘢痕疙瘩的中藥組合物的特點(diǎn)也在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為1-4 15-40 2-7。本發(fā)明治療瘢痕疙瘩的中藥組合物的特點(diǎn)也在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為1 20 2.5。本發(fā)明治療瘢痕疙瘩的中藥組合物的制備方法，包括黃芪總皂苷有效部位的制備、丹參總酚酸有效部位的制備和總丹參酮有效部位的制備，其特征在于所述黃芪總皂苷有效部位的制備是將黃芪粉碎后用80% (體積百分濃度)的乙醇溶液回流提取3次，每次乙醇溶液的添加量為黃芪質(zhì)量的8倍，每次回流提取3小時(shí)，合并3次提取液，減壓蒸餾回收乙醇，濃縮至無(wú)醇味得到濃縮液，向濃縮液中加水至濃縮液溶解，然后上DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱，分別依次用水、30% (體積百分濃度)乙醇溶液和70% (體積百分濃度)乙醇溶液洗脫，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，再于 133Pa、60°C減壓干燥8小時(shí)，得到黃芪總皂苷浸膏即為黃芪總皂苷有效部位；所述丹參總酚酸有效部位的制備是將丹參粉碎后置滲漉器中，以水為溶劑，采用滲漉法提取總酚酸，滲漉液過(guò)濾后用DlOl大孔吸附樹(shù)脂吸附分離，經(jīng)80% (體積百分濃度)乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，將濃縮液于133Pa、60°C 減壓干燥8小時(shí)，得到丹參總酚酸浸膏即為丹參總酚酸有效部位，滲漉法提取總酚酸后的丹參藥渣收集備用；所述總丹參酮有效部位的制備是將收集的丹參藥渣用80%的乙醇溶液回流提取3次，每次乙醇溶液的添加量為丹參藥渣質(zhì)量的7倍，每次提取1. 5小時(shí)，合并3次提取液， 減壓蒸餾回收乙醇得到濃縮液，向濃縮液中加濃縮液2倍體積的蒸餾水?dāng)嚢鐸Omin后靜置 8-12小時(shí)，濾取沉淀物，依次用質(zhì)量濃度5%的Na2CO3溶液和水洗滌沉淀物，133Pa、60°C減壓干燥4小時(shí)，得到總丹參酮浸膏即為總丹參酮有效部位；將所述黃芪總皂苷浸膏、丹參總酚酸浸膏和總丹參酮浸膏按照配比量混合均勻后得到中藥組合物，即有效部位組合物。黃芪中的主要活性成分是皂苷，丹參中的主要活性成分是總丹參酮和總酚酸類(lèi)。 黃芪皂苷既溶于水又溶于乙醇，本發(fā)明用乙醇提取黃芪，得到乙醇的粗提物，再自粗提物中分離黃芪總皂苷；丹參酮溶于乙醇而酚酸溶于水，本發(fā)明先用水和乙醇對(duì)丹參藥材進(jìn)行提取，分別得到水和乙醇的丹參粗提物，再自粗提物中分離總酚酸和總丹參酮，最后將提取的黃芪總皂苷、丹參總酚酸和總丹參酮按一定比例混合后得到中藥組合物。中藥組合物可以按公知的工藝加工成口服制劑和皮膚給藥制劑，口服制劑如顆粒劑、片劑、膠囊劑和軟膠囊劑等，皮膚給藥制劑如軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、橡膠硬膏劑、巴布劑和搽劑等。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在1、本發(fā)明彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，不僅具有顯著的治療瘢痕疙瘩的作用，且無(wú)任何并發(fā)癥的發(fā)生。2、本發(fā)明是中藥制劑，與已有治療瘢痕疙瘩的藥物和技術(shù)相比，具有成本低、使用方便、療效顯著、長(zhǎng)期使用無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。
四

圖1是本發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)TGF- β i誘導(dǎo)的KFs侵襲力的抑制作用效果圖 (η =3, 7 ±力。圖1中與對(duì)照組相比較##Ρ<0.01 ；與模型組相比較*Ρ<0.05，**Ρ<0.01。圖2是本發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)KFs內(nèi)TGF- β ！誘導(dǎo)的Smad2/3C末端和連接區(qū)磷酸化的抑制作用(n=3, 7 ±勻。圖2中與對(duì)照組相比較·，< 0. 01 ；與模型組相比較 *P < 0. 05，**P < 0· 01。圖3是發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)KFs內(nèi)TGF- β ！誘導(dǎo)的Smad2/3/4復(fù)合物形成的抑制作用(η = 3, 7 ±勻。圖3中與對(duì)照組相比較##Ρ<0. 01;與模型組相比較鄺<0.05， **Ρ < 0. 01。圖4是本發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)KFs內(nèi)TGF-β i誘導(dǎo)的磷酸化Smads蛋白轉(zhuǎn)位入核的作用。圖5是本發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)KFs內(nèi)TGF-^1誘導(dǎo)的Smad7蛋白表達(dá)的影響(η =3, 7 ±勻。圖5中與對(duì)照組相比較#Ρ < 0. 05 ；與模型組相比較*Ρ < 0. 05。圖6是本發(fā)明中藥組合物(CASE)對(duì)KFs內(nèi)TGF-h誘導(dǎo)的PAI-ImRNA及蛋白表達(dá)的影響(n = 3, T ±勻。圖6中與對(duì)照組相比較#Ρ < 0. 01 ；與模型組相比較廣P < 0. 05， **Ρ < 0. 01。
五具體實(shí)施例方式現(xiàn)以大孔吸附樹(shù)脂吸附分離為例，非限定實(shí)施例敘述如下。
1、黃芪總皂苷的制備黃芪藥材粉碎后用80%的乙醇回流提取3次，每次8倍量乙醇，每次回流提取3小時(shí)，合并3次提取液，減壓蒸餾，回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味，濃縮液加水適量使溶，水溶液上 DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱吸附分離黃芪總皂苷，分別用水、30%、70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液并減壓回收乙醇，濃縮液置60°C減壓干燥，即得黃芪總皂苷浸膏。以黃芪甲苷為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定黃芪總皂苷浸膏中黃芪總皂苷含量，黃芪總皂苷含量> 50%。2、丹參總酚酸的制備丹參藥材粉碎后，置滲漉器中，以水為溶劑，采用滲漉法提取總酚酸，滲漉液濾過(guò)后，用DlOl大孔吸附樹(shù)脂吸附分離，經(jīng)洗脫、濃縮、減壓干燥，即得丹參總酚酸浸膏。以原兒茶醛為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定丹參總酚酸浸膏中丹參總酚酸的含量，丹參總酚酸含量彡50%。3、總丹參酮的制備在實(shí)施例2中，經(jīng)水滲漉提取后的丹參藥渣，繼用80%乙醇提取3次，每次加7倍量乙醇，每次提取1. 5h。合并3次濾液，減壓蒸餾，回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味，濃縮液加適量水?dāng)嚢鐸Omin后，靜置過(guò)夜，濾取沉淀物，用5% Na2CO3溶液充分洗滌沉淀物，濾過(guò)并水洗沉淀物，減壓干燥，即得總丹參酮浸膏。以丹參酮II A為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定總丹參酮浸膏中總丹參酮的含量，總丹參酮含量> 50%。4、片劑的制備取黃芪總皂苷浸膏0. 5份，丹參總酚酸浸膏10份，總丹參酮浸膏1份，加淀粉6份和滑石粉2份，混勻，用80% (體積百分濃度)乙醇制粒，60°C以下干燥，加入硬脂酸鎂(0.2 份)，混勻，壓制成片，即得。用法與用量口服。一次2片，一日3次。5、顆粒劑的制備取黃芪總皂苷浸膏5份，丹參總酚酸浸膏50份，總丹參酮浸膏8份，加蔗糖粉(63 份)和糊精(31. 5份)，混勻，以80% (體積百分濃度)乙醇制粒，60°C以下干燥，整粒，分裝，即得。用法與用量口服。一次1袋，一日2次。6、膠囊的制備取黃芪總皂苷浸膏3份，丹參總酚酸浸膏30份，總丹參酮浸膏5份，加淀粉12份和滑石粉8份，混勻，用80% (體積百分濃度)乙醇制粒，60°C以下干燥，裝膠囊，即得。用法與用量口服。一次4粒，一日3次。7、軟膠囊的制備取黃芪總皂苷浸膏1份，丹參總酚酸浸膏20份，總丹參酮浸膏2. 5份，混合后過(guò) 100目篩得干膏粉；取藥用大豆油20份、蜂蠟2份加熱熔融，冷卻至室溫，加入大豆磷脂1 份，攪拌至全溶，然后加入干膏粉，攪勻，壓制成軟膠囊，即得。用法與用量口服。一次3粒，一日3次。上述口服制劑患者口服劑量每日有效量，以有效部位組合物計(jì)為120 MOmg。
8、橡膠硬膏劑的制備 取黃芪總皂苷浸膏0. 5份，丹參總酚酸浸膏10份，總丹參酮浸膏1份，依次溶于25 份二甲基亞砜中，加橡膠基質(zhì)93份(其中橡膠、松香各16份，羊毛脂4份，凡士林1. 5份， 液體石蠟1份，氧化鋅20份，汽油45份)和月桂氮卓酮1. 5份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，涂膏，蓋襯， 切段及包裝，即得。用法與用量外用。貼患處。9、搽劑的制備取黃芪總皂苷浸膏5份，丹參總酚酸浸膏50份，總丹參酮浸膏8份，依次溶于800 份乙醇中，濾過(guò)，濾液中加入月桂氮卓酮20份，再加入乙醇使成1000份，攪勻，即得。用法與用量外用。涂布患處，一日2次。10、軟膏劑的制備分別采用乳劑型基質(zhì)、水溶性基質(zhì)和油脂性基質(zhì)，取黃芪總皂苷浸膏1份，丹參總酚酸浸膏20份，總丹參酮浸膏2. 5份，按各類(lèi)基質(zhì)所適用的制備工藝制備軟膏劑。(1)基于乳劑型基質(zhì)的軟膏劑制備取凡士林100份、液體石蠟60份、十八醇90份、月桂氮卓酮50份，置水浴上加熱至80°C左右使其熔化得油相溶液；將月桂醇硫酸鈉10份用620份蒸餾水溶解得到月桂醇硫酸鈉水溶液，備用；用二甲基亞砜15份溶解總丹參酮浸膏，然后加入月桂醇硫酸鈉水溶液中，混勻，再依次加入黃芪總皂苷浸膏、丹參總酚酸浸膏、甘油50份和尼泊金乙酯1份，溶解后水浴加熱至較油相溶液溫度略高，然后慢慢加入油相溶液中，邊加邊攪拌至冷凝，即得 0/W型乳膏。(2)基于水溶性基質(zhì)的軟膏劑制備將黃芪總皂苷浸膏、丹參總酚酸浸膏和總丹參酮浸膏依次溶于557份聚乙二醇 400中，加入370份聚乙二醇4000和50份月桂氮卓酮，水浴加熱至80°C，攪拌至冷凝，即得。(3)基于油脂性基質(zhì)的軟膏劑制備取黃芪總皂苷浸膏、丹參總酚酸浸膏和總丹參酮浸膏，混合后過(guò)120目篩得到浸膏粉，將浸膏粉和20份吐溫-80加入80份丙二醇中，水浴加熱至溶解，再加入10份月桂氮卓酮，攪拌溶解后得到混合溶液；另取300份羊毛脂與566份凡士林加熱熔化，放冷至近凝時(shí)加入混合溶液，攪勻，至凝即得。11、凝膠劑的制備取黃芪總皂苷浸膏3份，丹參總酚酸浸膏30份，總丹參酮浸膏5份，混合后過(guò)100 目篩得到浸膏粉，備用；取3. 8份卡波姆-940與19份甘油及100份蒸餾水混合，靜置Mh， 使其充分溶脹得到卡波姆基質(zhì)液，備用；將240份蒸餾水、1. 7份十二烷基硫酸鈉和浸膏粉混合，置80°C水浴加熱使浸膏粉溶解，然后加入0. 4份羥苯乙酯，攪拌溶解，隨后攪拌下緩慢加入卡波姆基質(zhì)液中，再加入0. 8份月桂氮卓酮，最后加三乙醇胺調(diào)pH值為6. 0 7. 0， 攪勻，即得。用法與用量外用。涂布患處，一日2次。12、涂膜劑的制備取黃芪總皂苷浸膏1份，丹參總酚酸浸膏20份，總丹參酮浸膏2. 5份，依次溶于90份乙醇中得到浸膏液；另取10份聚乙烯醇IM加入144份蒸餾水中，充分膨脹后水浴加熱溶解，攪拌下緩慢加入浸膏液，攪勻，即得。用法與用量外用。涂布患處，一日一次。13、巴布劑的制備取黃芪總皂苷浸膏1份，丹參總酚酸浸膏20份，總丹參酮浸膏2. 5份，混合后過(guò) 120目篩得到浸膏粉，備用；取2份聚丙烯酸鈉、1.8份聚乙烯醇、1份羧甲基纖維素鈉和5份明膠混合，加入21份水溶脹，然后加入0. 6份高嶺土、4份甘油、3份吐溫-80和0. 75份蓖麻油混合均勻，制成半固體基質(zhì)，將浸膏粉加入半固體基質(zhì)中，攪勻，涂膏，即得。用法與用量外用。貼患處。本發(fā)明中藥組合物(簡(jiǎn)稱(chēng)CASE)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)目的觀察復(fù)方芪參提取物(簡(jiǎn)稱(chēng)CASE)的體外抗瘢痕疙瘩作用。方法體外分離培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFs)，采用MTT細(xì)胞增殖、3H-脯氨酸膠原合成及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察CASE對(duì)KFs增殖、膠原合成及侵襲能力的抑制作用； 采用免疫沉淀和western blot法、細(xì)胞免疫熒光染色及熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法，觀察CASE 對(duì)KFs內(nèi)轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-^(TGF-i^)誘導(dǎo)的Smads蛋白磷酸化、復(fù)合物形成與轉(zhuǎn)位入核， 以及靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。1、實(shí)驗(yàn)材料1. 1細(xì)胞瘢痕疙瘩標(biāo)本來(lái)源于安徽醫(yī)科大學(xué)整形外科門(mén)診及住院手術(shù)患者，所有患者均無(wú)其他全身器質(zhì)性病變，所選對(duì)象均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)⑴。經(jīng)患者知情同意，無(wú)菌條件下取經(jīng)手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織，采用組織塊培養(yǎng)法在5% C02 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)原代培養(yǎng)， 待成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出并融合成片時(shí)進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)用傳至3-8代的KFs。1.2藥品與主要試劑本發(fā)明中藥組合物(簡(jiǎn)稱(chēng)CASE) ；DMEM培養(yǎng)基干粉購(gòu)于 Gibco公司；新生牛血清(NBS)購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；TGF-β i為Sigma 公司產(chǎn)品，用無(wú)菌的含0. 牛血清蛋白(BSA)4mmol · I^1HCL溶解，制成儲(chǔ)備液，_20°C保存?zhèn)溆?。各種抗體如兔抗 pSmad2C(SerW467) ,pSmad3C (Ser423/425)抗體、兔抗 Smad2/3 (FL-425) 抗體、鼠抗Smad2/3多克隆抗體、以及羊抗Smad7抗體和兔抗PAI-I抗體等為Cell Signaling technology>Santa Cruz Biotechnology等公司產(chǎn)品，兔抗pSmad2L(Ser249/254)、 pSmad3L (Ser207/212)多克隆抗體由日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)岡崎教授惠贈(zèng)。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR 試劑RNAiso Reagent 及 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)購(gòu)于 TaKaRa 公司。1. 3實(shí)驗(yàn)儀器YJ_1450型醫(yī)用凈化工作臺(tái)北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品。Napco-6100型C02培養(yǎng)箱美國(guó)杜邦公司。Multiskan MK3型酶標(biāo)儀荷蘭雷勃公司。 DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠。小型垂直電泳槽=Bio-Rad公司。Bio-Rad iCycle real-time PCR儀Bio-Rad公司。Tanon;3500凝膠成像系統(tǒng)上海天能公司。1-15PK 型高速冷凍離心機(jī)德國(guó) SIGMA 公司。ND-1000 spectrophotometer 核酸測(cè)定儀美國(guó)NanoDrop技術(shù)公司。熒光倒置顯微鏡日本Olympus公司。2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)均以表示，各組均數(shù)之間比較采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA方差分析及兩兩比較的Durmett-t檢驗(yàn)。3、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果3. ICASE對(duì)KFs增殖、膠原合成的抑制作用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)⑵分為空白對(duì)照組、NBS模型組、CASE組(3. 75、7. 5、15、30、 60mg · L力。KFs細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至單層90% 95%時(shí)消化，以含10% NBS的DMEM調(diào)整細(xì)胞為1 X 108/L密度接種于96孔培養(yǎng)板，370C ,5% C02飽和濕度下培養(yǎng)，待KFs細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至單層70% 80%時(shí)，無(wú)血清的DMEM同步化細(xì)胞。分別加入藥物或溶媒，繼續(xù)培養(yǎng)Mh。于培養(yǎng)結(jié)束前1 將終濃度為10 %的NBS加入除空白對(duì)照組外其余各組中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入MTT (5g · Ο Ομ 1。結(jié)束后每孔加入DMSO 150 μ 1。置酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度值(A570J。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率/<%= (0D麵-ODiaV(ODsa-C)D 對(duì)照)X 100%。結(jié)果見(jiàn)表1。表ICASE對(duì)NBS誘導(dǎo)的KFs增殖的影響(《 = 3,7 ±s)
組別劑量(mg_L—b吸光度(A570)抑制率(％)空白對(duì)照-0.68±0.09-NBS (10%)-1.23±0.10##-CASE3.751.17±0.1910.97.51.14±0.0216.4150.92±0.16 *56.4300.94±0.02"52.7600.78±0.04 “81.8與對(duì)照組相比較## <0.01 ；與模型組相比較:*P < 0. 05，**P <0.013H-脯氨酸摻入膠原合成實(shí)驗(yàn)(2)分為空白對(duì)照組、TGF^1GOpmol · L—1)模型組、CASE(3. 75,7. 5、15、30、60mg · L-1)五個(gè)劑量組。同上方法接種細(xì)胞，并更換無(wú)血清的 DMEM同步化細(xì)胞。藥物組加入相應(yīng)濃度的CASE，除對(duì)照組外其余每組加入40pmol ·廠1的下6 -01，共培養(yǎng)對(duì)11。然后更換含20 μ 1 3H-脯氨酸的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h。結(jié)束后棄上清液， 用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以多頭收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，液閃測(cè)定儀閃爍記數(shù)測(cè)定3H-脯氨酸摻入量。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表2。表2CASE對(duì)TGF-β i誘導(dǎo)的KFs膠原合成的抑制作用(n =3, 7 ±s)
權(quán)利要求
1.一種治療瘢痕疙瘩的中藥組合物，其特征在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為0.5-5 10-50 1-8 ；所述黃芪總皂苷有效部位中黃芪總皂苷的質(zhì)量含量不小于50% ；所述丹參總酚酸有效部位中丹參總酚酸的質(zhì)量含量不小于50% ；所述總丹參酮有效部位中總丹參酮的質(zhì)量含量不小于50%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療瘢痕疙瘩的中藥組合物，其特征在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為 1-4 15-40 2-7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療瘢痕疙瘩的中藥組合物，其特征在于所述中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為 1 20 2. 5。
4.一種權(quán)利要求1、2或3所述的治療瘢痕疙瘩的中藥組合物的制備方法，包括黃芪總皂苷有效部位的制備、丹參總酚酸有效部位的制備和總丹參酮有效部位的制備，其特征在于所述黃芪總皂苷有效部位的制備是將黃芪粉碎后用體積百分濃度80%的乙醇溶液回流提取3次，每次乙醇溶液的添加量為黃芪質(zhì)量的8倍，每次回流提取3小時(shí)，合并3次提取液，減壓蒸餾回收乙醇得到濃縮液，向濃縮液中加水至濃縮液溶解，然后上DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱，分別依次用水、體積百分濃度30%的乙醇溶液和體積百分濃度70%的乙醇溶液洗脫，收集體積百分濃度70%乙醇洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，再于133Pa、60°C 減壓干燥8小時(shí)，得到黃芪總皂苷浸膏即為黃芪總皂苷有效部位；所述丹參總酚酸有效部位的制備是將丹參粉碎后置滲漉器中，以水為溶劑，采用滲漉法提取總酚酸，滲漉液過(guò)濾后用DlOl大孔吸附樹(shù)脂吸附分離，經(jīng)體積百分濃度80%的乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，將濃縮液于133Pa、60°C減壓干燥 8小時(shí)，得到丹參總酚酸浸膏即為丹參總酚酸有效部位，滲漉法提取總酚酸后的丹參藥渣收集備用；所述總丹參酮有效部位的制備是將收集的丹參藥渣用80%的乙醇溶液回流提取3次， 每次乙醇溶液的添加量為丹參藥渣質(zhì)量的7倍，每次提取1. 5小時(shí)，合并3次提取液，減壓蒸餾回收乙醇得到濃縮液，向濃縮液中加濃縮液2倍體積的蒸餾水?dāng)嚢鐸Omin后靜置8_12 小時(shí)，濾取沉淀物，依次用質(zhì)量濃度5%的Na2CO3溶液和水洗滌沉淀物，133f^、6(TC減壓干燥4小時(shí)，得到總丹參酮浸膏即為總丹參酮有效部位；將所述黃芪總皂苷浸膏、丹參總酚酸浸膏和總丹參酮浸膏按照配比量混合均勻后得到中藥組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療瘢痕疙瘩的中藥組合物及其制備方法，其中治療瘢痕疙瘩的中藥組合物中黃芪總皂苷有效部位、丹參總酚酸有效部位和總丹參酮有效部位的質(zhì)量比為0.5-5∶10-50∶1-8；黃芪總皂苷有效部位中黃芪總皂苷的質(zhì)量含量不小于50％；丹參總酚酸有效部位中丹參總酚酸的質(zhì)量含量不小于50％；總丹參酮有效部位中總丹參酮的質(zhì)量含量不小于50％。經(jīng)體外藥效學(xué)試驗(yàn)表明，本發(fā)明明顯抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)刺激的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、侵襲移行能力，在防治瘢痕疙瘩中具有重要意義。
文檔編號(hào)A61K36/537GK102406703SQ201110341109
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者何淑芳, 張學(xué)軍, 張霄翔, 楊森, 楊雁 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué), 安徽醫(yī)科大學(xué)