一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物的制作方法
【專利摘要】一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應(yīng)用，它涉及一種應(yīng)用于養(yǎng)殖動(dòng)物病毒性感染防治的藥物以及該組合用藥物的制備及穩(wěn)定性控制方法。它的配方組成為：柴胡皂甙含量范圍：20-50μg/ml；柴胡揮發(fā)油含量范圍：紫外吸收值0.45以上；聚肌胞1-3mg/ml，分子量范圍：200-500bp(瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為：將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。它能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，阻遏病毒在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖。
【專利說明】一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于養(yǎng)殖動(dòng)物病毒性感染防治的藥物以及該組合用藥物的制備及穩(wěn)定性控制方法，具體涉及一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]病毒性感染是引起養(yǎng)殖動(dòng)物死亡、影響動(dòng)物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要因素，隨著國(guó)家獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范，取消了大批原地方標(biāo)準(zhǔn)的抗病毒藥物，可選用的抗病毒藥物的短缺與獸醫(yī)臨床的需求矛盾日益突出。
[0003]1967年，美國(guó)Merck藥廠的Field等人發(fā)現(xiàn)了酶促合成的雙鏈核酸(doublestrained RNA, dsRNA)具有誘生干擾素的能力，其中聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic Acid, PIC)的誘生能力最強(qiáng),它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生廣譜的內(nèi)源干擾素，進(jìn)而激活蛋白激酶和2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶、Mx蛋白等抗病毒因子，以降解進(jìn)入細(xì)胞的病毒，達(dá)到抑制、治療病毒性感染的目的。
[0004]PIC由寡聚肌苷酸與寡聚胞苷酸在合適的條件下按堿基配對(duì)的原則聚合而成。研究表明，PIC分子量的大小、雙鏈的緊密程度及其穩(wěn)定性是決定其誘導(dǎo)干擾素活性高低的重要影響因素。目前，國(guó)內(nèi)雖然有寡聚肌苷酸及寡聚胞苷酸原料的生產(chǎn)，但尚缺乏對(duì)雙鏈配對(duì)的合適條件、穩(wěn)定性影響因素等的系統(tǒng)研究，也未見到其與其他活性物質(zhì)配伍方面的報(bào)道。
[0005]國(guó)內(nèi)外的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究表明，PIC應(yīng)用于動(dòng)物體后，可發(fā)生一過性低熱的副作用，而如何防止這一副作用的發(fā)生，尚未見研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物及其應(yīng)用，它能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗病毒作用的合成核酸類化學(xué)藥品與中藥提取物的組合用藥物，以及本組合藥品穩(wěn)定性控制方法和在家禽，家畜、寵物和水產(chǎn)動(dòng)物上的應(yīng)用。
[0007]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案:它的配方組成為:柴胡皂甙含量范圍:20-50 μ g/ml ;柴胡揮發(fā)油含量范圍:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l-3mg/ml，分子量范圍:200_500bp (瓊脂糖凝膠電泳法)；它的制備方法為:將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。這些組分之間具有一定的促效與 增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0008]為了制成上述的復(fù)方制劑，需要對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行控制，以確保改組和藥品適合保存運(yùn)輸，從而具有上述的藥效。
[0009]所述的聚肌胞的合成方法為:
[0010]500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0.3g、氯化鈉0.6g以及適量的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，加熱至20-60°C，進(jìn)一步優(yōu)選為30-50°C之間的某一特定溫度，加入500mg聚胞苷酸攪拌使溶解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶解，保溫配對(duì)15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡揮發(fā)油400ml，充分?jǐn)嚢杌靹?，用注射用水定容?000ml, 0.45um微孔濾膜法過濾,灌封，100°C流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢、貼標(biāo)即得。
[0011]所述的柴胡皂甙、柴胡揮發(fā)油的分步提取工藝為:
[0012]柴胡飲片按料液比1: 6在30_60°C，進(jìn)一步優(yōu)化為35_45°C之間某一特定溫度下溫潰，收集相當(dāng)于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮，得到較高紫外吸收值的柴胡揮發(fā)油；溫潰后的柴胡藥材，按料液比1: 6，加入體積百分比濃度60-98%之間，進(jìn)一步優(yōu)選為75-96%之間某一特定濃度乙醇，加熱至45°C，回流提取1-1.5小時(shí)提取柴胡皂甙，提取液經(jīng)濃縮，得到較高濃度的柴胡皂甙。
[0013]因?yàn)楸窘M合藥物制備過程中需要加入較高濃度的柴胡揮發(fā)油及柴胡皂甙，而這兩種成分在提取過程中存在相互影響，所以本發(fā)明采用了兼顧兩種成分的分步提取工藝。
[0014]本發(fā)明具有以下特征:通過柴胡皂甙與dsRNA的協(xié)同作用，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，阻遏病毒在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖；另一方面，通過柴胡皂甙疏散退熱的功效，避免dsRNA類藥物可能出現(xiàn)的一過性低熱的副作用。本發(fā)明涉及以下過程:二步抽提法制備柴胡皂甙和柴胡揮發(fā)油的工藝參數(shù)；由聚肌苷酸與聚胞苷酸合成一定分子量大小并且對(duì)核酸酶具有一定抗性的dsRNA的工藝參數(shù)；本發(fā)明的穩(wěn)定化技術(shù)及其對(duì)家禽、家畜，水產(chǎn)動(dòng)物的藥效學(xué)研究。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1為本發(fā)明的熱源性測(cè)定示意圖，圖2為本發(fā)明對(duì)新城疫感染免疫后15d時(shí)攻毒后試驗(yàn)結(jié)果不意圖，圖3為本發(fā)明對(duì)新城疫感染免疫后22d時(shí)攻毒后試驗(yàn)結(jié)果不意圖，圖4為本發(fā)明對(duì)豬瘟病毒感染的保護(hù)作用示意圖，圖5為本發(fā)明對(duì)犬的犬瘟熱病毒感染的保護(hù)作用示意圖，圖6為本發(fā)明對(duì)虹鱒病毒感染的保護(hù)作用示意圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0016]【具體實(shí)施方式】一:本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:它的配方組成為:聚肌胞、柴胡皂甙和柴胡揮發(fā)油；它的制備方法為:將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按一定工藝制成復(fù)方制劑；這些組分之間具有一定的促效與增效作用，并且可以避免dsRNA的副作用。
[0017]【具體實(shí)施方式】二:參照?qǐng)D1，本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:取用兩組試驗(yàn)家兔，分別注射單純聚肌胞注射液和該組合藥物進(jìn)行熱源性試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)兔體溫變化情況。結(jié)果表明，該組合藥物能夠減輕單獨(dú)聚肌胞注射液的熱源反應(yīng)。
[0018]【具體實(shí)施方式】三:參照?qǐng)D2和圖3，本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:將該藥物用注射用水稀釋至50 μ g/ml。將240只試驗(yàn)用雛雞隨機(jī)分為6個(gè)試驗(yàn)組，每組40只。I組:空白對(duì)照組；11組:藥物對(duì)照組(黃芪多糖注射液，按每千克體重20mg) ；III組:疫苗對(duì)照組(無藥物)；iv組:高劑量藥物試驗(yàn)組(每千克體重0.1mg)…組:中劑量藥物試驗(yàn)組(每千克體重0.05mg) ；VI組:低劑量藥物試驗(yàn)組(每千克體重0.01mg)。將以上雛雞隔離籠養(yǎng)，空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組和 用藥試驗(yàn)組在不同雞舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)至10d，II1、IV、V、VI四個(gè)組進(jìn)行新城疫疫苗免疫。將各組再分別分成兩組，其中的一部分在免疫后15d，將I1、IV、V、VI組用藥物處理，12h后將I至VI組進(jìn)行第一次攻毒(攻毒500個(gè)單位LD5tl的ND強(qiáng)毒)，攻毒后24h將I1、IV、V、VI組再次注射與首次注射劑量相同的藥物觀察7d ;每個(gè)組的另一半雞在免疫后21d進(jìn)行攻毒，處理同第一次。
[0019]結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對(duì)家禽(雞)病毒病的自然感染發(fā)病有明顯的保護(hù)率和高的治愈率，能夠抑制病毒在家禽體內(nèi)的增殖。尤其對(duì)于免疫失敗的家禽病毒病的防治具有聞的效果。
[0020]【具體實(shí)施方式】四:參照?qǐng)D4，本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:將該藥物用注射用水稀釋至50 μ g/ml。將60頭試驗(yàn)用仔豬隨機(jī)均分為6個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組10頭。分組及試驗(yàn)方法如下:第I組為生理鹽水對(duì)照組；第II組為藥物對(duì)照組(黃芪多糖注射液，20mg/kg.bw);第III組為疫苗對(duì)照組(無藥物)；第IV組為疫苗組+藥物高劑量組(0.1mg/kg.bw);第V組為疫苗組+藥物中劑量組(0.05mg/kg.bw) ?’第VI組為疫苗組+藥物低劑量組(0.01mg/kg.bw)。
[0021]將斷奶仔豬按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，生理鹽水對(duì)照組與陽性對(duì)照組和用藥試驗(yàn)組在不同豬舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)至15天，II1、IV、V、VI4個(gè)組分別進(jìn)行豬瘟疫苗(免疫劑量為常規(guī)免疫劑量)免疫。免疫后15天，第II組注射黃芪多糖注射液；IV、V、VI組仔豬肌注藥物，12小時(shí)后進(jìn)行攻毒(攻毒劑量為500LD5(i豬瘟強(qiáng)病毒)，攻毒后24小時(shí)給藥組再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察7-15天。
[0022]結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對(duì)豬病毒病的感染發(fā)病有明顯的保護(hù)率和較高的治愈率，能夠抑制病毒在家畜體內(nèi)的增殖。能夠降低家畜的死亡率。
[0023]【具體實(shí)施方式】五:參照?qǐng)D5，本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:將該藥物用注射用水稀釋至50μ g/ml。將75只試驗(yàn)用犬隨機(jī)均分為5個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組15只。第I組為空白對(duì)照組；第I1、II1、IV組分別以聚肌胞藥物高、中、低劑量用藥試驗(yàn)組(高劑量組用藥劑量為0.lmg/kg.bw ;中劑量組用藥劑量為0.05mg/kg.bw ;低劑量組用藥劑量為
0.0 lmg/kg.bw);第V組為黃苗多糖注射液藥物對(duì)照組20mg/kg.bw。
[0024]將比格犬按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組和用藥試驗(yàn)組在不同犬舍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)一周后，I1、II1、IV組比格犬肌注聚肌胞藥物(按照各組的給藥劑量給藥)，12小時(shí)后試驗(yàn)犬全部注射500LD5(i的犬瘟熱病毒，攻毒后24小時(shí)各組按設(shè)計(jì)的方法再次注射與首次注射劑量相同的藥物，觀察7-15天。
[0025]結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物對(duì)寵物(犬)病毒病的感染發(fā)病有明顯的保護(hù)率和高的治愈率，能夠抑制病毒在寵物犬體內(nèi)的增殖。
[0026]【具體實(shí)施方式】六:參照?qǐng)D6，本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:將150條試驗(yàn)用虹鱒稚魚隨機(jī)均分為6個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)，每組25條。第I組為空白對(duì)照組；第II組為黃芪多糖注射液藥物對(duì)照組，給藥劑量為藥物推薦劑量;第II1、IV、V組分別以聚肌胞高、中、低劑量用藥(高劑量組用藥劑量為0.lmg/kg -bw ;中劑量組用藥劑量為0.05mg/kg -bw ;低劑量組用藥劑量為0.0 lmg/kg.bw);第VI組為攻毒對(duì)照組。
[0027]將虹鱒稚魚按以上實(shí)驗(yàn)分組隔離飼養(yǎng)，空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組和用藥試驗(yàn)組在不同漁缸中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件保持一致。飼養(yǎng)一周后，第II1、IV、V組虹鱒稚魚腹腔注射聚肌胞注射液，24小時(shí)后I1、II1、IV、V、VI注射3000TCID5(I的傳染性胰臟壞死癥病毒，攻毒后24小時(shí)后，按各組方案再次注射與首次注射劑量相同的藥液，觀察結(jié)果。
[0028]結(jié)果表明dsRNA與柴胡皂甙的藥物能夠抑制水產(chǎn)魚類病毒病增殖。從而達(dá)到對(duì)水產(chǎn)魚類病毒病感染的治療與預(yù)防作用。
【權(quán)利要求】
1.一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于它的配方組成為:柴胡皂甙含量范圍:20-50 μ g/ml ;柴胡揮發(fā)油含量范圍:紫外吸收值0.45以上；聚肌胞l_3mg/ml，分子量范圍:200-500bp，它的制備方法為:將上述組成部分添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料按水針劑生產(chǎn)工藝，經(jīng)配液、過濾、灌封、滅菌、檢驗(yàn)合格后即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于所述的聚肌胞的合成方法為:500ml注射用水中依次加入焦亞硫酸鈉0.3g、氯化鈉0.6g以及適量的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，加熱至20-60°C，加入500mg聚胞苷酸攪拌使溶解，保溫10分鐘，然后加入500mg聚肌苷酸攪拌使溶解，保溫配對(duì)15-30分鐘；上述溶液中加入紫外吸收值.1.6以上、柴胡皂甙含量0.4%以上的柴胡揮發(fā)油400ml，充分?jǐn)嚢杌靹颍米⑸溆盟ㄈ葜?000ml, 0.45um微孔濾膜法過濾，灌封，100°C流通蒸汽滅菌30分鐘，燈檢、貼標(biāo)即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dsRNA與柴胡皂甙的藥物，其特征在于所述的柴胡皂甙、柴胡揮發(fā)油的分步提取工藝為:柴胡飲片按料液比1: 6在30-60°C，收集相當(dāng)于藥材2倍量蒸餾液，減壓濃縮，得到較高紫外吸收值的柴胡揮發(fā)油；溫潰后的柴胡藥材，按料液比1: 6，加入體積百分比濃度60-98%之間濃度乙醇，加熱至45°C，回流提取1-1.5小時(shí)提取柴胡皂甙，提取液經(jīng)濃縮，得到較高濃度的柴胡皂甙。
【文檔編號(hào)】A61P31/12GK103751237SQ201110308866
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月13日
【發(fā)明者】胡鯨波 申請(qǐng)人:胡鯨波