專利名稱：共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種作為治療癌癥藥物的磁性納米載藥顆粒的制備工藝。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的是一種新型磁性納米載藥顆粒的制備工藝，通過化學(xué)共沉淀法法制備一種同時包封化療藥物柔紅霉素和P糖蛋白(P - gp)抑制劑5 -溴漢防己甲素的磁性四氧化三鐵納米顆粒，由于包封的磁性四氧化三鐵納米顆粒具有超順磁性，在交變磁場中具有磁靶向性，可以實(shí)現(xiàn)磁性納米顆粒靶向性傳遞和釋放包封的藥物，同時由于包封的磁性納米四氧化三鐵在交變磁場中具有磁感應(yīng)升溫特性，從而使這種新型磁性納米載藥顆粒集化療和熱療于一體，發(fā)揮較好的抗腫瘤作用。同時，它因具有磁靶向定位而降低柔紅霉素全身毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。上世紀(jì)70年代，Widder等首次提出磁控靶向藥物傳遞系統(tǒng)的概念，此后該藥物傳遞系統(tǒng)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。磁控靶向藥物傳遞系統(tǒng)是以具有超順磁性的納米顆粒為載體，與抗腫瘤藥物結(jié)合，通過外加磁場定位于腫瘤部位，控制磁性載體在體內(nèi)定向運(yùn)行至靶部位并釋放藥物發(fā)揮治療作用。磁性材料用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)鍵在于它們毒性低、生物相容性好、可通過靜脈注射給藥、能在靶組織中高濃度積聚等，而上述特征中毒性低是最為重要的因素。具有超順磁性的納米四氧化三鐵顆粒因具備良好的生物相容性、無毒副作用，成為最有前途的磁靶向性藥物載體。膠體氧化鐵顆粒在早期的臨床試驗(yàn)中就表現(xiàn)出了較好的體內(nèi)靶向性攜帶藥物的能力，并在患者體內(nèi)表現(xiàn)出安全、可以耐受的優(yōu)點(diǎn)。盡管磁控靶向藥物傳遞系統(tǒng)還沒有達(dá)到常規(guī)應(yīng)用于臨床要求的安全性和有效性，如釋放藥物的滲透深度和彌散廣度還較差，但它可以通過改進(jìn)合成工藝來達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的需要。磁靶向藥物傳遞系統(tǒng)能應(yīng)用于體內(nèi)的重要挑戰(zhàn)就是在達(dá)到靶器官之前就被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識別和清除，以及如何克服生物屏障，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、血腦屏障等。磁性載藥顆粒靜脈注射入體內(nèi)的命運(yùn)高度取決于它們的粒徑、形態(tài)、電荷和表面化學(xué)修飾，載藥顆粒的這些理化性質(zhì)直接影響它們后續(xù)的藥代動力學(xué)和生物分布。為了增加磁性載藥顆粒的有效性，采用一些技術(shù)如減小粒徑和表面活性修飾等來使得它們能夠“避開”上述生物屏障，增加血液循環(huán)時間，盡最大可能的到達(dá)靶部位。并且納米四氧化三鐵顆粒不僅可以用作藥物載體，而且在交變磁場下還可發(fā)熱升溫，將磁性納米顆粒靶向應(yīng)用在腫瘤組織內(nèi)，精確地將癌組織加熱到有效治療溫度，即 “適形熱療”，可達(dá)到對腫瘤熱療的自動控溫和恒溫，對腫瘤的熱療具有重要的意義。據(jù)美國癌癥協(xié)會提供的統(tǒng)計(jì)資料顯示，90 %以上癌癥患者的死因或多或少都與耐藥有關(guān)。多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，因而對臨床多藥耐藥發(fā)生的預(yù)防與逆轉(zhuǎn)已成為癌癥治療需要迫切解決的問題，也是人們研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)領(lǐng)域，它表現(xiàn)為細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時，對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)理不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥性。多藥耐藥作用機(jī)制多樣并互相影響，越來越多的證據(jù)表明，過表達(dá)腫瘤細(xì)胞膜表面 ATP -依賴的藥物外排泵——P - gp/ABCBl是多藥耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制之一。很多化療藥物，如蒽環(huán)類抗生素、紫杉醇等都能夠通過過度表達(dá)mdrl/P - gp途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥。 因而，有效的P - gp抑制劑可以抑制P - gp對腫瘤藥物的外排作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，提高化療效果。P - gp抑制劑的研究發(fā)展迅速，經(jīng)歷了第一、二代，目前已發(fā)展到第三代多個臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，它們在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中效果卻并不十分盡如人意。本課題組前期已行大量實(shí)驗(yàn)對多種多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑不斷篩選，我們認(rèn)為漢防己甲素具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。它是從千金藤屬防己科植物粉防己的根中的提取的一種生物堿，屬雙芐基異喹啉類化合物， 能有效逆轉(zhuǎn)P - gp介導(dǎo)的多藥耐藥，是非常具有開發(fā)前景的第三代逆轉(zhuǎn)藥。5 -溴漢防己甲素，是對漢防己甲素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、活性篩選的修飾物，具有活性強(qiáng)、毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-溴漢防己甲素對于白血病細(xì)胞K562/A02多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用是傳統(tǒng)漢防己甲素的3倍?；谝陨涎芯砍晒覀兪紫韧ㄟ^化學(xué)共沉淀法法制備了納米級的磁性四氧化三鐵顆粒，然后以油酸包裹以及Pluronic F127進(jìn)行表面修飾，將化療藥物柔紅霉素和P - gp 抑制劑5-溴漢防己甲素共同載入磁性四氧化三鐵納米顆粒，制備成磁性納米載藥顆粒，利用四氧化三鐵在交變磁場中具有磁靶向性，可以實(shí)現(xiàn)磁性納米顆粒靶向性傳遞和釋放包封的藥物，同時由于包封的磁性納米四氧化三鐵在交變磁場中具有磁感應(yīng)升溫特性，從而使這種新型磁性納米載藥顆粒集化療和熱療于一體，發(fā)揮較好的抗腫瘤作用。同時，它因具有磁靶向定位而降低柔紅霉素全身毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法，利用本發(fā)明可獲得磁響應(yīng)性強(qiáng)，粒徑較小(<200 nm)、水分散性較好、包封率較高、具有緩釋特性的納米顆粒。
技術(shù)方案本發(fā)明的共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法采用如下技術(shù)方案，
第一步將!^eCl3 · 6H20和!^eSO4 · 7H20溶于去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌器攪拌、水浴成鐵鹽溶液，將氨水緩慢滴入該鐵鹽溶液中，水解產(chǎn)生大量黑色的狗304晶體顆粒， 然后加入油酸，反應(yīng)一段時間后，升溫熟化，產(chǎn)物用永磁鐵分離，去離子水和無水乙醇洗滌多次，得油酸包裹的I^e3O4冷凍干燥備用；取上述油酸包裹的狗304，溶于去離子水中，加入普魯蘭尼克Pluronic F127，磁力攪拌，室溫過夜；將產(chǎn)物離心后，棄沉淀，得到油酸包裹普魯蘭尼克F127穩(wěn)定的!^e3O4膠體溶液，即空白磁性納米載體；
第二步取鹽酸柔紅霉素加入甲醇溶液，再加入三乙胺，超聲波處理，得疏水性柔紅霉素-甲醇溶液；取鹽酸5-溴漢防己甲素加入甲醇溶液，再加入三乙胺，超聲波處理，得疏水性5-溴漢防己甲素-甲醇溶液；
第三步取含磁性納米!^e3O4的水溶液，劇烈攪拌過程中逐滴加入疏水性柔紅霉素-甲醇溶液和5-溴漢防己甲素-甲醇溶液，反應(yīng)過夜，水洗、磁鐵分離，得共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒。FeCl3 · 6H20 禾Π FeSO4 · 7Η20 的質(zhì)量比例為13:9。鹽酸5-溴漢防己甲素、甲醇溶液、三乙胺的比例為5mg: ImL: 12 μ L。疏水性柔紅霉素-甲醇溶液、5-溴漢防己甲素-甲醇溶液的比例為5mg:ImL:12 μ L 。有益效果
1.采用化學(xué)共沉淀法成功制備出磁性四氧化三鐵納米顆粒，然后用油酸包裹和 Pluronic F127修飾，制備的油酸包裹及Pluronic修飾的四氧化三鐵透射電鏡下大小為 10^20 nm，分散性良好，傅立葉紅外光譜分析見油酸和Pluronic的特征峰參照圖2。2.本發(fā)明通過高分子聚合物Pluronic修飾磁性顆粒后有效改善了其在水中的分散性，平均粒徑135nm左右，多分散系數(shù)0. 18參照圖3，磁響應(yīng)性好，包封率高，穩(wěn)定性尚ο3.本發(fā)明制備的磁性納米載藥顆粒首次將化療藥物柔紅霉素和P - gp抑制劑 5-溴漢防己甲素共同載入磁性納米顆粒，制備的共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米顆粒能攜帶藥物進(jìn)入人白血病耐藥株K562/A02細(xì)胞中并緩慢釋放，這種方法能有效提高細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素的藥物濃度，延長柔紅霉素在細(xì)胞內(nèi)的存在時間，增加其抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。4.本發(fā)明的磁性納米載藥顆粒在外界磁場的作用下自動升溫到適合腫瘤的治療溫度并且持續(xù)控溫，同時實(shí)現(xiàn)藥物的釋放，它將腫瘤的化療和熱療相結(jié)合，以獲得更佳的抗腫瘤作用。5. 一定量的磁性納米載藥顆粒局部注射到移植瘤內(nèi)，在頻率為219kHz、場強(qiáng)為 10. 5 - 30. 1 kA/m，可以在40min內(nèi)使腫瘤區(qū)溫度升溫至41 - 45°C左右，而周圍正常組織溫度基本不變，表明該方法具有靶向定位加熱和恒溫的治療作用，且體內(nèi)腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)證明其聯(lián)合化療治療的效果優(yōu)于單純磁性納米鐵顆粒和單載柔紅霉素的磁性納米鐵顆粒。6. 一定量的磁性納米載藥顆粒體外作用于人類白血病耐藥細(xì)胞株后對細(xì)胞具有很強(qiáng)的生長抑制和促凋亡作用，與單純磁性納米鐵顆粒以及單載柔紅霉素的磁性納米鐵顆粒相比，效果更加顯著(p<0. 05)。7.磁性納米載藥顆粒是一種能集化療和熱療于一體的新型抗腫瘤制劑，并且具有磁靶向性、緩釋、副作用小等多重優(yōu)點(diǎn)，因此是極具應(yīng)用前景的抗腫瘤新劑型。


圖1是傅立葉紅外光譜分析，a - d分別代表純的!^e3O4、油酸包裹的狗304、純的 Pluronic F127以及油酸包裹、Pluronic穩(wěn)定的!^e3O4顆粒，D中可見Pluronic F127中的聚氧乙烯一聚丙乙烯鏈中的特征峰。圖2是將制備的共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的水合動力學(xué)半徑，平均水合半徑為135 nm，多分散系數(shù)0. 185。圖3是共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的體外釋放特性，說明其具有緩釋的功能。圖4是共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的磁效應(yīng)曲線圖，說明其具有良好的超順磁性。
具體實(shí)施例方式第一步將洸g FeCl3 · 6H20和18 g FeSO4 · 7H20溶于50 mL去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌器攪拌(7(ΚΓ800 rpm)，水浴70 ° C，將50 mL氨水緩慢滴入該鐵鹽溶液中，此溶液水解產(chǎn)生大量黑色的!^e3O4晶體顆粒，5分鐘后加入5g油酸，反應(yīng)30分鐘后，升溫至80 ° C熟化1小時，產(chǎn)物用永磁鐵分離，去離子水和無水乙醇洗滌多次，得冷凍干燥備用。稱取上述450 mg油酸包裹的!^e3O4，溶于45 mL去離子水中，加入150 mg Pluronic F127，磁力攪拌，室溫過夜。將產(chǎn)物離心(1000 rpm，10 ° C，10分鐘)后，棄沉淀，得到油酸包裹Pluronic穩(wěn)定的!^e3O4膠體溶液，即空白磁性納米載體。第二步取鹽酸柔紅霉素霉素5 mg加入1 mL甲醇，再加入12 μ L三乙胺，超聲10 分鐘，得疏水性柔紅霉素-甲醇溶液。取鹽酸5-溴漢防己甲素(15 mg/mL) 200 μ L加入600 yL甲醇，再加入7.2 μ L三乙胺，超聲10分鐘，得疏水性5 -溴漢防己甲素-甲
醇溶液。第三步取含30 mg磁性納米Fe^O4的溶膠7 mL,劇烈攪拌過程中逐滴加入柔紅霉素-甲醇溶液和5-溴漢防己甲素-甲醇溶液各300 μ L，反應(yīng)過夜，水洗、磁鐵分離，得共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒。實(shí)施例一種作為治療癌癥藥物的共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒
第一步將沈g FeCl3 · 6H20和18 g FeSO4 · 7H20溶于50 mL去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌器攪拌(7(ΚΓ800 rpm)，水浴70 ° C，將50 mL氨水緩慢滴入該鐵鹽溶液中， 此溶液水解產(chǎn)生大量黑色的狗304晶體顆粒，5分鐘后加入5g油酸，反應(yīng)30分鐘后，升溫至 80 ° C熟化1小時，產(chǎn)物用永磁鐵分離，去離子水和無水乙醇洗滌多次，得冷凍干燥備用。 稱取上述450 mg油酸包裹的!^e3O4,溶于45 mL去離子水中，加入150 mg Pluronic F127， 磁力攪拌，室溫過夜。將產(chǎn)物離心(1000 rpm, 10 ° C，10分鐘)后，棄沉淀，得到油酸包裹 Pluronic穩(wěn)定的Fe3O4膠體溶液，即空白磁性納米載體。第二步取鹽酸柔紅霉素霉素5 mg加入1 mL甲醇，再加入12 μ L三乙胺，超聲10 分鐘，得疏水性柔紅霉素-甲醇溶液。取鹽酸5-溴漢防己甲素(15 mg/mL) 200 μ L加入600 yL甲醇，再加入7.2 μ L三乙胺，超聲10分鐘，得疏水性5 -溴漢防己甲素-甲
醇溶液。第三步取含30 mg磁性納米狗304的溶膠7 mL,劇烈攪拌過程中逐滴加入柔紅霉素-甲醇溶液和5-溴漢防己甲素-甲醇溶液各300 μ L，反應(yīng)過夜，水洗、磁鐵分離，得共載柔紅霉素和5 -溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒。
權(quán)利要求
1.一種共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟第一步將!^eCl3 · 6H20和!^eSO4 · 7H20溶于去離子水中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌器攪拌、水浴成鐵鹽溶液，將氨水緩慢滴入該鐵鹽溶液中，水解產(chǎn)生大量黑色的狗304晶體顆粒， 然后加入油酸，反應(yīng)一段時間后，升溫熟化，產(chǎn)物用永磁鐵分離，去離子水和無水乙醇洗滌多次，得油酸包裹的I^e3O4冷凍干燥備用；取上述油酸包裹的狗304，溶于去離子水中，加入普魯蘭尼克Pluronic F127，磁力攪拌，室溫過夜；將產(chǎn)物離心后，棄沉淀，得到油酸包裹普魯蘭尼克F127穩(wěn)定的!^e3O4膠體溶液，即空白磁性納米載體；第二步取鹽酸柔紅霉素加入甲醇溶液，再加入三乙胺，超聲波處理，得疏水性柔紅霉素-甲醇溶液；取鹽酸5-溴漢防己甲素加入甲醇溶液，再加入三乙胺，超聲波處理，得疏水性5-溴漢防己甲素-甲醇溶液；第三步取含磁性納米!^e3O4的水溶液，劇烈攪拌過程中逐滴加入疏水性柔紅霉素-甲醇溶液和5-溴漢防己甲素-甲醇溶液，反應(yīng)過夜，水洗、磁鐵分離，得共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法，其特征在于FeCl3 · 6H20和FeSO4 · 7H20的質(zhì)量比例為13:9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法，其特征在于鹽酸5-溴漢防己甲素、甲醇溶液、三乙胺的比例為5mg:lmL:12 μ L ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法，其特征在于疏水性柔紅霉素-甲醇溶液、5-溴漢防己甲素-甲醇溶液的比例為5mg: ImL: 12 μ L。
全文摘要
共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒的制備方法涉及一種磁性納米載藥顆粒的制備工藝。將硫酸鐵、硫酸亞鐵按一定比例溶解于水中，在氮?dú)猸h(huán)境下加入氨水，并進(jìn)一步加入油酸，經(jīng)劇烈攪拌、高溫熟化等步驟得到油酸包裹的四氧化三鐵納米顆粒。得到的四氧化三鐵納米顆粒用適量PluronicF127修飾后得到空白磁性納米四氧化三鐵載體，再加入含有柔紅霉素和5-溴漢防己甲素的甲醇溶液，劇烈攪拌過夜，水洗，磁鐵分離即得共載柔紅霉素和5-溴漢防己甲素磁性納米四氧化三鐵顆粒。
文檔編號A61K47/02GK102302503SQ20111026654
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者吳瑋瑋, 張海軍, 王彩蓮, 王筠, 王雪梅, 程堅(jiān), 蔡曉輝, 陳寶安 申請人:東南大學(xué)