專利名稱：Erk抑制劑與lxr激動(dòng)劑組合藥物對(duì)動(dòng)脈硬化的防治的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ERK1/2抑制劑與LXR激動(dòng)劑組合藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治發(fā)揮極大作用以及建立一種機(jī)理明確的，具有較低副作用的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是冠心病的主要病理，積聚膽固醇的巨噬細(xì)胞是斑塊的主要成分。減少巨噬細(xì)胞中的膽固醇是防治冠心病的重要手段，ABCAl分子促進(jìn)細(xì)胞膽固醇外流、 抗動(dòng)脈硬化。核因子L)(R配體激活A(yù)BCAl表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化但引起脂肪肝。為防止此嚴(yán)重副作用，我們采用ERK1/2抑制劑與L)(R激動(dòng)劑組合藥物的療法，ERK1/2抑制劑與L)(R激動(dòng)劑組合藥物激活A(yù)BCAl等抗動(dòng)脈粥樣硬化基因的表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化斑塊的形成，同時(shí)利用二者能夠刺激ABCAl表達(dá)的倍增來(lái)降低LXR配體劑量從而降低引起脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，以此為基礎(chǔ)建立一種機(jī)理明確的、具有較低副作用的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑具有明顯的可行性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決核因子LXR配體激活A(yù)BCAl表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化但引起脂肪肝的嚴(yán)重毒副作用，本發(fā)明涉及采用ERK1/2抑制劑與L)(R激動(dòng)劑組合藥物的療法，利用二者刺激ABCAl 表達(dá)的倍增效應(yīng)來(lái)降低LXR配體劑量以及建立一種機(jī)理明確的、具有較低副作用的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。本發(fā)明的目的之一是闡明ERK1/2抑制劑與LXR激動(dòng)劑組合藥物防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理，并以此為基礎(chǔ)建立一種機(jī)理明確的、具有較低副作用的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。本發(fā)明的有益效果是ERKl/2抑制劑與LXR激動(dòng)劑組合藥物激活A(yù)BCAl等抗動(dòng)脈粥樣硬化基因的表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化斑塊的形成，同時(shí)利用二者能夠刺激ABCAl表達(dá)的倍增來(lái)降低LXR配體劑量從而降低引起脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)。


附圖1 :ERKl/2抑制劑對(duì)LXR激動(dòng)劑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的倍增效應(yīng)巨噬細(xì)胞采用氘標(biāo)記的膽固醇進(jìn)行標(biāo)記。細(xì)胞在接受L)(R激動(dòng)劑(TO)或ERKlA抑制劑或二者共同過(guò)夜處理后，測(cè)試從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外膽固醇接受體(前脂蛋白A，apolipoprotein A) 的外流結(jié)果。顯示ERK1/2抑制劑對(duì)TO-誘導(dǎo)的膽固醇外流有極大的倍增效應(yīng)。附圖2 動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠[(前脂蛋白E，apolipoprotein E)]敲除鼠喂食高膽固醇和高脂肪食物或該類食物中加入TO或UO或二者組合。在喂食4個(gè)月后，將小鼠處死，收集全主動(dòng)脈并對(duì)動(dòng)脈中出現(xiàn)的粥樣斑塊進(jìn)行染色，面積測(cè)定并定量、統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，無(wú)論是雌鼠還是雄鼠，組合藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化都有非常明顯的抑制效果，特別是對(duì) TO抑制的倍增效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上當(dāng)兩組數(shù)之間的ρ值即概率小于5%或0. 05時(shí)則認(rèn)為兩組數(shù)之間存在顯著性差異，P值越小則差異性越大。圖中帶有星號(hào)(女)即表明對(duì)應(yīng)的兩組之間存在顯著性差異。附圖3 組合藥物抑制L)(R激動(dòng)劑誘導(dǎo)的高甘油三酯現(xiàn)象對(duì)圖2中的小鼠在處死時(shí)收集血樣，提取血清。對(duì)血清中甘油三酯進(jìn)行定量分析。從圖3可以看出，L)(R激動(dòng)劑 (T0901317)顯著地增加血清中甘油三酯濃度，但組合藥物能明顯地抑制此現(xiàn)象，從而在防治動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中能防治脂肪肝等副作用的出現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上當(dāng)兩組數(shù)之間的P值即概率小于5%或0. 05時(shí)則認(rèn)為兩組數(shù)之間存在顯著性差異，ρ值越小則差異性越大。圖中帶有星號(hào)(*)即表明對(duì)應(yīng)的兩組之間存在顯著性差異。
具體實(shí)施例方式1.以apoE敲除(apoE-/-)的動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠為我們的研究對(duì)象，測(cè)試組合療法對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的預(yù)防效果。方法如下在喂養(yǎng)小鼠的高脂肪食物加入最優(yōu)化劑量的ERK1/2抑制劑和L)(R配體，在喂養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(如4個(gè)月)后，處死小鼠收集樣品進(jìn)行分析。收集的樣品包括血漿、心臟及完整的與心臟相連的動(dòng)脈系統(tǒng)、肝臟等。我們將作以下的測(cè)試①血漿和肝臟中的脂質(zhì)含量及其分布(如VLDL，LDL, HDL，甘油三酯和磷酯等)分析方法包括試劑盒與HPLC。②動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)分析方法為在小鼠安樂(lè)死之后對(duì)內(nèi)臟血管系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，然后小心地從心臟至下肢分叉(包括左右頸動(dòng)脈和鎖骨下的動(dòng)脈)等動(dòng)脈系統(tǒng)完好地摘除下來(lái)進(jìn)行固定。在顯微鏡下將動(dòng)脈血管外的結(jié)締組織剔除干凈后采用油紅-0(oil red 0)染色。將染色的動(dòng)脈系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄動(dòng)脈硬化斑塊面積大小，采用Metamorph軟件進(jìn)行形態(tài)分析以及用Marm-Whitney test來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。部分動(dòng)脈樣品進(jìn)行切片并用免疫組織化學(xué)法來(lái)測(cè)試樣品中的ABCAl表達(dá)和ERK1/2 活性的變化，同時(shí)以M0MA-2作為巨噬細(xì)胞的識(shí)別分子。用M0MA-2抗體來(lái)測(cè)試巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈根部的分布情況并與ABCAl的表達(dá)和ERK1/2的活性相關(guān)聯(lián)。③測(cè)試組合療法對(duì)肝臟脂肪合成的影響A、對(duì)肝臟功能的一般影響，包括肝臟重量及肝臟與體重之比、形態(tài)與組織學(xué)、轉(zhuǎn)氨酶活性(如谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等)。B、對(duì)肝臟脂肪酸、甘油三酯和磷酯合成與代謝通路的影響，被測(cè)試的分子包括SREBPlc、脂肪酸合成酶(FAQ、固醇輔酶A脫氫酶(SCD-I)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)、甘油3_磷酸酰基轉(zhuǎn)化酶 (glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)禾口月旨蛋白月旨化Sl (lipoprotein lipase, LPL)，方法將采用 Northern blot、Western blot 等。2.以apoE敲除(apoE-/-)的動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠為我們的研究對(duì)象，測(cè)試組合療法對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的治療效果。方法如下對(duì)模型鼠首先用高脂肪食物喂養(yǎng)12-15周， 對(duì)部分小鼠進(jìn)行安樂(lè)死、收集樣品。其余的小鼠繼續(xù)高脂肪食物的喂養(yǎng)(控制組)或喂養(yǎng)含有ERK1/2抑制劑與LXR配體的高脂肪食物(治療組)。繼續(xù)喂養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后(如4或8 周)，同樣將老鼠安樂(lè)死、收集樣品。對(duì)所收集的樣品進(jìn)行與上述1實(shí)驗(yàn)類似的分析測(cè)試。 此實(shí)驗(yàn)將顯示組合療法對(duì)已形成的動(dòng)脈硬化斑塊的作用即治療效果。
權(quán)利要求
1.ERK1/2抑制劑與L)(R激動(dòng)劑組合藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治的作用特征在于ERKl/2 抑制劑與L)(R激動(dòng)劑組合藥物激活A(yù)BCAl等抗動(dòng)脈粥樣硬化基因的表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化斑塊的形成，同時(shí)利用二者能夠刺激ABCAl表達(dá)的倍增來(lái)降低LXR配體劑量從而降低引起脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，以此為基礎(chǔ)建立了一種機(jī)理明確的、具有較低副作用的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述本發(fā)明所形成的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述本發(fā)明所形成的預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合藥物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治的新方法。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是冠心病的主要病理，減少巨噬細(xì)胞中的膽固醇是防治冠心病的重要手段。ABCA1分子促進(jìn)細(xì)胞膽固醇外流、抗動(dòng)脈硬化。核因子LXR配體激活A(yù)BCA1表達(dá)、抑制動(dòng)脈硬化但引起脂肪肝。為防止此嚴(yán)重副作用，本發(fā)明采用ERK1/2抑制劑與LXR激動(dòng)劑組合藥物的療法，利用二者刺激ABCA1表達(dá)的倍增效應(yīng)來(lái)降低LXR配體劑量。研究成果表明ERK1/2抑制劑與LXR激動(dòng)劑組合藥物能夠有效抑制小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有有效的防治效果，同時(shí)由于組合療法優(yōu)化了LXR激動(dòng)劑的使用劑量，降低了引起脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61K45/06GK102274518SQ20111026500
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者段亞君, 陳元利, 韓際宏 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)