專利名稱：一種防治老年癡呆癥復合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物制品領域，涉及一種防治老年癡呆癥復合疫苗及其制備方法。
背景技術：
癡呆癥屬于腦部疾病，是由于腦部不正常的退化引起的疾病。有統(tǒng)計顯示，患者多為老年人，臨床表現(xiàn)為患者由于大腦功能衰退，無論在記憶、運算、學習、理解、甚至語言、判斷力、方向感等方面都受到影響。該疾患不僅患者自身痛苦，對于其家庭乃至整個社會都會造成極為消極的影響。隨著老齡人的增多，老年性癡呆癥患者也在不斷增加。阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)即老年癡呆癥是退行性癡呆癥的一種常見形式。目前全世界大約有2500萬以上的AD患者。由于其發(fā)病年齡段的特點，備受處于老齡化階段國家的重視，因此，對于AD的研究意義重大。大量研究證實，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病通常是由于某種蛋白的異常所導致，目前已認識到，與退行性癡呆癥密切相關的有三種最重要的蛋白， 分別是淀粉質前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、Tau 蛋白和 a-synuclei (核突觸蛋白_α )。所述關鍵蛋白的明確為退行性腦部疾病種類的劃分提供了依據(jù)；上述阿爾茨海默病(AD)被歸為與淀粉質前體蛋白(APP)代謝紊亂相關的一類退行性癡呆癥。迄今為止，AD發(fā)病的確切機理尚未完全清楚，APP異常致病論也不是唯一的理論，但有一點可達到共識，就是由APP產(chǎn)生的淀粉樣蛋白-(amyloidP -peptide, Αβ )在AD的病理學上起了重要作用，即β淀粉樣蛋白神經(jīng)元毒性引起神經(jīng)元退行的學說仍占主導地位；該學說的機理總結為AD患者主要的病理改變有二，一是病變部位神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(neuro-fibrilIary tangles, NFT), 二是產(chǎn)生老年斑(senile plaques, SP)。研究顯示，神經(jīng)纖維纏結的主要成分是以成對雙螺旋絲樣結構形成聚集的異常磷酸化的Tau蛋白；Tau蛋白是一種與微管蛋白有關的磷蛋白，位于神經(jīng)元的突觸上，在成人腦中，正常情況下，Tau蛋白通過與微管蛋白結合而刺激微管蛋白集聚，并幫助維持和穩(wěn)定細胞內(nèi)骨架；當Tau蛋白過度磷酸化、異常糖基化、異常糖化、泛素蛋白化或所含微管結合基序的數(shù)目減少都會影響Tau蛋白與微管的結合，使神經(jīng)纖維退化。有研究顯示，AD患者腦內(nèi)可見Tau蛋白的過度磷酸化或異常磷酸化，且患者腦組織中的微管集聚功能明顯受損。另一方面，老年斑的成分是Αβ，Αβ由APP產(chǎn)生，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、星形細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞、內(nèi)皮細胞均能表達APP ;正常情況下，Aβ僅有極少量的表達；低濃度的Αβ對未分化、不成熟的神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，而高濃度的Αβ對已分化的成熟的神經(jīng)元則有毒性作用。已知Αβ的沉淀與APP的過度表達和異常加工有關；APP經(jīng)β，Y分泌酶降解產(chǎn)生Αβ生成可溶性和不可溶性兩種狀態(tài)，不溶的以β折疊為主，上述構象有利于Aβ的聚集。Αβ在形成高密度、纖維狀的聚合體后可引起神經(jīng)毒性，包括直接的毒性和增強、放大各種傷害性毒性，從而妨礙神經(jīng)細胞的正常生長與傳導，最終導致神經(jīng)細胞的死亡，引發(fā)AD。另有關轉基因小鼠的研究顯示，APP和Tau蛋白的突變都會導致Tau沉淀神經(jīng)纖維纏結，但其產(chǎn)生的淀粉樣斑塊在結構和數(shù)量上卻完全不同，所述結果也進一步說明在AD的發(fā)展進程中APP的改變先于Tau的改變。當前，有越來越多的證據(jù)表明，Aβ分解代謝和清除中遺傳性改變罹患晚發(fā)型AD的危險大大增加，該證據(jù)都為A β致病說提供了依據(jù)。所述的阿爾茨海默病的發(fā)生最終歸根于神經(jīng)組織受損，而導致這一事件發(fā)生的原因可能不是單一的方面，β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒作用表現(xiàn)為多種因素導致AD發(fā)病的共同通路，錯誤折疊的Αβ導致AD的病理和臨床表現(xiàn)；AD的病因有多種推測，比如環(huán)境、遺傳、體內(nèi)某些化學因素等。目前，通過對AD患者病變部位的免疫學和生物化學方面的研究發(fā)現(xiàn)，病變部位小膠質細胞及星形細胞高度活化，補體亦有產(chǎn)生，另外還有一些炎癥細胞因子、急性期反應物質、蛋白酶及蛋白酶抑制劑增高。上述研究結果充分說明炎癥反應與AD的病變有著密切關系，因此有觀點認為AD的神經(jīng)元損害大多為機體對病原體、β淀粉樣蛋白、神經(jīng)纖維纏結的炎性反應所致；炎性反應中，吞噬作用不僅吞噬病原體、β淀粉樣蛋白、神經(jīng)纖維纏結等，造成旁觀神經(jīng)元的損傷而產(chǎn)生更多的病灶，同時，活化的小膠質細胞及補體激活產(chǎn)生的炎癥細胞因子等使炎癥反應維持并不斷的增強，形成一個惡性循環(huán)。AD的許多促發(fā)因素如遺傳、環(huán)境因素等誘發(fā)的初始病變一旦形成即可激發(fā)炎癥反應，惡化后則導致更多的神經(jīng)元死亡，產(chǎn)生更多病灶，繼而激發(fā)更多的炎癥反應，則AD病情急劇加重。還有研究證實，AD的神經(jīng)病理組織中存在IL1、IL2、IL6、TNF、TGF等細胞因子的高表達；所述的細胞因子可直接導致神經(jīng)元細胞的死亡和凋亡，還可通過促使細胞黏附分子、補體分·子、載脂蛋白Ε、ΑΡΡ、Αβ的表達產(chǎn)生急性炎癥反應，促進可溶性Aβ形成難溶性纖維等加劇AD的病理過程。此外，小膠質細胞、星形細胞和單細胞是腦內(nèi)主要的免疫細胞，這些免疫細胞具有雙重作用當與淀粉樣老年斑接觸后即發(fā)生活化、合成、分泌細胞因子、炎性蛋白或蛋白酶抑制劑，促進Αβ肽的積累，導致神經(jīng)元損傷和免疫功能下調(diào)；但彌散性的神經(jīng)膠質細胞或單細胞卻可通過溶酶體途徑降解Aβ肽。目前已有研究證實，Αβ纖維可作為一種免疫信號，促進小膠質細胞的吞噬作用去除Αβ纖維。上述Αβ特異性的免疫反應可能代表了一種自然防御機制，以抵抗淀粉樣物質的沉積，但這些免疫機制在重癥AD患者中都呈降低趨勢。目前，臨床對于老年癡呆癥的治療，首先考慮的是對癥治療，如，應用修復受損神經(jīng)元的藥物改善臨床癥狀神經(jīng)節(jié)苷脂能有效修復受損或瀕死的腦神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)的修復再生及神經(jīng)網(wǎng)絡的重塑；膽堿酯酶抑制劑、腦代謝激活劑、抗抑郁藥物等有助于活血通絡，改善腦循環(huán)。現(xiàn)已知腦內(nèi)乙酰膽堿含量與記憶密切相關，老年人或癡呆病人腦內(nèi)乙酰膽堿量減少，補充膽堿類藥物能改善其記憶和思維能力；但是，對癥治療可以說只是緩解，治標不治本，因而基于AD致病機理的治療方法因其本領域研究者的關注，主要是針對A β形成的沉淀，比如，由于β、Y分泌酶是APP形成A β肽的兩個關鍵的酶，因此抑制任何一個酶都可以阻斷Αβ肽的產(chǎn)生，故β、Y分泌酶的抑制劑藥物的篩選成為一種重要的手段；再者，就是老年癡呆癥疫苗的研發(fā)；1999年Schenk首次應用PDAPP轉基因小鼠，證實接種化學合成的Αβ 42，可以減少腦內(nèi)Αβ，腦內(nèi)無老年斑沉積、神經(jīng)元失營養(yǎng)和星形膠質細胞炎癥，同樣還具有治療效果，AD主動免疫治療方法的探究由此開始了新紀元；繼而，又有諸多科學家通過A β免疫的方法減輕了動物AD的病理特征，由此可見，在AD動物病理模型中，通過主動免疫確實可以預防和減輕腦內(nèi)Αβ沉積。2001年，新疫苗ΑΝ-1792(合成的人Αβ 42肽)在100余例輕度到中度AD患者中進行了 I期臨床試驗，不同劑量給藥后，人體均能較好地耐受，相當數(shù)量的患者還產(chǎn)生了較強的體液免疫反應；上述結果使ΑΝ-1792順利進入II期臨床試驗。然而，2002年3月，在參加II期臨床試驗的360個病人中，有15人先后出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)非細菌性炎癥，2例出現(xiàn)了局部缺血性中風，該項臨床試驗因而被迫終止。有研究進一步證明，所述非菌性腦炎可能為T細胞引起的免疫并發(fā)癥；因為尸檢證實腦膜內(nèi)T細胞侵潤大多是CD4+T細胞，少量CD8+T細胞，研究者認為是患者產(chǎn)生了自身免疫反應而引起的腦炎的發(fā)生；上述結果使AD疫苗一方面有著喜人的療效，另一方面又出現(xiàn)了致命的副作用；因此，若能降低或消除免疫帶來的副作用即可達到最初利用免疫產(chǎn)生的Αβ抗體清楚淀粉樣蛋白的目的。為此，研究者們在不斷的研究與探討之中提出了不同的解決方案，比如，在疫苗治療同時加用非留體類抗炎藥、抗病毒藥或激素以預防炎癥的發(fā)生，另外，還有應用Αβ亞單位疫苗，去除Αβ毒性片段，可在產(chǎn)生抗體的同時抑制了不良的細胞反應；但上述方法都有其不利的一面，比如激素等抑制劑亦有副作用，采用亞單位疫苗，產(chǎn)生的抗體滴度不是很高等等。因此更好的方法有待探索
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供新的防治老年癡呆癥的疫苗，具體涉及一種防治老年癡呆癥疫苗及其制備方法。尤其涉及一種包括A β 42蛋白基因工程疫苗和編碼A β 42的核酸疫苗的復合疫苗。本發(fā)明的復合疫苗；能克服現(xiàn)有技術的AD蛋白疫苗的缺陷，預防、治療老年癡呆癥更加安全有效。本發(fā)明中，包括所述的復合疫苗在用于老年癡呆癥預防、治療時聯(lián)合使用Αβ 42蛋白基因工程疫苗與編碼A β 42的核酸疫苗，以產(chǎn)生高水平的抗A β抗體IgG，同時通過增強IL10、TGFii和fopxp3水平介導引起T細胞反應的抑制。本發(fā)明實驗證實，Αβ42蛋白基因工程疫苗和編碼A β 42的核酸疫苗組成的復合疫苗，或在給予A β 42蛋白基因工程疫苗時聯(lián)合使用編碼A β 42的核酸疫苗可顯著提高老年癡呆癥的治療效果。增加安全性。本發(fā)明所述的復合疫苗，包括活性成分和基質，所述的活性成分是以下物質⑴A β 42蛋白基因工程疫苗(以下簡稱蛋白)；(2)編碼A β 42的核酸疫苗(以下簡稱DNA)。上述活性成分的劑量如下述(I)Aβ 42蛋白基因工程疫苗的劑量為100^或200^;(2)編碼A β 42的核酸疫苗的劑量為IOOyg;使用時，所述的100 μ gDNA與100 μ g A β 42蛋白混合，或100 μ gDNA與200 μ gΑβ 42蛋白混合,本發(fā)明中，優(yōu)選以100 μ g與200 μ g混合。本發(fā)明中，所述的蛋白疫苗是將某種病毒的目的抗原基因構建在表達載體上，將已構建的表達蛋白載體轉化到細菌、酵母或哺乳動物或昆蟲細胞中，在一定的誘導條件下，表達出大量的抗原蛋白，通過純化后制備的疫苗；本發(fā)明中，所述的DNA疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗(engineering vaccine),是將病原的保護性抗原編碼的基因片段克隆入表達載體，用以轉染細胞或真核細胞微生物及原核細胞微生物后得到的產(chǎn)物，或者將病原的毒力相關基因刪除掉，使成為不帶毒力相關基因的基因缺失苗。本發(fā)明中，制備所述的疫苗時，所需試劑成分不要求特殊的反應條件，一般生物制品藥廠的設備即可生產(chǎn)。本發(fā)明的預防、治療老年癡呆癥的疫苗能引起T細胞免疫抑制，而不影響抗體的正常產(chǎn)生，且具有抗原專一性；所述的特異性細胞(T細胞)免疫抑制反應是通過增強IL1O、TGF0和fopxp3水平介導，從而對免疫反應進行有效調(diào)節(jié)，能防止機體中不必要的炎癥損傷。本發(fā)明進行了大量的實驗，包括(I) A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗聯(lián)合免疫不同小鼠鼠種后產(chǎn)生抗體情況的ELISA檢測和T細胞反應檢測，結果顯示，Balb/c小鼠二免后14天血清和28天血清的IgG稀釋了400后的OD值的比較中，Co42共免疫組較高，C57小鼠結果與前者相似；兩個鼠種免疫后的T細胞增殖實驗顯示Co42組SI刺激指數(shù)顯著降低，與單獨免疫蛋白或DNA組差異很顯著；(2) A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫在老年C57小鼠上的效果檢測，結果顯示，共免疫Co42組和單獨免疫蛋白組都能達到相當高的水平(至少51200倍)，T細胞反應受到 抑制，與單獨免疫組相比較有顯著性差異；(3)Αβ 42蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫劑量檢測，結果顯示，當DNA免疫的劑量為100 μ g，隨著加入的蛋白量的增加，抗Αβ 42抗體濃度也相應增高，但T細胞增殖卻不顯示為線性上升的趨勢，而是在IOOygDNA與IOOyg Αβ42蛋白，以及IOOygDNA與200μ gA0 42蛋白混合時出現(xiàn)免疫抑制，其中，以100 μ g與200 μ g混合時，免疫抑制結果差
異顯著；(4)Αβ 42抗原聯(lián)合免疫長效性實驗，結果顯示，共免疫組最后一次免疫后到第56天抗體低度有所下降，但仍處于一個較高的水平128000 ;DNA免疫組抗體滴度一直很低，這與DNA免疫誘導主要THl反應的機理相關，且與免疫劑量和未加免疫佐劑有關系；T細胞增殖結果顯示，聯(lián)合免疫的免疫抑制持續(xù)存在，在共免疫后相當長一段時間內(nèi)T細胞一直未被激活；(5)抗血清與Αβ纖維的結合能力檢測，結果顯示，相同稀釋度下，200yg蛋白與100 μ gDNA共免疫組結合的A β纖維(F.L.I.提供)最多，其結合能力最強，其次是100 μ g蛋白與100 μ gDNA共免疫組，再次是單獨IOOyg蛋白，最少的是單獨100 μ gDNA組；DotBlot結果與抗體IgG滴度的結果相一致，結果表明，A β 42抗原免疫產(chǎn)生的抗體可有效地結合Αβ蛋白纖維；同時，實驗結果還表明，血清中的針對Αβ42的抗體能與腦組織中的Αβ蛋白結合，功能顯著；而單獨免疫DNA組，由于抗體低度很低，幾乎無A β斑塊染出；(6)細胞因子水平測定，結果顯示，CD4-IFN Y在免疫組中變化不明顯，Αβ42蛋白免疫組的⑶4-IL4表達量較高，IL4與炎癥反應關系密切，而當Aβ 42蛋白與DNA共免疫后，IL4的表達量降低，結果表明，共免疫抑制IL4的表達，與抑制炎癥反應相關；此外，⑶4-IL10和foxp3在蛋白與DNA共免疫組內(nèi)都高表達，免疫抑制的發(fā)生與誘導出了高表達foxp3和ILlO的T調(diào)節(jié)性T細胞有關，且RT-PCR的結果依然顯示了 T細胞高表達ILlO和TGF β ；(7)免疫小鼠腦組織中⑶4+Τ細胞免疫組化染色情況實驗，結果顯示，在組織切片中沒有發(fā)現(xiàn)大量的CD4細胞浸潤，但在單獨免疫蛋白組的腦切片中血管內(nèi)，或血管附近都發(fā)現(xiàn)了少量陽性細胞，單獨免疫DNA組切片也顯示了一些陽性細胞，與DNA疫苗產(chǎn)生比較強的Thl型T細胞反應有關；在Naive陰性對照組，腦血管內(nèi)及其周圍都未見異常，Αβ蛋白與DNA共免疫組則同樣未見陽性T細胞出現(xiàn)；結果表明，A β蛋白與DNA聯(lián)合免疫能有效防止副反應腦膜炎的發(fā)生。實驗結果表明，本發(fā)明利用原核表達的Αβ 42蛋白抗原與pVAX-Λβ 42質粒共免疫，改進了老年癡呆癥蛋白疫苗，能產(chǎn)生高水平的抗Αβ抗體IgG，同時引起了 T細胞反應的抑制，且可持續(xù)相當長一段時間；所述共免疫產(chǎn)生的針對Αβ的抗體具有結合Αβ蛋白纖維以及APP/PS1老年癡呆癥轉基因發(fā)病小鼠腦內(nèi)天然A β蛋白沉淀的功能，顯示其清除A β沉淀的能力；本發(fā)明為預防、治療老年癡呆癥提供了一種極具潛力的、有效的、無副作用的疫苗。本發(fā)明的的疫苗與現(xiàn)有技術相比還具有以下優(yōu)點(I)所述的A β 42蛋白疫苗與A i3 42DNA疫苗聯(lián)合免疫的疫苗與單獨蛋白疫相比，如用于II臨床實驗的AN-1792疫苗相比更為安全有效，能抑制腦膜炎副反應的發(fā)生；與抗Αβ單抗相比造價更加低廉，更加持久；(2)能引起T細胞免疫抑制，而不影響抗體的正常產(chǎn)生，且具有抗原專一性；所述的特異性細胞(Τ細胞)免疫抑制反應是通過增強IL10、TGFi3和fopxp3水平介導，從而對免疫反應進行有效調(diào)節(jié)，以防止機體中不必要的炎癥損傷，能有效地克服現(xiàn)有的老年癡呆癥疫苗免疫治療中的缺點；(3)制備本發(fā)明所述的疫苗時，所需試劑成分不要求特殊的反應條件，一般生物制品藥廠的設備即可生產(chǎn)，生產(chǎn)方法簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)本發(fā)明的疫苗可用于老年癡呆癥的治療或者初期預防。為了便于理解，下面通過附圖和具體實施例對本發(fā)明的預防、治療老年癡呆癥的疫苗進行詳細的描述。需要特別指出的是，具體實施例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的技術人員可以根據(jù)本文說明，對本發(fā)明進行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本專利范圍之內(nèi)。


圖I為本發(fā)明的pMD18-T-AP 42和pVAXl-Λβ 42質粒酶切電泳圖，其中，A 為 BamHI 和 xbal 雙酶切 I、2 :pMD18-T_A β 42M1 :DL2000marker M2:DL15000marker,B 為 BamHI 和 xbal 雙酶切 3、4 :pVAXl_A β 42Μ DL15000markero圖2顯示了本發(fā)明的RT-PCR鑒定pVAXl-Λβ 42表達。圖3為本發(fā)明的pMD18-T-AP 42和pET28a-AP 42質粒酶切電泳圖，其中，A 為 BamHI 和 SalI 雙酶切 1、2 :pMD18-T_Aβ 42Μ DL2000marker,B 為 BamHI 和 Sail 雙酶切 3、4 :pET28a_Aβ 42Μ DL2000markero圖4為本發(fā)明的pMD18-T-A β 422c酶切電泳圖和pET28a_A β 422c菌落PCR電泳圖，其中，A 為 BamHI 和 EcoRI 雙酶切 1、2 :pMD18-T_Aβ 2c M DL2000marker,B 為 2-7 :菌落 PCR 結果 M DL2000markero圖5顯不了本發(fā)明的一拷貝Αβ42蛋白與兩拷貝蛋白原核表達SDS-page和WesternBlot0
圖6為本發(fā)明的Balb/c和C57小鼠免疫后抗A β 42抗體IgG比較圖。圖7為本發(fā)明的Balb/c和C57小鼠免疫后T細胞增殖實驗結果比較圖。圖8顯示了本發(fā)明的老年小鼠免疫后抗體和T細胞增殖實驗結果。圖9顯示了本發(fā)明的Αβ 42抗原共免疫劑量實驗結果，其中，A為抗體滴度檢測結果，B為加強免疫后7天，MTT法T細胞增殖結果。圖10顯示了本發(fā)明的Αβ 42抗原共免疫長效性實驗結果，其中，A :在三次免疫后第28天，42天，和56天采集血清檢測抗A β 42抗體IgG，共免疫組第42天滴度達到最高640000倍，第56天有所下降，滴度達達128000倍，B :第57天處死小鼠，檢測T細胞增殖情況?！?br> 圖11顯示了本發(fā)明的Αβ42免疫抗血清與Αβ蛋白纖維體結合能力的Dot Blot檢測結果。圖12顯示了本發(fā)明的抗血清與APP/PS1老年癡呆癥轉基因發(fā)病小鼠腦內(nèi)A沉淀結合熒光染色結果。圖13顯示了本發(fā)明的Aβ 42蛋白與DNA共免疫細胞因子表達結果。圖14顯示了本發(fā)明的Aβ 42蛋白與DNA共免疫APP老年癡呆癥模型小鼠結果。圖15顯示了本發(fā)明的共免疫APP老年癡呆癥模型小鼠結果，其中，A為水迷宮實驗示意圖，B為水迷宮實驗第2天小鼠游動軌跡圖，C為水迷宮實驗第1-5天尋找平臺時間統(tǒng)計圖，D為水迷宮實驗第2天尋找平臺時間統(tǒng)計柱狀圖，E為水迷宮實驗第6天小鼠游動軌跡圖，F(xiàn)為水迷宮實驗第6天小鼠第4. 5象限出現(xiàn)時間統(tǒng)計柱狀圖，G為抗體滴度檢測結果，H為MTT法T細胞增殖結果。
具體實施例方式下述實施例中所提到的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法；所提到百分含量如無特別說明均為質量百分含量。制備DNA從大腸桿菌中提取質粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質，雙鏈DNA經(jīng)乙醇沉淀而分離出來。以上提取方法和技術的詳細描敘可在Sambrook等人的"MolecularCloning"(第二版 I"8, Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約)和厲朝龍等編，《生物化學與分子生物學實驗技術》浙江大學出版社查尋。制備蛋白質和多肽從基因工程表達菌或細胞中提取。這些方法是公知的，在Doonan的"ProteinPurification Protocols" (1996, Humana Press, NJ)中有詳細描敘。實施例I制備老年癡呆癥A β 42核酸疫苗I)老年癡呆癥A β 42真核表達質粒的構建以質粒Abeta 42_C3d3 (麥克阿哥賈聶博士提供)為模板，在引物Pl :5’ -AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC-3’ 和引物 P2 :5’ -GCCTCTAGATTACGCTATGACAACA-3’，(在引物I和引物2，分別引入BamHI識別位點和XbaI識別位點)的引導下PCR擴增A β 42基因。反應體系:1 μ L 質粒模板，引物 I 和引物 2 各 10pmol，500mM KCl, IOOmM Tris-HCl (ρΗ8· 4)，1.5mM MgCl2,100 μ g/mL BSA, ImM dNTPs, 2. 5U Taq DNA 聚合酶，總體積為 25 μ L ;反應條件為94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸30秒，共30個循環(huán)；再將在I. 5%脂糖凝膠電泳中的DNA擴增片段回收，連接于pMD18-T克隆載體上；將連接產(chǎn)物轉化入DH5a細菌感受態(tài)細胞，Amplr抗生素LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌落，提取質粒，經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切鑒定，結果如圖IA所示，箭頭所指為連接入載體的目的片段，大小為132bp ;再將目的基因以BamHI和XbaI雙酶切，回收脂糖凝膠電泳中的DNA A β 42基因片段，連接于pVAXl (invitrogen)真核表達載體上。將連接產(chǎn)物轉化入DH5a細菌感受態(tài)細胞，Kanalr抗生素LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌落，提取質粒，以HindIII和EcoRI酶切鑒定結果如圖IB所示，箭頭所指即為目的片段，且經(jīng)序列分析后A β 42基因序列完全正確。2)老年癡呆癥A β 42質粒在真核細胞中的表達利用脂質體法將pVAXl-A β 42轉染BHK細胞系，48小時候收獲細胞，提取總 RNA (TRIZ0L,鼎國生物公司)，反轉錄為cDNA，反轉錄依照大連寶生物公司RNA RT-PCR操作指南，取純化的Iug總RNA置250 μ L離心管中，然后依次加入相關試劑4μ I MgCl2,2y I10 X 緩沖液，8. 5 μ I DEPC 水，2 μ I dNTP 混合物，O. 5 μ I RNase inhibitor, O. 5 μ IM-MLV反轉錄酶(Promage 公司),O. 5 μ L Oligo (dT) 12 引物；反應條件為 42 V 30min, 99。。5min,5°C 5min。再以第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，以上述引物進行PCR反應，檢測A β 42的表達帶；結果如圖2所示，轉染了 pVAXl-Λβ 42質粒組的細胞通過RT-PCR的方法擴增出了目的條帶，陰性對照㈠為不加反轉錄酶的RT-PCR反應組，陽性對照⑴為pVAXl-Ai3 42質粒作模板的PCR對照。 實施例2Α β 42蛋白的原核表達I)老年癡呆癥A β 42原核表達質粒的構建以Abeta 42_C3d3 為模板，在引物 I :5’ -AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC-3’ 和引物2:5’ -GCCGTCGACTAACGCTATGACAACA-3 ’(在引物I和引物2，分別引入BamHI識別位點和SalI識別位點)的引導下PCR擴增出Αβ42基因；回收目的片段連接于pMD18_T載體，經(jīng)酶切鑒定正確后將目的片段亞克隆到pET28a載體上，PCR體系與回收、酶切鑒定方法與“實施I”相同。結果如圖3所示，A為pMD18T-AP42質粒經(jīng)BamHI和SalI雙酶切結果，B為pET28a-A β 42質粒經(jīng)BamHI和SalI雙酶切結果，且序列分析結果正確。以pMD18T-AP 42 為模板，在引物 I :5’ -AAAGGATCCATGGATGCAGAATTCC-3’ 和引物2:5’ -GCCGTCGACTAACGCTATGACAACA-3 ’(在引物I和引物2，分別引入BamHI識別位點和SalI 識別位點)和 overlap DNA 片段 I :5’ -TCGGAATTCTGCATCTCCTCCTCCCGCTATGACAA-3’和片段 2 :5’ -CGGTGTTGTC ATAGCGGGAGGAGGA-3’ 引導下，進行 overlap PCR 反應，擴增出兩拷貝的Αβ42基因，反應體系lyL質粒模板，引物I、引物2和overlap DNA片段I、片段2各 10pmol，500mM KCl，IOOmM Tris-HCl(pH8. 4), I. 5mM MgCl2,100 μ g/mLBSA,ImM dNTPs,
2.5U Taq DNA聚合酶，總體積為25 μ L ;反應條件為94°C變性30秒，58°C復性35秒，72°C延伸30秒，共30個循環(huán)；回收兩拷貝的Αβ 42基因片段連接于pMDlS-T載體，經(jīng)酶切鑒定正確后將目的片段亞克隆到pET28a載體上，經(jīng)菌落PCR鑒定出陽性株。酶切鑒定方法與“實施例I”相同。2) 一拷貝Αβ 42蛋白與兩拷貝蛋白原核表達將pET28a_AP 42和pET28a_Aβ 422c質粒轉化入BL21 (DE3)原核表達菌株感受態(tài)細胞，篩選陽性菌株后以不同濃度IPTG誘導蛋白表達，誘導體系為5ml菌液，溫度為37°C或25°C，誘導時間為4小時；收集菌體，重懸于預冷的PBS中(包含終濃度10mL/LTritonX-100Umg/ml溶菌酶)，用超聲裂解細菌，再以12000rpm，于4°C離心15min，分離上清和沉淀分別用于SDS-page電泳檢測；經(jīng)檢測表達出的蛋白在沉淀中為包涵體，結果如圖5A所示，沉淀SDS-page中一拷貝的A β 42蛋白大小約7KD (箭頭所指)，在I. OmMIPTG時誘導，表達量最大，圖5Β中左圖所示兩拷貝Αβ 42重組質粒的BL21菌陽性菌株在不同IPTG濃度下蛋白誘導的表達情況，右圖顯示表達為包涵體沉淀形式，且最佳誘導溫度是37°C ；兩個拷貝Αβ42蛋白大小約13KD(下箭頭所指)，同時在2倍大小(約26KD)的位置還發(fā)現(xiàn)有很濃的表達條帶(上方箭頭所指)，鑒于Αβ 42蛋白傾向于聚集的性質，故懷疑形成了二聚體。利用Westerb Blot進行檢測，鑒定誘導表達出的蛋白確為Aβ蛋白。將經(jīng)鎳柱(QIAGEN公司)純化后的A β 42蛋白進行SDS-page，經(jīng)過轉膜將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，1% BSA 封閉一個小時，一抗 6E10(mouse)抗 Αβ 單克隆抗體(Leibniz Institute-FritzLipmann Institute, F. L. I.提供)I : 1000 室溫孵育 I 小時，anti-mouse-HRP 二抗(invitrogen) I 2000室溫孵育I小時，顯色；結果如圖5C所示，左圖為SDS-page考馬斯·亮藍染色結果，右圖為Western Blot結果，箭頭所指分別為兩個拷貝的A β 42蛋白和兩個拷貝Αβ 42蛋白的二聚體(上箭頭所指)。實施例3Αβ42蛋白疫苗與DNA疫苗聯(lián)合免疫不同小鼠鼠種后產(chǎn)生抗體情況的ELISA檢測和T細胞反應檢測選擇6-8周齡的Balb/c和C57BL/6兩個鼠種的小鼠進行免疫，通過檢測抗體IgG和T細胞增殖反應，檢測A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗聯(lián)合免疫是否能引起免疫抑制，且同時不影響抗體的產(chǎn)生。I) A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗聯(lián)合免疫Balb/c和C57BL/6小鼠后產(chǎn)生抗體情況的ELISA檢測將16只6-8周齡BALB/c或C57BL/6雌性小鼠分為4組，每組4只；第一組肌肉注射含50微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液50微升；第二組皮下免疫含一拷貝Αβ 42蛋白50微克，1/2體積弗氏完全佐劑乳化完全的蛋白抗原50微升；第三組同時皮下免疫含一拷貝Aβ 42蛋白50微克，1/2體積弗氏完全佐劑乳化完全的蛋白抗原50微升以及肌肉注射含50微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液50微升；第四組為不處理的Naive組；第14天再以相同注射方式和劑量加強免疫一次，取第二次免疫后14天、28天的血清用ELISA法測定其抗體滴度，檢測方法為將96孔酶標板用10ug/ml A β 42蛋白抗原包被，4°C過夜，3%小牛血清37°C封閉Ih ；PBST(0. 05% Tween20溶于PBS)洗滌3次，每次5分鐘；加入不同稀釋度的免疫小鼠血清，以未免疫的小鼠血清作對照，37°C孵育I小時；PBST洗板三次后，每孔辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG( 二抗，Sigma, St. Louis) 100μ 1，37°C孵育I小時后棄去，PBST洗滌3次，每次5分鐘；PBST洗三次，加入底物TMB液100 μ 1，室溫顯色反應20分鐘，2Μ硫酸中止反應，用酶標儀測定OD45cia52ci光密度值。Balb/c小鼠結果如圖6a所示，二免后14天血清和28天血清的IgG稀釋了 400后的OD值的比較,顯示Co42共免疫組較高，C57小鼠如圖6B所示,結果與前者相似。 2) A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗聯(lián)合免疫Balb/c和C57BL/6小鼠后T細胞反應情況檢測
將上述各組免疫小鼠以相同方法和劑量加強一次免疫，七天后進行MTT法T細胞擴增實驗，具體方法如下在無菌條件下，取脾制成單個細胞懸液，用紅細胞裂解液去除紅細胞，然后用PBS液洗三次，再將細胞懸液通過無菌的玻璃棉柱以去除B細胞，進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度到3X IO6個/ml，將每組細胞懸液分4份加入96孔平底細胞培養(yǎng)板中，每份設置三個重復孔。其中一份加入20 μ I Con A(有絲分裂原)至終濃度為10 μ g/ml,一份加入相應的特異性抗原(Αβ42)作為刺激物至終濃度為10μ g/ml，一份不加刺激物，一份加入BSA至終濃度為2 μ g/ml作為無關抗原對照，37°C溫箱培養(yǎng)72小時后，每孔加入20MTT至終濃度為lmg/ml，4小時后，將96孔板離心，去掉上清，每孔加入150μ I 二甲基亞砜(DMSO)使其完全溶解，在酶標儀上讀取570nm處的OD值，結果計算刺激指數(shù)SI =(各刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)/ (未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)，結果顯示，兩個鼠種免疫后的T細胞增殖實驗顯示Co42組SI刺激指數(shù)顯著降低，與單獨免疫蛋白或DNA組差異很顯著，P < O. 03 (如圖7A和B所示)。實施例4Αβ 42蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫在老年C57小鼠上的效果檢測選用老年癡呆癥小鼠模型C57小鼠；同時，為驗證由于動物在老化后，其免疫系統(tǒng) 可能有所削弱，免疫后是否仍然可以像在年輕小鼠上有相同作用，因此選用了 I年-I年2月大的老年小鼠進行實驗。將12只I年齡左右的老年小鼠分為四組，每組3只；第一組肌肉注射含50微克PVAXl-Aβ 42質粒DNA的PBS溶液50微升；第二組肌肉注射含一拷貝Aβ 42蛋白50微克，1/2體積弗氏完全佐劑乳化完全的蛋白抗原50微升；第三組同時肌肉注射含一拷貝A β 42蛋白50微克，1/2體積弗氏完全佐劑乳化完全的蛋白抗原50微升以及含50微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液50微升；第四組為不處理的Naive組。第14天再以相同注射方式和劑量加強免疫一次，在第二次免疫后14天收集血清，用ELISA方法檢測抗體IgG水平，實驗孔的OD值達到對照孔OD值的兩倍時認為是陽性；最后加強一次免疫，7天后進行MTT法T細胞增殖檢測。結果顯示，A為抗A β 42抗體IgG滴度的比較，共免疫Co42組和單獨免疫蛋白組都能達到相當高的水平(至少51200倍)，B為T細胞增殖結果，T細胞反應受到抑制，與單獨免疫組相比較有顯著性差異，P < O. 05(如圖8所示)。實施例5A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫劑量檢測本實施例進行不同劑量組合對C57小鼠進行免疫，確定A β 42蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫的合適劑量。將21只C578周齡雌性小鼠分為7組，每組3只；第一組肌肉注射含100微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液100微升；第二組肌肉注射含兩拷貝Aβ 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第三組同時肌肉注射含100微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液200微升以及含兩拷貝Aβ 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第四組同時肌肉注射含100微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液100微升以及含兩拷貝A β 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第五組同時肌肉注射含100微克pVAXl-Λβ 42質粒DNA的PBS溶液100微升以及含兩拷貝Αβ 42蛋白200微克的PBS溶液100微升；第六組同時肌肉注射含300微克pVAXl-A β 42質粒DNA的PBS溶液100微升以及含兩拷貝A β 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第七組為不處理的Naive組。第14天再以相同注射方式和劑量加強免疫一次，在第二次免疫后14天收集血清，用ELISA方法檢測抗體IgG水平；最后加強一次免疫，7天后進行MTT法T細胞增殖檢測實驗。結果顯示，當DNA免疫的劑量為100 μ g,隨著混入的蛋白量的增加，抗A β 42抗體濃度也是相應增高，但T細胞增殖卻不是一個線性上升的趨勢，而是在100 μ gDNA與100 μ gA@ 42蛋白，以及100 μ gDNA與200 μ g A β 42蛋白混合時出現(xiàn)免疫抑制，且以100 μ g與200 μ g混合的情況為差異顯著，P < O. 05 (如圖9所示)。 實施例6A β 42抗原聯(lián)合免疫長效性實驗
檢測免疫后持續(xù)的免疫效果的長短，對Αβ 42抗原的蛋白與DNA聯(lián)合免疫效果的長效性進行評價。將16只6-8周齡BALB/c或C57BL/6雌性小鼠分為4組，每組4只。第一組肌肉注射含100微克PVAXl-A β 42質粒DNA的PBS溶液100微升；第二組肌肉注射含兩拷貝A β 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第三組同時肌肉注射含100微克pVAXl-Ai3 42質粒DNA的PBS溶液100微升以及含兩拷貝Αβ 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第四組為不處理的Na‘ive組。第14天和第28天再以相同注射方式和劑量加強免疫二次，在第三次免疫后28天、42天、和56天收集血清，用ELISA方法檢測抗體IgG水平。并在第最后一次采血后處死小鼠，進行MTT法T細胞增殖實驗。結果顯示，共免疫組最后一次免疫后到第56天抗體低度有所下降，但仍然處于一個較高的水平128000 ;DNA免疫組抗體滴度一直很低(如圖IOA所示)，這與DNA免疫誘導主要THl反應的機理相關，且與免疫劑量和未加免疫佐劑有關系。T細胞增殖結果如圖IOB所示，聯(lián)合免疫的免疫抑制持續(xù)存在，在共免疫后相當長一段時間內(nèi)T細胞一直未被激活。實施例7抗血清與A β纖維的結合能力檢測研究表明，Αβ蛋白疫苗重要是通過機體產(chǎn)生的Αβ抗體清除腦內(nèi)Αβ治病蛋白的沉積，從而減輕老年癡呆癥患者的臨床癥狀；因此，只有證明了可與Αβ蛋白纖維有效結合的抗體的存在才能說明此免疫產(chǎn)生的抗體在功能上有效。為了證明本疫苗免疫產(chǎn)生的抗Αβ42的抗體的功能可與A β結合，本實施例應用以下的方法進行了間接的驗證一、抗血清與Αβ蛋白纖維結合的Dot Blot檢測將之前不同免疫組采集的血清(同組小鼠的血清混合在一起)按照一定低度稀釋，并點到硝酸纖維素膜上(每個低度點3μ1);待液體完全干后，將膜放入含2% BSA的TBS溶液中，室溫下?lián)u晃封閉40min ;用雙蒸水洗2次，再用IX TBST洗一次；將膜放入Αβ40蛋白TBS稀釋液中(終濃度I μ g/ml)，室溫下?lián)u晃孵育I小時；1X TBST洗三次，每次5分鐘；將膜放入2D8anti-A0 antibody TBS稀釋液中(I 1000)，室溫下?lián)u晃孵育I小時；IX TBST洗三次，每次5分鐘；將膜放入α-His antibody-HRP TBS稀釋液中(I 2000)室溫下?lián)u晃孵育I小時；1X TBST洗三次，每次5分鐘。ECL顯色。結果如圖IlA所示，相同稀釋度下，200 μ g蛋白與100 μ gDNA共免疫組結合的A β纖維(F.L.I.提供)最多，其結合能力最強，其次是IOOyg蛋白與IOOygDNA共免疫組，再次是單獨100 μ g蛋白，最少的是單獨100 μ gDNA組，B圖是分析Dot Blot各點的密度的評分圖。Dot Blot結果與抗體IgG滴度的結果相一致。結果證明，Αβ 42抗原免疫產(chǎn)生的抗體可有效地結合Αβ蛋白纖維，為其在體內(nèi)有效清除Αβ治病蛋白奠定了基礎。二、抗血清與APP/PS1老年癡呆癥轉基因發(fā)病小鼠腦內(nèi)Αβ沉淀結合將O. 4μ mAPP/PSl老年癡呆癥轉基因發(fā)病小鼠的腦組織組織切片分別至于24孔板的各孔中，個孔含PBS。清洗2-3遍；用10% NGS，O. 2% Triton XlOO in PBS，室溫封閉I小時；棄上清，PBS洗3遍，加入I 200倍稀釋后的來源于不同免疫組的血清；4度過夜孵育；移去上清，PBS 洗 3 遍，加入 Goat anti mouse second antibody (lable 488nm) 二抗稀釋液(I 1000)，室溫避光孵育I小時；移去上清，PBS洗3遍，移去PBS。用Dapi (I μ g/ml)復染，每個組織滴加2滴Dapi溶液，避光2min，迅速用PBS洗2次，將組織移到載玻片上，蓋上蓋玻片并封片；電鏡檢測。結果如圖12所不，監(jiān)色為Dapi復染結果，顯不了細胞，紅色則為抗體與腦內(nèi)A β蛋白的結合情況，PI為陰性血清組，由于血清內(nèi)無可以和Αβ蛋白結合的抗體，因此沒有Αβ斑點被染出來，3552抗Αβ單抗(F.L. I.提供)作為陽性對照，可見病鼠腦組織中無論是海馬區(qū)，還是大腦皮層有大量的Aβ斑塊。實驗組中，含有Αβ 42蛋白的免疫組的血清均可以染出大量的病灶斑塊，表明血清中的針對A β 42的抗體能和腦組織中的A β蛋白結合，功能顯著；單獨免疫DNA組，由于抗體低度很低，幾乎無A β斑塊染出。實施例8細胞因子水平測定將12只6-8周齡BALB/c或C57BL/6雌性小鼠分為4組，每組3只。第一組肌肉注射含100微克ρνΑΧ1-Αβ 42質粒DNA的PBS溶液100微升；第二組肌肉注射含兩拷貝A β 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第三組同時肌肉注射含100微克pVAXl-A β 42質粒DNA的PBS溶液100微升以及含兩拷貝A β 42蛋白100微克的PBS溶液100微升；第四組為不處理的Naive組。在第14天，以相同方法和劑量加強一次免疫，免疫后7天進行細胞因子的Rt-PCR檢測及流式細胞檢測。所述的Rt-PCR檢測方法如下取免疫后的小鼠斷頸處死后取出脾臟，提取總RNA(TRIZ0L，鼎國生物公司)，反轉錄為cDNA，反轉錄依照大連寶生物公司RNA RT-PCR操作指南，取純化的IygS RNA置250 μ L離心管中，然后依次加入相關試劑4 μ I MgCl2, 2 μ I 10 X 緩沖液，8. 5 μ I DEPC水，2 μ I dNTP 混合物，O. 5 μ IRnaseinhibitor, 0. 5 μ I M-MLV 反轉錄酶(Promage 公司)，O. 5 μ L Oligo (dT) 12 引物；反應條件為42V 30min,99°C 5min，5°C 5min。用看家基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)為內(nèi)源表達標準，進行PCR擴擴增，將各組cDNA濃度調(diào)為一致，再進行其他細胞因子的PCR擴增，其中，反應所需引物和PCR反應條件如表I所示。表I. HPRT，TGF^和IL-10的引物序列及PCR反應參數(shù)
權利要求
1.一種防治老年癡呆癥復合疫苗，包括活性成分和基質，其特征在于，所述的活性成分是以下物質 (I)A β 42蛋白基因工程疫苗，⑵編碼A β 42的核酸疫苗； 所述的A β 42蛋白基因工程疫苗的用量為100 μ g或200 μ g ;所述的編碼A β 42的核酸疫苗的用量為100 μ g。
2.按權利要求I所述的防治老年癡呆癥復合疫苗，其特征在于，所述的復合疫苗中100 μ g編碼A β 42的核酸疫苗與IOOyg A β 42蛋白基因工程疫苗混合。
3.按權利要求I所述的防治老年癡呆癥復合疫苗，其特征在于，所述的復合疫苗中100 μ g編碼A β 42的核酸疫苗與200 μ g A β 42蛋白基因工程疫苗混合。
4.權利要求I的防治老年癡呆癥復合疫苗的制備方法，其特征在于，其包括 1)制備編碼Aβ 42的核酸疫苗； 2)Αβ42蛋白基因工程疫苗； 3)將所述的100μ g編碼A β 42的核酸疫苗與100 μ g A β 42蛋白基因工程疫苗蛋白混合組成復合疫苗；或， 將所述的100 μ g編碼A β 42的核酸疫苗與200 μ g A β 42蛋白基因工程疫苗蛋白混合組成復合疫苗。
5.按權利要求I所述的防治老年癡呆癥復合疫苗，其特征在于，所述的復合疫苗其產(chǎn)生高水平的抗A β抗體IgG，同時引起T細胞反應的抑制。
6.按權利要求5所述的防治老年癡呆癥復合疫苗，其特征在于，所述的T細胞免疫抑制反應通過增強ILlO、TGF β和fopxp3水平介導。
7.權利要求I所述的防治老年癡呆癥復合疫苗在制備抗Aβ抗體IgG，同時引起T細胞免疫抑制的制劑中的用途。
8.按權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的制劑中，Αβ42蛋白基因工程疫苗的用量為100^或200^;所述的編碼^42的核酸疫苗的用量為100 μ g。
9.按權利要求I所述的防治老年癡呆癥復合疫苗，其特征在于，所述的復合疫苗的給藥方式是Αβ42蛋白基因工程疫苗和編碼Αβ42的核酸疫苗混合后以混合物形式給藥。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制品領域，涉及一種預防、治療老年癡呆癥的復合疫苗，由編碼Aβ42的核酸疫苗與蛋白基因工程疫苗混合組成，經(jīng)實驗證實，本發(fā)明利用原核表達的Aβ42蛋白抗原與pVAX-Aβ42質粒共免疫，改進了現(xiàn)有技術的老年癡呆癥蛋白疫苗，能產(chǎn)生高水平的抗Aβ抗體IgG，同時引起了T細胞反應的抑制，且可持續(xù)相當長一段時間；所述共免疫產(chǎn)生的針對Aβ的抗體具有結合Aβ蛋白纖維以及APP/PS1老年癡呆癥轉基因發(fā)病小鼠腦內(nèi)天然Aβ蛋白沉淀的功能，顯示其清除Aβ沉淀的能力；本發(fā)明的疫苗是一種極具潛力的、有效的、無副作用的疫苗，可用于預防、治療老年癡呆癥。
文檔編號A61K48/00GK102895659SQ201110217429
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權日2011年7月29日
發(fā)明者王賓, 于楊, 朱賢主, 王爽 申請人:復旦大學