專利名稱：一種核桃楸樹皮提取物及其在制備抗癌藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然藥物領域，具體涉及一種核桃楸樹皮提取物及其在制備抗癌藥物方面的應用。
背景技術：
在人類尋找新藥以及向疾病作斗爭的過程中，天然藥物的研究和開發(fā)發(fā)揮著重要作用。有數(shù)據(jù)表明，在全球應用的175種抗癌藥物中，約有57%直接或間接來源于天然產(chǎn)物。因而，從天然植物中尋找和開發(fā)新藥的前景十分廣闊。我國地域遼闊，天然藥物資源豐富，如何更加有效的利用這些天然藥物資源，開發(fā)出能造福于人類的新藥，是當前擺在藥物研究者面前的重要任務。傳統(tǒng)的天然藥物研究一般是通過先提取、分離、鑒定植物中的化學成分，然后對得到的化合物進行活性研究。這種方法工作量大，篩選中標率低而且易漏篩， 因而我們首先應用生物活性檢測跟蹤篩選到最佳組分，后再指導進行活性成分的分離，具有極大地創(chuàng)造性。核桃楸樹皮的提取物已被證實在抗癌癥方面具有一定的效果。但是核桃楸樹皮中的成分非常復雜，在所獲得的提取物中哪些是起關鍵作用，其中起主要抗癌活性的成分有哪些，它們的確切抗癌藥效到底如何，這些工作都缺乏系統(tǒng)和深入的探究。另外有關核桃楸抗腫瘤的研究主要集中于天然化學方面，應用的活性檢測模型也僅限于動物、組織等。而細胞水平的檢測用量少，操作簡便，作用機制明確，能更好地反映內(nèi)外環(huán)境綜合因素引起的整個機體生理變化，更易于評價藥物的作用和藥用價值，尤其令人關注的是比較適合較大規(guī)模藥物篩選，這也是本發(fā)明專利的創(chuàng)新性所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種在抗癌方面具有突出效果的核桃楸樹皮提取物。本發(fā)明的另一個目的在于提供該核桃楸樹皮提取物在制備抗癌藥物方面的應用。發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
發(fā)明提供了一種具有良好抗癌效果的核桃楸樹皮提取物，由以下方法步驟制備獲得 (1)將核桃楸樹皮用質(zhì)量分數(shù)7(Γ75%的乙醇溶液回流提取3. 5^5. 5h，蒸發(fā)回收乙醇獲得濃縮液，再在濃縮液中加水溶解，用乙酸乙酯進行萃取，獲得萃取液；(2)將萃取液干燥后，通過硅膠柱層析分離，所采用的洗脫劑為體積比3:2、1的氯仿甲醇混合液，獲得洗脫液。 優(yōu)選的洗脫劑為體積比5:Γ1:8的氯仿甲醇混合液；更優(yōu)選的洗脫劑為體積比1:1的氯仿甲醇混合液。步驟(1)所述的核桃楸樹皮是干燥的，其重量與所述乙醇溶液體積之間的比例為 30(T800g:5000ml。步驟(1)在進行濃縮時，濃縮至濃縮液是稠膏狀的，在濃縮液中加入的水的量相當于濃縮液的Γ7倍體積。采用乙酸乙酯進行萃取時，乙酸乙酯的用量相當于濃縮液的25 45倍體積。并且采用分次萃取，共萃取5 10次。步驟(2)所述的萃取液干燥是通過以下方法實現(xiàn)將萃取液蒸餾至干得到乙酸乙酯提取物，將按重量分數(shù)計為20份的乙酸乙酯提取物與7(Γ130份甲醇混合溶解，并加入 20^60份硅膠，研磨后，于4(T60°C下干燥7、小時。本發(fā)明同時保護了該核桃楸樹皮提取物在制備抗癌藥物方面的應用。尤其是在制備抗肝癌藥物方面的應用。發(fā)明可以優(yōu)選以下方案進行 1.提取 取干燥的核桃楸樹皮500g，粉碎后置圓底燒瓶中加70%的乙醇5000ml充分浸泡，置電熱套中并加冷凝管組成回流系統(tǒng)，反復回流提取3次，每次約1. 5h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇并濃縮提取物至稠膏狀，加5倍量水使之溶解分散。采用乙酸乙酯萃取10次，每次乙酸乙酯的用量為300ml。萃取液減壓蒸餾至干。2.硅膠柱層析分離
取200-300目硅膠約400g，用流動相氯仿1500ml充分浸泡攪拌，除去所有氣泡，濕法裝柱，輕輕敲打柱壁使其沉降均勻，勿使柱內(nèi)留有氣泡，充分靜止30min以上。靜止后剪取適當大小濾紙小心置于硅膠柱上層，以此來保護柱層免受擾動。取乙酸乙酯相提取物20g用 IOOml甲醇溶解，倒入研缽中與40g硅膠研磨，50°C干燥箱干燥過夜，次日干法上樣。采用氯仿-甲醇梯度洗脫，分別使用氯仿甲醇為1:0，30:1，15:1，7:1，3:1，1:1，0:1得到七組洗脫組份，編號為JMM廣7。對每個組份的活性測試表明，氯仿甲醇=1:1洗脫下的組份JMM6顯示出較強的腫瘤細胞增殖抑制作用，故取JMM6繼續(xù)做下一步分析。在核桃楸樹皮乙酸乙酯相抗肝癌藥用成分的提取、分離中，為了證實發(fā)明的有效性，發(fā)明進行了一系列對比試驗，并采用人肝癌BEL-7402細胞株作為實驗對象檢測它們細胞增殖抑制作用。發(fā)明采用的對比試驗如下
在萃取步驟中，發(fā)明采用了幾種萃取溶液的對比，分別是石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各3次，萃取液減壓蒸餾至干。分別得到石油醚組份，乙酸乙酯組份，正丁醇組份以及水相。MTT法檢測四種萃取相的細胞增殖抑制作用的試驗方法為取對數(shù)生長期的人肝癌BEL-7402細胞，胰酶消化，加培養(yǎng)基收集并分散成單個細胞懸液，調(diào)整細胞濃度4X IO4 個/ml，接種細胞懸液于96孔板，每孔加100 μ 1。將96孔板置C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，加入各提取物不同濃度的工作液，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相四種萃取相提取物的終濃度分別為500，250，125，62. 5，31. 25和15. 625μ g/ml。乙酸乙酯萃取相經(jīng)進一步硅膠柱分離后各組分加藥作用終濃度分別為200，100，50，25，12. 5,6. 25μ g/ml。對照孔加等體積的 RPMI1640培養(yǎng)液，DMSO終濃度為0. 5%。每組設3個復孔，放置于細胞培養(yǎng)箱(37°C，5%C02) 中分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h和72h。每孔加入20 μ 1 5mg/ml的MTT 37°C繼續(xù)孵育4h。酶標儀490nm處測量各孔的吸光度值(0D值)。計算細胞相對增殖率和IC5(1。采用MTT抗肝癌活性跟蹤分離中，對四種萃取相的活性測試表明，乙酸乙酯相組份對人肝癌BEL-7402細胞株顯示出最強的增殖抑制效應，故取乙酸乙酯相作為活性組份進行進一步的分離。其中MTT 結(jié)果顯示，乙酸乙酯相使BEL-7402細胞的存活率逐漸下降，與對照組相比表現(xiàn)出明顯的劑量_依賴效應，而且在6. 25-500 μ g/ml的濃度區(qū)間中還表現(xiàn)出明顯的時間-依賴效應。計算作用 48h 的 IC50 為 0. 15mg/ml。在硅膠柱層析分離一步，發(fā)明使用了以下梯度的洗脫液氯仿甲醇的體積比分別為1:0，30:1，15:1，7:1，3:1，1:1，0:1的七組洗脫液，分別洗脫得到七組洗脫組份，編號為JMM1-JMM7。MTT結(jié)果顯示，對于JMM1-JMM7組份，JMM6在用藥濃度25-200 μ g/ml分別作用人肝癌BEL-7402細胞株24，48和72h后，均表現(xiàn)出較強的增殖抑制作用， 且呈現(xiàn)出明顯的劑量和時間依賴效應?？梢娤疵撘篔MM6，即本發(fā)明所保護的核桃楸樹皮提取物具有突出的抗癌效果。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1.本發(fā)明提取分離獲得的核桃楸樹皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比現(xiàn)有的其他核桃楸樹皮提取物更好的效果，且提取分離方法簡單易行。2.在惡性腫瘤類疾病中，肝癌的致病特點是病情隱匿，惡性度高，臨床表現(xiàn)起伏急驟，患者用于此病的治療需投入較多的人力財力。野生核桃楸樹皮藥用成分的篩選、分離和制備的研究成果及其產(chǎn)業(yè)化運作必將為患者節(jié)省大量開支，減輕家庭負擔。同時野生核桃楸樹皮藥用成分等成果的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化必將受到更廣大患者的青睞，其市場潛力非常巨大，因此其經(jīng)濟效益是巨額的。另外一方面，野生核桃楸樹皮藥用成分未來在臨床上的推廣和應用，有助于完成肝癌的早期預防、前早期治療以及提高生存率，從而可以很好地促進社會人口健康，提高人口素質(zhì)，增強社會生產(chǎn)力，其社會效益同樣是巨大的。3.本成果獲得了核桃楸樹皮抗肝癌藥用成分篩選、制備和鑒定的方法，并首次通過藥物化學手段、分子手段、細胞手段全面而系統(tǒng)地探討了核桃楸樹皮抗肝癌藥用成分、抗肝癌作用機理及應用前景，可直接應用于核桃楸樹皮藥用成分的臨床治療實驗，與其它相關專利相比具有源頭創(chuàng)新性。4.本成果的獲得是通過半制備型高效液相色譜儀、液_質(zhì)聯(lián)用儀法、核磁共振儀、 紅外光譜儀、流式細胞儀、硅膠柱層析法等多項技術開發(fā)、研究核桃楸樹皮藥用活性成分， 與傳統(tǒng)的化學藥物成分制備、功能鑒定的手段相比，所采用技術手段先進可行，可直接應用于核桃楸樹皮在抗肝癌藥物方面的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化。5.我國核桃楸樹皮資源豐富，來源廣泛，若充分開發(fā)利用為天然藥用材料，就會真正達到變廢為寶、摒承祖國文化的目的。充分發(fā)揮我國的地區(qū)資源、發(fā)揮我國中醫(yī)中藥的文化精髓，這必然會使我們更好地搶占國內(nèi)藥品研發(fā)的知識產(chǎn)權(quán)制高點，與其它相關專利相比更具有研發(fā)的實際性。6.肝癌對整個社會人口健康危害巨大。本成果充分利用我國現(xiàn)有的民間資源和文化遺產(chǎn)，在抗肝癌研究中獲取具有重要應用價值的野生核桃楸樹皮藥用活性成分，并力爭能實現(xiàn)其開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化運作，這必將為整個社會帶來巨額的經(jīng)濟效益和社會效益。與其它相關專利相比具有更廣泛的實用性。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明的保護范圍作出何形式的限定。實施例1取核桃楸樹皮(干品)500g，粉碎后置圓底燒瓶中加70%乙醇4000ml，置電熱套中并加冷凝管組成回流系統(tǒng)，反復回流提取3次，第一次IOOOml回流lh，后兩次3000ml回流2. 5h， 共使用質(zhì)量分數(shù)70%的乙醇溶液4000ml回流提取3. 5 h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇并濃縮提取物至稠膏狀，加5倍量水使之溶解分散。水溶后分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分級萃取，各相萃取10次，每次300ml，共3000ml萃取液。將萃取液減壓蒸餾至干，分別得到石油醚組份，乙酸乙酯組份，正丁醇組份及水相組份。分別取少量各萃取部分，DMSO溶解，并過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，MTT法檢測其BEL-74 02腫瘤細胞抑制效應，計算IC5tl 值。結(jié)果顯示石油醚組份，乙酸乙酯組份，正丁醇組份，水相組份中乙酸乙酯萃取相組份IC5tl 值最小，抑制增殖作用最強，故選取乙酸乙酯萃取相組份進行后續(xù)的硅膠柱分離。實施例2
取干燥的核桃楸樹皮500g，粉碎后置圓底燒瓶中加70%的乙醇5000ml充分浸泡，置電熱套中并加冷凝管組成回流系統(tǒng)，反復回流提取3次，每次約1700ml，每次約1.證，共回流提取4.證。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇并濃縮提取物至稠膏狀，加5倍量水使之溶解分散。溶液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各10次，萃取液減壓蒸餾至干。分別得到石油醚組份，乙酸乙酯組份，正丁醇組份以及水相。對上述四個萃取相的抗腫瘤細胞活性測試，結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，石油醚組份，乙酸乙酯組份，正丁醇組份及水相中乙酸乙酯相組份IC50值最小，表明乙酸乙酯相組份對人肝癌BEL-7402細胞株顯示出較強的增殖抑制效應，故取乙酸乙酯相作為活性組份進行進一步的分離。
權(quán)利要求
1.一種核桃楸樹皮提取物，其特征在于由以下方法步驟制備獲得(1)將核桃楸樹皮用質(zhì)量分數(shù)7(Γ75%的乙醇溶液回流提取3. 5^5. 5h，蒸發(fā)回收乙醇獲得濃縮液，再在濃縮液中加水溶解，用乙酸乙酯進行萃取，獲得萃取液；(2)將萃取液干燥后，通過硅膠柱層析分離，所采用的洗脫劑為體積比3 2、 1的氯仿甲醇溶液，獲得洗脫液。
2.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(1)所述的核桃楸樹皮是干燥的，其重量與所述乙醇溶液體積之間的比例為30(T800g: 5000ml。
3.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(1)所述的濃縮液是稠膏狀的，在濃縮液中加入的水的量相當于濃縮液的Γ7倍體積。
4.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(1)所述的乙酸乙酯的用量相當于濃縮液的25 45倍體積。
5.如權(quán)利要求4所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(1)用所述乙酸乙酯進行萃取時，采用分次萃取，共萃取5 10次。
6.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(2)所述的萃取液干燥是通過以下方法實現(xiàn)將萃取液蒸餾至干得到乙酸乙酯提取物，將按重量分數(shù)計為20份的乙酸乙酯提取物與7(Γ130份甲醇混合溶解，并加入2(Γ60份硅膠，研磨后，于4(T60°C下干燥 7、小時。
7.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(2)所述的洗脫劑為體積比5:^1:8的氯仿甲醇混合液。
8.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物，其特征在于步驟(2)所述的洗脫劑為體積比1:1的氯仿甲醇混合液。
9.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物在制備抗癌藥物方面的應用。
10.如權(quán)利要求1所述的核桃楸樹皮提取物在制備抗肝癌藥物方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有良好抗癌效果的核桃楸樹皮提取物，由以下方法步驟制備獲得(1)將核桃楸樹皮用質(zhì)量分數(shù)70~75%的乙醇溶液回流提取3.5~5.5h，蒸發(fā)回收乙醇獲得濃縮液，再在濃縮液中加水溶解，用乙酸乙酯進行萃取，獲得萃取液；(2)將萃取液干燥后，通過硅膠柱層析分離，所采用的洗脫劑為體積比3:2~0:1的氯仿甲醇溶液，獲得洗脫液。本發(fā)明提取分離獲得的核桃楸樹皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比現(xiàn)有的其他核桃楸樹皮提取物更好的效果，且提取分離方法簡單易行。
文檔編號A61K129/00GK102274279SQ201110177959
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者崔玉強, 張詠莉, 李紅枝, 汪向升, 陸家政, 黃清松 申請人:廣東藥學院