專利名稱：γδT淋巴細(xì)胞中δ1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列及其TCR受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的多肽及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y S T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM及其TCR受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞與在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
機(jī)體的免疫系統(tǒng)在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了四種主要的抗原識(shí)別機(jī)制，分為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的模式識(shí)別、α βΤ細(xì)胞和B細(xì)胞的特異性識(shí)別、NK細(xì)胞針對(duì)內(nèi)部自我異常改變的識(shí)別和Y δ T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別(Morita CTHH, HHMariuzza RAHH, HHBrenner ΜΒΗΗ. Antigen recognition by human gamma delta T cells :pattern recognition by the adaptive immune system. HHSpringer Semin Immunopathol. HH2000 ；22 (3) 191-217 ；Zocchi MRHH, HHPoggi AHH. Role of gammadelta T lymphocytes in tumor defense. HHFront Biosci. HH 2004 Sep 1 ；9 :2588-604 ；Hochstenbach FHH, HHBrenner ΜΒΗΗ. Newly identified gamma delta and beta delta T-cell receptors. HHJ Clin Immunol. HH 1990 Jan ； 10(1) :1-18.)。目前，前三種抗原識(shí)別機(jī)制已基本研究清楚。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)是通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)如 TLR(toll-like receptor)識(shí)別種屬間標(biāo)志分子如病原相關(guān)分子(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)，依據(jù)兩個(gè)最保守分子之間的相互識(shí)別對(duì)侵入宿主的病原微生物進(jìn)行清除，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速(Takeda KHH，HHKaisho THH, HHAkira SHH. Toll-like receptors. HHAnnu Rev Immunol. HH2003 ；21 :335-76. Epub 2001 Dec 19·)。α β T 細(xì)胞和B細(xì)胞為主的抗原識(shí)別以精細(xì)而準(zhǔn)確的識(shí)別方式為特征，它們依據(jù)其抗原受體庫的高度多樣性和多信號(hào)協(xié)同作用能精細(xì)的區(qū)分一個(gè)抗原和其它數(shù)量眾多的外來抗原(抗原表位) 細(xì)微的差別。NK細(xì)胞能夠直接識(shí)別和殺傷一些腫瘤細(xì)胞而無需抗原預(yù)先作用。NK細(xì)胞的活性被其活化受體(殺傷細(xì)胞活化受體，KAR)或抑制受體(殺傷細(xì)胞抑制受體，KIR)與靶細(xì)胞上的某些配體或MHC-I類分子的相互作用所控制，其識(shí)別特點(diǎn)是通過帶有保守序列的受體對(duì)不變的配體進(jìn)行識(shí)別，針對(duì)內(nèi)部自我異常改變(Allison TJ, Winter CC, Fournie JJ, Bonneville Μ, Garboczi DN Structure of a human gammadelta T-cell antigen receptor. Nature 2001,411 :820-824 ；Kabelitz D， Wesch D， Hinz T gamma delta T cells, their T cell receptor usage and role in human diseases. Springer Semin Immunopathol 1999,21 :55-75.)。但作為天然免疫及獲得性免疫之間橋梁的、δ T細(xì)胞具體的識(shí)別機(jī)制目前還不清楚。人γ δ T細(xì)胞占人外周血⑶3+Τ細(xì)胞的2-5%，但是在小腸或皮膚等局部組織中為主要的T細(xì)胞亞群。、δτ細(xì)胞根據(jù)δ鏈V基因的不同，主要分為兩個(gè)亞型，外周血主要是γ9δ2Τ(νδ2)細(xì)胞亞型，而上皮組織中以δ 1型(ν δ 1)為主，同時(shí)配有不同的γ鏈 (Hayday AC. γ δ T cells :a right time and a right place for a conserved third wayof protection. Annu Rev Immunol 2000 ; 18 :975-1026.)?；罨?γ δ T細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性，并能產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(通常包括TNF-α和IFN-Y)。然而，由于對(duì)抗原的MHCI非限制性識(shí)別的特點(diǎn)，γ δΤ可能識(shí)別與α βΤ細(xì)胞不同的抗原配體，這使γ δΤ 細(xì)胞處于機(jī)體防御和免疫監(jiān)視的第一線(Hayday AC. γ δ T cells :a right time and a right place for a conserved third way of protection. Annu Rev Immunol 2000 ；18 975-1026. Girardi Μ, Oppenheim DE, Steele CR, et al. Regulation of cutaneous mal ignancy by gy T cells.Science 2001；294 :605-9.)。人γ δ T細(xì)胞識(shí)別腫瘤表面表達(dá)的抗原。V δ 1識(shí)別MICA/B和ULBP家族。從結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(TIL)中分離出來的νδ1Υ δΤ細(xì)胞不僅能裂解來自自體的，也能裂解各種同種異體上皮腫瘤細(xì)胞(Maeurer MJ, Martin D, Walter W, et al. Human intestinal Vyl+T lymphocytes recognize tumor cells of epithelial origin. J Exp Med 1996;183:1681-96.)。在熱應(yīng)激或者氧化壓力條件下，可以誘導(dǎo)MICA/B和ULBP1-3 在許多上皮腫瘤細(xì)胞以及一些淋巴瘤細(xì)胞表面以各種水平表達(dá)。表達(dá)MICA/B和ULBP1-3 的腫瘤及淋巴瘤細(xì)胞能夠被V δ IT細(xì)胞所識(shí)別并殺傷，且這種殺傷是通過MICA直接識(shí)別 γ δ TCR(y δ T 細(xì)胞受體)來實(shí)現(xiàn)的(Wu J. ,Groh V. ,Spies Τ. T cell antigen receptor engagement and specificity in the recognition of stress-inducible MIC by human epithelial γ δ T cells. J. Immumol2002 ；169 :1236-1240. Zhao J, Huang J, Chen H, Cui L, He W. V δ 1 T cell receptor binds specifically to MHC I chain related A:molecular and biochemical evidences. Biochem Biophys Res Commun 2006 ；339 232-40.)。￥5 21~細(xì)胞識(shí)別磷酸類非肽抗原和？141 &紹。這類抗原通常是來自類異戊二烯(isoprenoid)生物合成途徑的產(chǎn)物。其中對(duì)Y δ T刺激活性最強(qiáng)的是羥甲異戊烯二磷酸酉旨((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2_enyl pyrophosphate, HMBPP)。TCR(人T細(xì)胞受體)由δ鏈和與其匹配的γ鏈組成，其抗原結(jié)合部位是由六個(gè)抗原決定簇(CDR)形成的，這六個(gè)CDR在識(shí)別抗原時(shí)作用是不同的，其中CDR3區(qū)在抗原識(shí)別時(shí)，占有主導(dǎo)地位。鑒于TCR δ⑶R3區(qū)(⑶R3 δ )與抗體重鏈的⑶R3區(qū)在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，因此，研究人員提出了 CDR3 δ的一級(jí)結(jié)構(gòu)是決定TCR γ δ識(shí)別抗原特異性關(guān)鍵部位的學(xué)術(shù)假說。根據(jù)卵巢上皮癌(OEC)組織浸潤(rùn)的γ δΤ細(xì)胞(γ STIDTCR的一個(gè) ⑶R3 δ的基因序列(OB)，人工合成了 0Τ3肽，并通過體外一系列0Τ3肽與靶細(xì)胞、靶組織或來源于靶細(xì)胞的蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證0Τ3肽的結(jié)合特異性；同時(shí)，在用0Τ3序列替代抗體重鏈⑶R3區(qū)序列構(gòu)建的0Τ3移植抗體0)T3Ab)進(jìn)行的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。證明⑶R3S確實(shí)在TCR γ δ抗原識(shí)別特異性上起關(guān)鍵作用。通過親和層析的方法利用0Τ3肽作為探針在人卵巢癌SK0V3細(xì)胞總蛋白中尋找到與之結(jié)合的分子hMSH2配體(TCRy δ所識(shí)別的新型配體)。通過RT-PCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化等方法證實(shí)hMSH2 在腫瘤細(xì)胞及組織中表達(dá)；而且，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)hMSH2蛋白能特異性與V δ 2Τ細(xì)胞結(jié)合，并刺激其活化增殖，分泌Y干擾素，促進(jìn)VS 2Τ細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。上述結(jié)果是來自Y 9 δ 2Τ細(xì)胞對(duì)腫瘤識(shí)別的研究。而另一類上皮來源的V δ IT細(xì)胞與腫瘤的識(shí)別特性、CDR3區(qū)序列特征、識(shí)別的腫瘤抗原以及識(shí)別腫瘤抗原的分子機(jī)制還未見報(bào)道。V δ 1與V δ 2Τ細(xì)胞在序列和結(jié)構(gòu)、分布、識(shí)別抗原配體、功能等方都有很大區(qū)別， 因此，γ δ 2TCR結(jié)構(gòu)⑶R3序列不能代表其它類型TCR的其它⑶R3序列與腫瘤的識(shí)別機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一個(gè)人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞 (tumor-infiltrating γ δ T cell, γ δ TIL)中 δ 1 鏈互補(bǔ)決定域 3 (CDR3 δ 1)的優(yōu)勢(shì)序歹Ij GTM0本發(fā)明所提供的人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域 3的優(yōu)勢(shì)序列，命名為GTM，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO :1由15個(gè)氨基酸殘基組成。含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性、δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體來講，含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 鏈，命名為TRD1G，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)將序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO 2由286個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第111-125位氨基酸殘基為GTM序列。與上述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δΤ淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域 3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的、4鏈，命名為TRG4G，是下述氨基
酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 3 ；2)將序列表中SEQ ID NO 3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO 3由3Μ個(gè)氨基酸殘基組成。一種胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(γ δ TIL)的TCR，其δ 1鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID Ν0:2所示(TRDlG)，其γ 4鏈的氨基酸殘基序列如序列表中 SEQ ID NO 3 所示(TRG4G)。編碼上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的基因(GTM)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 4限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1(% SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 4由45個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第1_45位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3 的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體來講，編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG的基因(TRDlG)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 5限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. IXSSPE(或0. IXSSC)、0. SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 5由858個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第1_858位堿基，自5，端第331-375位堿基為GTM編碼序列，編碼具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3 的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的Y 4鏈TRG4G的基因(TRG4G)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. IXSSPE(或0. IXSSC)、0. SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 6由972個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-972位堿
基，編碼具有序列表中SEQ ID NO :3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR的基因，其 S 1鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示(TRDlG)，其Y 4鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示(TRG4G)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為轉(zhuǎn)基因J. RT3-T3. 5細(xì)胞，這是一種人Jurkat白血病細(xì)胞系CN 102532269 A的衍生體，它不能產(chǎn)生有功能的TCR受體，但可用于轉(zhuǎn)染其它外源的TCR以研究其抗原特異性；可按照常規(guī)方法將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)細(xì)胞的 TCR的基因轉(zhuǎn)染J. RT3-T3. 5細(xì)胞，如通過含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR基因的重組真核表達(dá)載體將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性 Y δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR基因?qū)隞. RT3-T3. 5細(xì)胞。用于構(gòu)建含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性、δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的 TCR基因的重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pRSV-rev、pLentilox 3. 7、pMDLg、pRRE、 PffPXL或pLVX-DsRed等慢病毒表達(dá)載體，優(yōu)選為pWPXL ；以pWPXL為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y S T淋巴細(xì)胞(γ δ TIL)的TCR的δ 1鏈編碼基因(TRDlG) 的重組真核表達(dá)載體為pWPXL-δ 1，構(gòu)建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性^5 1~淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR的Y 4鏈編碼基因(TRG4G)的重組真核表達(dá)載體為pWPXL-γ 4。所述攜帶有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性、δ T淋巴細(xì)胞(、δ TIL)的TCR 基因的重組真核表達(dá)載體可通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等常規(guī)的生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化J. RT3-T3. 5細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR 基因的J. RT3-T3. 5細(xì)胞為TCR δ 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性、δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM，含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞(γ δ TIL)中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白，δ 1鏈為TRD1G、γ 4鏈為TRG4G的胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性、S T淋巴細(xì)胞(γ δ TIL)的TCR以及編碼所述多肽、蛋白的基因可用于制備殺滅腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑，因而本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)一種抗腫瘤藥物提供了依據(jù)。本發(fā)明所指的抗腫瘤藥物，它的活性成分為上述具有抗腫瘤作用的人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y S T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM，或含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的 S 1鏈蛋白，或δ 1鏈為TRD1G、γ 4鏈為TRG4G的胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR或編碼所述多肽、蛋白的基因。編碼所述多肽、蛋白的基因可存在于J. RT3-T3. 5細(xì)胞中，其中轉(zhuǎn)染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(Y δ TIL)的TCR的基因的J. RT3-T3. 5細(xì)胞為 TCR γ 4 δ 1。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑和吸附載體等。本發(fā)明的藥物可以制成注射液或凍干粉劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物和基因藥物的常規(guī)劑量，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。一般情況下，本發(fā)明的TCR γ 4 δ 1細(xì)胞在注射劑量為 1. OX 105-2. OX IO5個(gè)/kg體重時(shí)，能夠延緩腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明提供了人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM、含有該序列的TCR以及TCR受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，GTM肽可以與腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織以及V δ IT細(xì)胞配體MICA蛋白特異性結(jié)合。通過Lentivirus表達(dá)系統(tǒng)建立了在J.RT3-T3.5表面表達(dá)含有人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞中δ 鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR的J. RT3-T3. 5細(xì)胞平臺(tái)，在細(xì)胞水平上模擬了 Y δ ITIL 及其識(shí)別殺傷腫瘤的機(jī)制(其中一條途徑為TCR識(shí)別腫瘤抗原，進(jìn)而釋放細(xì)胞因子TNF α 來殺傷腫瘤細(xì)胞)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCR γ 4 δ 1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯增高，且這種殺傷作用是TCR依賴性的。本發(fā)明將在惡性腫瘤治療藥物的開發(fā)及其過繼治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為4例胃癌來源TIL中γ δ TIL的比例圖2為一例胃癌來源Y δ TIL(W2-y δ TIL)中δ鏈的亞型分析圖3為PCR擴(kuò)增W2- γ δ TIL的δ的V區(qū)全長(zhǎng)序列的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為W2- γ δ TIL(A)和S2- γ δ TIL(B)對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)W2- γ δ TIL的表型圖6為GTM肽與不同腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織及配體蛋白MICA的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7為PCR擴(kuò)增的δ 1鏈全長(zhǎng)基因和γ 4鏈全長(zhǎng)基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖8為TCR γ 4 δ 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面、δ TCR表達(dá)情況的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(pWPXL 轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照)圖9為TCR γ 4 δ 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)Daudi細(xì)胞的殺傷作用圖10為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TCRY4 δ 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞(pWPXL轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照)分別與 anti-y δ TCR(A)和MICA蛋白(B)孵育后TNF α的表達(dá)情況
具體實(shí)施例方式本發(fā)明優(yōu)化了體外擴(kuò)增培養(yǎng)腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T細(xì)胞(γ δ TIL)的條件，成功從4 例胃癌來源的腫瘤組織中培養(yǎng)出νδ 表型的γ δ TIL。體外對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷活性。本發(fā)明對(duì)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的腫瘤Y δ ITIL的⑶R3 δ 1序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每例Y δ ITIL的⑶R3 δ 1序列具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)特征；其中4例胃癌來源γ δ ITIL中3例的 CDR3區(qū)優(yōu)勢(shì)序列相同且共有優(yōu)勢(shì)序列較其它序列短。選取3例胃癌來源γ δ TIL共有的 ⑶R3 δ 1區(qū)優(yōu)勢(shì)序列GTM作為后續(xù)結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。人工合成GTM肽，利用流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、ELISA、Sra、免疫組化方法在Y S IT-⑶R3肽水平證明GTM肽能與腫瘤細(xì)胞或組織區(qū)特異性結(jié)合。親和層析方法證實(shí)在腫瘤細(xì)胞總蛋白中缺失存在與GTM肽特異性結(jié)合的蛋白，即腫瘤抗原配體。成功從一例胃癌來源的Y STIL中擴(kuò)增出完整的Y4鏈和δ 鏈全長(zhǎng)，并通過 Lentivirus表達(dá)系統(tǒng)建立了在J. RT3-T3. 5細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)完整TCR γ 4 δ 1的平臺(tái)，以期在細(xì)胞水平上模擬Y S ITIL進(jìn)而研究其識(shí)別腫瘤的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠殺傷腫瘤細(xì)胞且這種殺傷作用是TCR依賴性的，給功能基因組和未來基因治療應(yīng)用帶來了廣闊的可能性。
實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating Y δ T cell, γ δ TIL)中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3(⑶R3 δ 1)的優(yōu)勢(shì)序列GTM的獲得一、上皮來源腫瘤中Y δ TIL細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定1、Y δ TIL細(xì)胞的培養(yǎng)用anti-pan-TCR γ δ mAb (購(gòu)自 Beckman Coulter)包被24孔板，5 μ g/孔，37°C孵育池。將無菌手術(shù)采集的胃癌、腎癌等實(shí)體瘤標(biāo)本(上皮來源)在RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素200 μ g/mL、鏈霉素100 μ g/mL、慶大霉素100 μ g/mL)中浸洗2次，IOmin/次；去除壞死組織、周圍血管及正常組織；將洗好的組織剪碎，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素200 μ g/ mL、鏈霉素100 μ g/mL)洗2次，IOmin/次，然后重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。將重懸的組織碎塊上板，添加IL-2(白細(xì)胞介素_2，購(gòu)自北京瑞得合通藥業(yè)有限公司，200U/mL)； 37°C,5% CO2培養(yǎng)兩周，每3天換液一次。2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)TIL細(xì)胞的TCR表型收集細(xì)胞，IOOOrpm離心5min，調(diào)每管細(xì)胞數(shù)至1 X IO6個(gè)。加ImL PBS洗液輕輕吹打，重懸細(xì)胞，IOOOrpm 離心 5min，洗 2 次。加抗體(FITC-anti-TCR γ δ/PE-anti-TCR α β 或者 FITC-anti-V δ UPE-anti-V δ 1、FITC-anti-V δ 3，購(gòu)自 Beckman Coulter 或 Pierce) 及同型對(duì)照(FITC-mouse IgG/PE-mouse IgG，購(gòu)自 Beckman Coulter 或 Pierce)，不加抗體管作陰性對(duì)照，4°C避光孵育30min。加ImL PBS洗液洗滌細(xì)胞，3000rpm離心5min，洗3次。 每管細(xì)胞加入4 V預(yù)冷的PBS固定液0. 5mL,輕輕吹打，懸起細(xì)胞，400目濾網(wǎng)過濾，4 V避光保存待測(cè)。部分檢測(cè)結(jié)果如圖1(橫坐標(biāo)表示TCR γ δ，縱坐標(biāo)表示TCR α β ；W2表示一例胃癌組織來源、3 111^(命名為12)，13表示一例胃癌組織來源、5 111^(命名為13)，14表示一例胃癌組織來源Y 3 111^(命名為14)，15表示一例胃癌組織來源γ 5 111^(命名為15)和圖2 (橫坐標(biāo)表示V δ 1或V δ 2或V δ 3，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù))所示，共成功培養(yǎng)多例不同腫瘤組織來源的Y S TIL，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上皮來源腫瘤中γ δ TIL細(xì)胞多數(shù)為δ 1型。符合文獻(xiàn)(Bennett WTHH,HHPandolfi FHH,HHGrove BHHH,HHHawes GEHH,HHBoyle LAHH,HHKradin RLHH, HHKurnick JTHH. Dominant rearrangements among human tumor infiltrating lymphocytes. Analysis of T cells derived from 32 patients with melanoma, lung, and renal cell carcinoma. HHCancer. HH 1992 May 1 ；69 (9) :2379-84.)報(bào)導(dǎo)的上皮來源的Y δ TIL細(xì)胞主要為V δ 1型，而外周血來源的γ δ TIL細(xì)胞主要為V δ 2型。二、γ δ ITIL CDR3 δ 1 區(qū)序列分析1、細(xì)胞總RNA的提取收集培養(yǎng)的不同來源(來源于胃癌、腎癌等實(shí)體瘤組織)的Y δ TIL細(xì)胞，PBS洗一次；按每5X IO6ceIlsAiL的比例加入Trizol試劑，反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，室溫孵育 5min ；移入經(jīng)DEPC處理的EP管中，加入1/5體積的氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫靜置^iin ； 4°C、10，OOOrpm離心15min，小心吸取上層水相至一個(gè)新管中；加入1/2體積的異丙醇，冰浴IOmin ；4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入ImL 75%乙醇清洗沉淀，洗兩次。4°C、12，OOOrpm離心lOmin，吸棄上清，室溫干燥沉淀。用DEPC水溶解沉淀，立即用于逆轉(zhuǎn)錄或-80°C保存?zhèn)溆谩?、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈用購(gòu)自!Iomega的MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以步驟1提取的細(xì)胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA第一鏈，方法為取RNA樣品2 μ g和Oligo (dT) 15(500 μ g/ml) 1 μ 1，補(bǔ)加DEPC 水至13μ 1，70°C IOmin ；取出后馬上置于冰浴中，依次加入5 XBuffer5 μ 1、dNTP (lOmmol/ L)5y 1、RNA酶抑制劑1μ 1、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，補(bǔ)加DEPC水至25 μ 1，42°C，60min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；70°C 15min滅活酶活性。3、PCR 擴(kuò)增 TCR δ 基因本步驟所使用的引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物濃度均為lOpmol/μ 1， 使用內(nèi)參引物P-UP、P-DN以及γ STIL δ鏈V區(qū)(簡(jiǎn)稱νδ)全長(zhǎng)測(cè)序引物V δ 1、V δ 2、 νδ3、εδ。其中νδ為5'端特異性引物，與3'端引物CS配對(duì)使用，可擴(kuò)增出⑶R3基因片段，引物序列如表1所示表1引物序列
權(quán)利要求
1.人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性YS T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)將序列表中SEQID NO 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。
2.含有權(quán)利要求1所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性YδΤ淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TCR受體的δ1鏈蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)將序列表中SEQID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。
4.與權(quán)利要求3所述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδ T淋巴細(xì)胞中δ 鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈相匹配的γ 4鏈，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 3 ；2)將序列表中SEQID NO 3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識(shí)別作用的蛋白質(zhì)。
5.一種胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞(γ δ TIL)的TCR，其δ 1鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，其Y 4鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
6.編碼權(quán)利要求1所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Yδ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 1的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :4限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID NO :4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.編碼權(quán)利要求2所述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因。
8.編碼權(quán)利要求3所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδΤ淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 2的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :5限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID NO :5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
9.編碼權(quán)利要求4所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的、4鏈的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 3的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識(shí)別作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID NO :6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
10.編碼權(quán)利要求5所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδ T淋巴細(xì)胞的TCR的基因，其 Sl鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Ν0:5所示，其鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。
11.含有權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為轉(zhuǎn)基因 J.RT3-T3. 5細(xì)胞；可按照常規(guī)方法將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞的 TCR基因轉(zhuǎn)染J.RT3-T3. 5細(xì)胞，如通過含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞的TCR基因的重組真核表達(dá)載體將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞的TCR基因?qū)隞. RT3-T3. 5細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于用于構(gòu)建含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y ST淋巴細(xì)胞的TCR基因的重組真核表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pRSV-rev, pLentilox 3. 7、pMDLg、pRRE、pffPXL 或 pLVX-DsRed 等慢病毒表達(dá)載體，優(yōu)選為 pWPXL;以pWPXL為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γ δ T淋巴細(xì)胞的 TCR的δ 1鏈編碼基因的重組真核表達(dá)載體為pWPXL-δ 1，構(gòu)建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞的TCR的γ 4鏈編碼基因的重組真核表達(dá)載體為pWPXL- γ 4。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于所述轉(zhuǎn)染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞的TCR基因的J. RT3-T3. 5細(xì)胞為TCR γ 4 δ 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1所述的人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Yδ T淋巴細(xì)胞中δ 1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列，權(quán)利要求2或3所述的含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y δ T淋巴細(xì)胞中Sl鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白，或者權(quán)利要求5所述的胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性Y S T淋巴細(xì)胞的TCR在制備殺滅腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑中的應(yīng)用，所述腫瘤細(xì)胞與人B淋巴瘤細(xì)胞Daudi相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明公開了人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδT淋巴細(xì)胞中δ1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM、含有該序列的TCR以及TCR受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。GTM氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO1所示。實(shí)驗(yàn)證明，GTM肽可以與腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織以及Vδ1T細(xì)胞配體MICA蛋白特異性結(jié)合。通過Lentivirus表達(dá)系統(tǒng)建立了在J.RT3-T3.5表面表達(dá)含有人胃癌組織來源腫瘤浸潤(rùn)性γδT淋巴細(xì)胞中δ1鏈互補(bǔ)決定域3的優(yōu)勢(shì)序列GTM的TCR的J.RT3-T3.5細(xì)胞平臺(tái)，在細(xì)胞水平上模擬了γδ1TIL及其識(shí)別殺傷腫瘤的機(jī)制，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCRγ4δ1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯增高，且這種殺傷作用是TCR依賴性的。本發(fā)明將在惡性腫瘤治療藥物的開發(fā)及其過繼治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102532269SQ201110126369
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者何維, 姜燕, 崔蓮仙 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所