專利名稱：一種構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建中醫(yī)模型的方法及用途，具體涉及一種構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病模型的方法及用途。
背景技術(shù)：
目前艾滋病的治療主要是應(yīng)用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HARRT)治療、免疫治療、 生物治療、疫苗、中醫(yī)藥治療等。其中，中醫(yī)臨床治療具有辨證論治的特點，可根據(jù)患者的自身體質(zhì)特征和癥狀表現(xiàn)采用個體化治療，且中藥通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，延長患者帶毒生存時間，毒副作用少，依從性好。中醫(yī)藥特別是在感染HIV病毒后的無癥狀期發(fā)揮積極的治療作用。近幾年中醫(yī)藥防治艾滋病的實驗取得了可喜的成績，通過體外抑制HIV病毒細(xì)胞培養(yǎng)、藥物篩選和動物實驗發(fā)現(xiàn)了多種具有抑制艾滋病病毒作用的中藥，臨床試驗研究也證實了中藥在穩(wěn)定和提高免疫功能、消除和緩解癥狀、改善生活質(zhì)量方面具有較好的效果。 中醫(yī)藥通過多環(huán)節(jié)、多靶點的調(diào)節(jié)，從多個途徑介入，通過影響病毒——宿主網(wǎng)絡(luò)，改變疾病的病理狀態(tài)或推遲疾病的進程，在臨床治療中更強調(diào)對患者生活質(zhì)量和生存期的改善， 與西醫(yī)藥著重于抑制病毒有著較大的區(qū)別，因此，作為病因病機基礎(chǔ)研究和評價標(biāo)準(zhǔn)的動物模型應(yīng)該有別于西醫(yī)藥研究所采納的動物模型。然而，目前尚未建立適合中醫(yī)藥篩選抗艾滋病的動物模型，給中醫(yī)藥的篩選工作帶來了困難。艾滋病中醫(yī)動物模型應(yīng)能夠和艾滋病的病因、病理變化相似；滿足中醫(yī)臨床的癥狀模擬，評價指標(biāo)特異性強、客觀；模型應(yīng)能夠被藥物反證。概括而言，應(yīng)符合中醫(yī)動物模型的基本要求。另外，該模型應(yīng)該價操作簡單、操作步驟和環(huán)節(jié)精煉，實驗結(jié)果的重復(fù)性好。中醫(yī)藥艾滋病動物模型必須始終以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，體現(xiàn)中醫(yī)特色。中醫(yī)的證候是中醫(yī)藥理論和臨床的基礎(chǔ)，因此，動物模型應(yīng)該符合中醫(yī)的證和病機變化。目前，中醫(yī)艾滋病證候的研究已進行了多年，形成了多種學(xué)說，基本認(rèn)為艾滋病的證候以復(fù)合證、虛實夾雜為特點，具有復(fù)雜的病機，體現(xiàn)了多樣性的特點。我們長期的臨床和實驗研究認(rèn)為，AIDS病因病機為HIV侵入人體，首先損傷脾臟，致脾氣虧虛，進而損及其他四臟，終至五臟氣血陰陽俱虛，并伴有氣滯血瘀，或痰飲水濕，或風(fēng)寒火熱等邪毒為其基本病機的疾病。艾滋病復(fù)雜的臨床癥狀表現(xiàn)，說明除了 HIV病毒之外，其他的因素也參與了證候的形成。利用當(dāng)前成熟的技術(shù)，在動物身上復(fù)制能夠和臨床證候更為相似的動物模型，能夠更好地模擬臨床表現(xiàn)，提供與臨床“證”相似的模型，豐富艾滋病的中醫(yī)動物模型庫， 切中中醫(yī)動物模型中“辨證”的要求。由于臨床上艾滋病的發(fā)生、發(fā)展過程中，癥狀、證型存在隨時空變化而改變的性質(zhì)，提示某種因素復(fù)制的艾滋病動物模型在不同的時期，其所表現(xiàn)的證可能是不同的，這種證的變化盡量擬合臨床證的變化。除了客觀的癥狀指標(biāo)外， 應(yīng)選擇科學(xué)、準(zhǔn)確、量化的指標(biāo)衡量證候，并應(yīng)注意這些指標(biāo)應(yīng)該有較強的特異性。如艾滋病動物脾虛模型，就應(yīng)該選小腸木糖吸收試驗等指標(biāo)。藥物反證(以下簡稱反證)，又稱以藥測證也是衡量模型是否成功的有效手段。當(dāng)建立穩(wěn)定的動物模型后，再用該模型相對應(yīng)的基本方藥進行觀察治療，如果治療能改善或消除模型的癥狀和檢測指標(biāo)，則佐證了此模型成立，反之亦然。綜上所述，中醫(yī)艾滋病動物模型應(yīng)在滿足模擬艾滋病病因、病理的基礎(chǔ)上，應(yīng)能體現(xiàn)中醫(yī)證的特色，滿足中醫(yī)學(xué)的發(fā)病學(xué)原理，模型的癥狀、客觀指標(biāo)和藥物反證比較一致，與中醫(yī)理論較為吻合。該模型的建立將有利于揭示艾滋病“證”的實質(zhì)，驗證并探討中醫(yī)中藥的療效和機理，促進中醫(yī)藥防治艾滋病的理論研究。猴艾滋病病毒SIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科病毒，SIV病毒株于1985年首先從恒河猴中成功地分離。SIV引起的癥狀和人AIDS明顯相似，第一階段為感染后第1 3周，其間會出現(xiàn)一個病毒復(fù)制的高峰，常表現(xiàn)在血漿中的P27核心蛋白大量增值，有明顯的病毒血癥，表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、腹瀉和外周淺表淋巴結(jié)腫大等，類似于人感染的臨床癥狀。第二階段為持續(xù)無臨床癥狀期。該期時間長短不一，短的僅為2個月，長的可達(dá)幾年。 其表現(xiàn)為P27核心蛋白水平下降而相應(yīng)的抗體出現(xiàn)。第三階段為AIDS期，猴外周血中⑶4 細(xì)胞逐漸下降，血漿病毒水平回升，并伴有體重下降、全身衰竭和機會感染(主要表現(xiàn)為頑固的腹瀉和肺炎)。約有20% 30%的感染猴因缺乏有效的免疫應(yīng)答而死亡。。SIV和 HIV同屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科病毒，SIV與⑶4受體和輔助受體CCR5，CXCR4密切相關(guān)，并可使猴子致病，還可以通過母猴喂養(yǎng)小猴傳播。SIV猴模型作為AIDS模型，得到了越來越多人認(rèn)可。國內(nèi)外艾滋病實驗大多數(shù)都是應(yīng)用SIV猴模型，作為AIDS發(fā)病機理、藥物治療、疫苗研制的技術(shù)平臺。本發(fā)明人克服了諸多技術(shù)問題，成功構(gòu)建了一種艾滋病靈長類中醫(yī)脾虛證動物模型。在所述動物中復(fù)制的重復(fù)性、穩(wěn)定性好；能體現(xiàn)中醫(yī)證的特色，模型的癥狀、客觀指標(biāo)和藥物反證比較一致，與中醫(yī)理論較為吻合。該模型的建立將有利于揭示艾滋病“證”的實質(zhì)，驗證并探討中醫(yī)中藥的療效和機理，促進中醫(yī)藥防治艾滋病的理論研究為中醫(yī)藥治療艾滋病療效評價和藥物篩選提供了比較理想的動物模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是構(gòu)建一種中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型。這種中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型，是由同一造模動物中醫(yī)脾虛癥候模型和SIV感染模型疊加構(gòu)建而成。具由中醫(yī)脾虛癥候和SIV感染艾滋病癥候雙重特點。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明通過兩種方案構(gòu)建了中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型。第一種是用生大黃濃縮液灌胃先造成中醫(yī)脾虛癥猴模型，然后靜脈注射感染SIV 病毒，感染14天后檢測并最終確認(rèn)病毒感染，達(dá)到構(gòu)建復(fù)合模型。中醫(yī)脾虛癥候模型根據(jù)實驗要求和恒河猴自身身體狀況，連續(xù)使用生大黃濃縮液灌胃對恒河猴進行為期4周左右的造模可達(dá)實驗設(shè)計要求。第二種是恒河猴經(jīng)靜脈注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黃濃縮液灌胃造脾虛證。SIV感染模型采用SIVmac239病毒株進行靜脈感染方式，感染14天后抽血檢測確認(rèn)感染情況，然后用生大黃濃縮液灌胃進行中醫(yī)脾虛癥候模型構(gòu)建，最終構(gòu)建復(fù)合模型。恒河猴造模成脾虛后出現(xiàn)明顯的腹瀉、攝食量減少、進食速度減慢、厭食等典型中醫(yī)脾虛情況；隨著造模時間的延長癥狀逐漸加重。但如果不加用大黃維持復(fù)合模型，則癥狀會逐漸緩解。恒河猴感染艾滋病病毒后，表現(xiàn)和艾滋病人極為相似，猴感染SIV后病情發(fā)展有三個階段急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期，產(chǎn)生抗艾滋病病毒抗體IgM和IgG 體液分離病毒陽性，檢測病毒陽性。中醫(yī)脾虛SIV復(fù)合模型病毒構(gòu)建前后血漿病毒載量與正常狀況下SIV感染猴模型的血漿病毒載量相比較無明顯差別，但⑶4計數(shù)較正常狀況下SIV感染猴模型的更低。⑶4/ CD8比值倒置狀況也較正常狀況下SIV感染猴模型更加嚴(yán)重。整體來說，中醫(yī)脾虛SIV復(fù)合模型病情較自然感染的恒河猴病情嚴(yán)重。本發(fā)明的特點和突出優(yōu)勢在于
成功構(gòu)建了一種中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型。在最接近于人類的動物模型上既能體現(xiàn)中醫(yī)脾虛證候特點及演變規(guī)律，并可從中獲得穩(wěn)定的脾虛癥狀和脾虛證相關(guān)客觀指標(biāo)，又能體現(xiàn)最接近人類艾滋病的感染與發(fā)病過程和癥狀，并可從中獲得穩(wěn)定的病毒學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)相關(guān)客觀指標(biāo)。構(gòu)建的病、證結(jié)合的艾滋病猴模型具有重復(fù)性和穩(wěn)定性，有利于揭示艾滋病“證”的實質(zhì)，驗證并探討中醫(yī)中藥的療效和機理，促進中醫(yī)藥防治艾滋病的理論研究。以下通過實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過實施例了解本發(fā)明所說的一種中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的建立方法和用途。但是這些實施例不得理解為對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實施例1 第一種構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法和用途
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法，其特征在于選擇健康成年雄性恒河猴， 經(jīng)血清學(xué)檢測猴艾滋病病毒SIV，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)，猴B病毒和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性，無中醫(yī)脾虛、氣虛癥狀體征；采用的毒株為SIVmac239病毒株，經(jīng)健康猴PBMC體外擴增；用生大黃濃縮液灌胃造成脾虛證，生大黃濃縮液為將生大黃粉碎成的粗粉加沸水煎煮，制成ImL=Ig生藥的濃縮液，灌胃劑量是0.5 g/kg.d至3.0 g/kg. d ；灌胃時間是3至7周；采用靜脈注射方式進行病毒接種，接種量為1: (1000-5000)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法，其特征在于用放射免疫學(xué)方法檢測三碘甲狀腺原氨酸(T3)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)、促甲狀腺素(TSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)、皮質(zhì)醇(Cor)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥苷酸 (cGMP)、白介素2 (IL-2)、白介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)等指標(biāo)，用比色法測定 D-木糖；每1-2周收集標(biāo)本，接種CEMX174細(xì)胞，進行病毒分離；用RT-PCR方法測定體液和組織內(nèi)的SIV病毒載量；每1-2周收集標(biāo)本，接種CEMX17細(xì)胞，進行病毒分離；用RT-PCR方法測定體液和組織內(nèi)的SIV病毒載量；用流式細(xì)胞術(shù)測定模型動物的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)， 包括⑶4、⑶3、⑶8計數(shù)；用活檢方法取模型動物的淋巴結(jié)，福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，染色，進行病理形態(tài)及半定量分析；中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型指標(biāo)體系中的主要特異性指標(biāo)為三碘甲狀腺原氨酸(T3)、D-木糖、病毒載量、⑶4、⑶4 /tD8比值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法，用于脾虛造模后觀察中醫(yī)證候積分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法，用于研究艾滋病的中醫(yī)病因、病機和證候。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法，用于抗艾滋病中藥和復(fù)方的藥效評價。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建中醫(yī)脾虛證艾滋病猴模型的方法及用途。在現(xiàn)有艾滋病實驗動物中猴子最接近人類，發(fā)明人應(yīng)用兩種方法都成功地構(gòu)建了恒河猴艾滋病病毒感染中醫(yī)脾虛證復(fù)合模型。第一種方法是用生大黃濃縮液灌胃造脾虛證后經(jīng)靜脈注射感染猴艾滋病病毒。第二種方法是恒河猴經(jīng)靜脈注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黃濃縮液灌胃造脾虛證。通過了解艾滋病病毒在脾虛證模型體內(nèi)感染過程、發(fā)病過程、病理變化，以研究包括感染的靶器官、靶組織和靶細(xì)胞,對免疫系統(tǒng)的攻擊,免疫系統(tǒng)細(xì)胞的反應(yīng)，中醫(yī)證候的演變規(guī)律等。通過所建立的中醫(yī)脾虛證艾滋病病毒感染猴復(fù)合模型，對于研究艾滋病中醫(yī)發(fā)病機理、證候?qū)W演變，評價抗艾滋病中藥和復(fù)方的藥效有著不可替代作用。
文檔編號A61K49/00GK102228699SQ20111012039
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日
發(fā)明者何金洋, 劉抗倫, 劉政, 周紅燕, 張苗苗, 李志強, 李茂清, 符林春, 胡英杰, 胡董仁, 董伯振, 陳津巖, 陳芝喜 申請人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)