專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域綴合物的結(jié)構(gòu)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的胞外區(qū)主要負(fù)責(zé)與配基的識(shí)別與結(jié)合，它們的胞外區(qū)通常含有1至6個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)。這些受體通常以三聚體結(jié)合配體，發(fā)揮受體功能。而上述功能則是由含有至少1個(gè)富含半胱氨酸的前配體裝配域所介導(dǎo)。TNFR超家族成員，包括TRAIL受體1、CD40、TNFR1和TNFR2都具備這種締合功能。i^as、 LT3 R、HVEM、RANK、CD40、CD30、CD27、0X40和DR4等其它TNFR超家族成員均含有此前配體裝配域。研究發(fā)現(xiàn)，在缺少配基的情況下，PLAD對(duì)受體聚合體的形成是必須且充分的。雖然PLAD不直接參與對(duì)TNF α和TNF β的識(shí)別與結(jié)合，但刪除PLAD或PLAD發(fā)生突變，配體與受體的親和能力會(huì)喪失。因此，PLAD對(duì)于TNFR多聚體的形成以及配基結(jié)合相關(guān)，在TNF 相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)中起著至關(guān)重要的作用。TNFR超家族成員是通過(guò)預(yù)先形成的聚合體而不是通過(guò)配體誘導(dǎo)的單個(gè)受體亞基的交聯(lián)來(lái)傳遞信號(hào)的，因此PLAD可以被靶向封閉以阻斷這些聚合體的形成并因此阻斷受體功能。PLAD的發(fā)現(xiàn)以及其介導(dǎo)的配基非依賴(lài)型受體組成功能的闡明為相關(guān)疾病的治療提供了新思路和新靶點(diǎn)。目前上市的以TNFa或者TNFR為靶點(diǎn)的治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物藥物有 Infliximab ( Remicade ,英夫利昔)、Adalimumab ( Humira ,阿達(dá)木單抗)和 Kanerc印t(Enbrel ，依那西普)等。其中英夫利昔和阿達(dá)木單抗是TNF α的單抗，而依那西普是可溶性TNFR和Fc片段的融合蛋白。TNFa單抗和TNFR融合蛋白都可以結(jié)合過(guò)量的可溶性TNF α，從而抑制TNF α弓丨發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。但是由于這種以TNF α為靶點(diǎn)的治療方法不能區(qū)分多種TNFR通路，比如不能區(qū)分TNF α和TNFRl和TNFR2的結(jié)合，所以在抑制 TNFRl引起的疾病時(shí)也會(huì)抑制TNFR2介導(dǎo)的生理作用，從而可能引起多種副作用，如狼瘡樣綜合癥(lupus-like disease)、分枝桿菌感染以及淋巴瘤發(fā)生率的增加。如果以PLAD為靶點(diǎn)，使用PLAD或其功能性突變體等封閉TNFR的PLAD區(qū)，可以特異性地抑制某種TNFR的聚合，從而終止TNFR-TNF復(fù)合物的形成，達(dá)到終止信號(hào)傳導(dǎo)的目的。由于每種受體只和自身的PLAD區(qū)結(jié)合，因此這種結(jié)合具有特異性。比如使用TNFRl的 PLAD干擾TNFRl的功能的同時(shí)，可以避免對(duì)TNFR2生理功能的影響，從而避免副作用的產(chǎn)生。聚乙二醇(PEG)是一類(lèi)無(wú)免疫原性、無(wú)毒、水溶性好的聚合大分子，聚乙二醇修飾技術(shù)是現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于改善蛋白質(zhì)生物有效性和理化性質(zhì)的方法。修飾了聚乙二醇的蛋白質(zhì)分子由于可以降低其被蛋白酶的降解程度、減少腎小球?yàn)V過(guò)率、增大蛋白的水溶性和降低蛋白質(zhì)分子的免疫原性，因此可以被賦予更好的生物和理化特性，擴(kuò)大蛋白質(zhì)和
3多肽的應(yīng)用范圍。其中，由于PEG分子長(zhǎng)鏈的柔性以及其較大的分子量，PEG修飾后的蛋白質(zhì)在體內(nèi)的體內(nèi)半衰期可以得到有效延長(zhǎng)，延緩其體內(nèi)的清除時(shí)間，并且可以有效改善蛋白質(zhì)的生物分布。目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物進(jìn)入生物醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，如PEG修飾的腺苷脫氨酶(PEG-ADA)、天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)、干擾素 α -2b (peginterferon alfa-2b)α -2a(peginterferon alfa-2a) ,M^iAUMM
集落刺激因子(pegfilgrastim)等。PEG修飾是通過(guò)蛋白質(zhì)分子和活化PEG修飾劑之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而完成的。氨基酸鏈上有多種可以和PEG部分連接的基團(tuán)，如-NH2, -NH-, -C00H, -OH, -SH及二硫鍵等。其中氨基修飾是目前應(yīng)用最為廣泛的PEG修飾手段，包括賴(lài)氨酸的ε -NH2和蛋白質(zhì)N末端的α-NH2是蛋白質(zhì)和多肽中數(shù)量最多的親核基團(tuán)，而且常常暴露在分子的表面，因此易于和PEG修飾試劑反應(yīng)。目前，用于氨基修飾的聚乙二醇修飾劑主要有以下幾種PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(PEG-SS)、PEG-琥珀酰亞胺碳酸酯(PEG-SC)、PEG-三氟乙基磺酸酯(PEG tresylate)和PEG-醛(PEG aldehyde)等，其PEG多聚鏈的結(jié)構(gòu)形式也包括直鏈和分支狀。 但是，若蛋白質(zhì)或者多肽的氨基修飾包括賴(lài)氨酸的末端的Ci-NH2，酸酯類(lèi)活化基團(tuán)的修飾常會(huì)得到多種不同修飾位點(diǎn)和修飾程度的反應(yīng)產(chǎn)物。而蛋白質(zhì)與PEG-醛的還原烷化反應(yīng)則可以克服這一不足，由于蛋白質(zhì)N末端α-NH2 WpKa值低于賴(lài)氨酸的ε-NH2 的PKa值，因此在弱酸性環(huán)境中，PEG-醛更易與末端氨基酸殘基的α -NH2發(fā)生還原烷化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)N-末端氨基的定點(diǎn)修飾。另外，通過(guò)基因工程技術(shù)引入非天然氨基酸，如對(duì)乙酰苯丙氨酸或者對(duì)疊氮苯丙氨酸，再針對(duì)非天然氨基酸上的特殊基團(tuán)，采用具有相應(yīng)的活化基團(tuán)的聚乙二醇衍生物對(duì)其進(jìn)行偶聯(lián)也是目前較為常用的定點(diǎn)修飾的策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)路線(xiàn)和步驟一、技術(shù)路線(xiàn)1.化學(xué)合成腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物；或者根據(jù)相應(yīng)宿主密碼子偏愛(ài)性合成腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白的基因。2.基因重組入表達(dá)載體，克隆入宿主菌后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。3.分離純化得到目的蛋白。4.腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白與聚乙二醇分子的偶聯(lián)。5.從偶聯(lián)反應(yīng)混合物中分離純化得到腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物。6.腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物的鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白，是來(lái)自于腫瘤壞死因子受體1胞外區(qū)的PLAD結(jié)構(gòu)域及其功能性變體，突變體至少大約90%的氨基酸序列與天然人源的腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白具有同一性。本發(fā)明所涉及的腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白的獲得可以通過(guò)化學(xué)合成或者蛋白質(zhì)重組技術(shù)表達(dá)得到。本發(fā)明所采用的蛋白質(zhì)重組表達(dá)系統(tǒng)可以是原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或者真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)選原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)和可溶性蛋白質(zhì)標(biāo)簽融合表達(dá)以及蛋白酶如腸激酶酶切去除融合標(biāo)簽，大量獲得腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白。含有非天然氨基酸如對(duì)疊氮苯丙氨酸或?qū)σ阴１奖彼岬哪[瘤壞死因子受體1 前配體裝配域蛋白的獲得可以遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)定點(diǎn)弓I入非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)。上述聚乙二醇可以為直鏈結(jié)構(gòu)或者支鏈結(jié)構(gòu)。分子量范圍為2000-40000Da。本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物的制備方法是使用緩沖液，調(diào)節(jié)PLAD蛋白溶液pH值至3. 0到9. 0，然后按比例加入具有活化基團(tuán)的聚合物如 mPEG-醛以及催化劑(如氰基硼氰化鈉)，靜置或攪拌反應(yīng)一定的時(shí)間，將反應(yīng)混合液稀釋或調(diào)節(jié)PH值使反應(yīng)停止，采用離子交換或者凝膠過(guò)濾色譜純化PEG-PLAD分子。上述的緩沖液可以是醋酸-醋酸鈉緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸-碳酸鈉緩沖液，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鈉緩沖液等。 蛋白質(zhì)與聚乙二醇的摩爾比為1 1到1 10之間，反應(yīng)溫度為0-37攝氏度，反應(yīng)時(shí)間為 15分鐘以上。本發(fā)明的目的在于獲得一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物，與 PLAD原型分子相比，綴合物具有較好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，可以克服PLAD原型分子易被酶解和清除的不足，同時(shí)與PLAD原型分子一樣，具備拮抗TNF α等TNFR相關(guān)配基的活性，由于TNFa是引起人類(lèi)多種免疫性炎癥的重要因子，因此該綴合物有望應(yīng)用于治療如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等人類(lèi)的炎性疾病。


圖1顯示Trcine-SDS-PAGE分析純化后得到的TNFR1-PLAD蛋白純度圖中序號(hào)說(shuō)明1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.純化后得到的TNFR1-PLAD蛋白圖2顯示HPLC分析純化后得到TNFR1-PLAD蛋白純度圖3顯示SDS-PAGE分析mPEG_ALD20000修飾PLAD后得到的產(chǎn)物圖中序號(hào)說(shuō)明1. mPEG-ALD20000修飾PLAD的反應(yīng)液；2.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明。說(shuō)明書(shū)及實(shí)施例中的方法，如未有特殊說(shuō)明均按常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行操作，或按供應(yīng)商提供的說(shuō)明進(jìn)行操作。實(shí)施例1mPEG-醛與 PLAD (SEQ ID NO :1，Xaa = Leu)的 N 末端 α 氨基偶聯(lián)使用20mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液將PLAD配置成10mg/ml，pH5. 2的蛋白質(zhì)溶液， 往里加入使用20mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液配置的分子量為20000Da的甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD20000)，使得蛋白質(zhì)與PEG的摩爾比為1 1，加入終濃度為20mM的氰基硼氰化鈉還原催化反應(yīng)。于4攝氏度靜置反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，稀釋反應(yīng)液并調(diào)節(jié)pH值至中性停止反應(yīng)。反應(yīng)按以下反應(yīng)式進(jìn)行
權(quán)利要求
1.一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物，其特征是包括通過(guò)共價(jià)鍵連接的A和B兩部分。其中A是腫瘤壞死因子受體1胞外區(qū)的前配體裝配域(PLAD)及其功能性變體，包含序列 1(SEQ ID NO :1)、序列 2(SEQID NO :2)、序列 3 (SEQID NO 3)或序列 4 (SEQ ID NO :4)其中之一所示氨基酸序列； 序列1 Xaa Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys TyrIle His Pro Gln Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr AsnAsp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg 其中:Xaa 為L(zhǎng)eu、Cys> pAzF、pAcF ； 序列2 Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys TyrIle His Pro Gln Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr AsnAsp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Xaa 其中:Xaa 為Arg、Cys、pAzF、pAcF ； 序列3 Xaa Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly LysTyr lie His Pro Gln Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu TyrAsn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg 其中Xaa 為Cys、pAzF, pAcF 或缺失； 序列4 Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys TyrIle His Pro Gln Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr AsnAsp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Xaa 其中Xaa 為Cys、pAzF, pAcF 或缺失； 上述pAzF代表對(duì)疊氮苯丙氨酸，pAcF代表對(duì)乙酰苯丙氨酸。 B是可以提高A穩(wěn)定性的聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綴合物，其特征是B是聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯、聚丙烯、 聚乙烯醇、多聚唾液酸、棕櫚酸或月桂酸其中之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的綴合物，其特征是B為聚乙二醇，其分子量范圍為2000到 40000Dao
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的綴合物，其特征是通過(guò)mPEG-醛、mPEG-馬來(lái)酰亞胺、mPEG-鄰吡啶二硫醚、mPEG-乙烯基砜、mPEG-碘乙酰胺、mPEG-酰胼或mPEG-炔其中之一的末端活化基團(tuán)與A反應(yīng)形成共價(jià)鍵構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綴合物，其特征是用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等人類(lèi)炎性疾病。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物分子結(jié)構(gòu)及其制備方法和應(yīng)用。腫瘤壞死因子受體1前配體裝配域蛋白綴合物分子是腫瘤壞死因子受體1的前配體裝配域(PLAD)通過(guò)共價(jià)鍵與聚乙二醇(PEG)等分子連接組成。其中PLAD部分可以由蛋白質(zhì)重組表達(dá)技術(shù)制備獲得。本發(fā)明旨在獲得一種具有較長(zhǎng)血清半衰期的PLAD分子，用于人類(lèi)炎性疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102206267SQ201110095850
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者姚文兵, 孟芳, 曹進(jìn), 田浤, 高向東 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)