專利名稱：一種生長(zhǎng)因子緩釋微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種生長(zhǎng)因子單甲氧基聚乙二醇聚乳酸緩釋微球 及其制備方法。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)因子(growth factor, GF)是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的細(xì)胞外多肽信號(hào)分子。 通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽 類物質(zhì)。生長(zhǎng)因子存在于血小板和各種成體與胚胎組織及大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞中，對(duì)不同種類 細(xì)胞具有一定的專一性，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子等。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)，由效應(yīng)神經(jīng)元支配的靶組織細(xì) 胞合成和分泌，是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 因子。神經(jīng)生長(zhǎng)因子被神經(jīng)元軸突攝取后逆行運(yùn)輸至胞體，通過多種途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的 基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物效應(yīng)，維持神經(jīng)元的存活，刺激軸突的生長(zhǎng)，對(duì)外周神經(jīng)的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng) 起重要作用；還可以促進(jìn)受損神經(jīng)纖維修復(fù)，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增殖、分化， 傷口愈合等，對(duì)正常骨組織的神經(jīng)維持亦有重要作用。目前神經(jīng)生長(zhǎng)因子可用于腦、脊髓損 傷、脊髓移植、骨科四肢神經(jīng)損傷、坐骨神經(jīng)損傷、多發(fā)性神經(jīng)炎、椎間盤痛、神經(jīng)斷裂及退 行性病變。國(guó)外學(xué)者Eppley在應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子修復(fù)兔下頌神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)時(shí)，不僅證實(shí) 神經(jīng)生長(zhǎng)因子能促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，而且發(fā)現(xiàn)在再生軸突周圍有新生類骨質(zhì)形成。有研 究表明在骨折區(qū)局部應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子可促進(jìn)骨折愈合，骨痂生成量增多，骨痂剛度和抗 折彎強(qiáng)度顯著增加，表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)成骨過程中的礦化過程有直接影響。在治療周圍神經(jīng)損傷及骨折愈合過程中，很多學(xué)者探索了各種不同的給藥方式， 如直接肌肉注射或靜脈注射、通過肌肉周圍的血管進(jìn)行吸收、將神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射于損傷 神經(jīng)和骨折區(qū)域的局部或者將神經(jīng)生長(zhǎng)因子注入周圍神經(jīng)缺損橋接管內(nèi)，具有一定效果。 目前的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物金路捷，恩經(jīng)復(fù)，蘇肽生都是肌肉注射，成品含5 %甘露 醇和0. 人血蛋白作保護(hù)劑。但在實(shí)際應(yīng)用中，由于神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性半衰期較短，在水 溶液中易失活，且易受濕度、酸堿度等多種因素的影響，在神經(jīng)再生及骨折愈合的整個(gè)漫長(zhǎng) 過程中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子不能長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)發(fā)揮促再生作用，全身應(yīng)用被快速滅活，局部穿刺分 次給藥又無法保證每次釋藥部位的準(zhǔn)確性，因此限制了其臨床應(yīng)用。制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩 釋制劑是解決上述問題的有效途徑?，F(xiàn)階段，骨折和骨缺損的修復(fù)機(jī)制已經(jīng)初步探明，但適用于骨缺損修復(fù)的神經(jīng)生 長(zhǎng)因子局部用藥緩釋劑型尚未見報(bào)道。因此，提供一種能夠長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)發(fā)揮作用的生長(zhǎng)因 子緩釋微球及其制劑用于制備治療骨損傷的藥物具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)因子緩釋微球及其凝膠制劑和制備方法。本發(fā)明 采用單甲氧基聚乙二醇聚乳酸包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子后制成生長(zhǎng)因子緩釋微球，可以控制藥物以一定的速度釋放，延長(zhǎng)藥物的生理活性，提高藥物的穩(wěn)定性和靶向性；將聚氧乙烯聚氧丙 烯醚加入到生長(zhǎng)因子緩釋微球中制得的生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑具有粘附性能好的優(yōu)點(diǎn)，不 易在骨創(chuàng)傷組織脫落和揮發(fā)，有效發(fā)揮藥理活性。本發(fā)明提供了一種生長(zhǎng)因子緩釋微球，包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子、重均分子量為10-10. 5 萬的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸、助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和單甲氧基聚乙 二醇聚乳酸的質(zhì)量比為0.8-1. 2 2. 4-3. 6X104，所述生長(zhǎng)因子緩釋微球的平均粒徑為 52. 9-95. 5 μ m。高分子微球包裹技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域緩釋制劑中具有廣泛運(yùn)用，以高分子為載體的緩 釋微球不但可以控制藥物以一定的速度釋放，而且可以通過合適的釋藥途徑延長(zhǎng)藥物的生 理活性，提高藥物的穩(wěn)定性，而且具有一定的靶向性，從而使藥物的藥理活性達(dá)到較理想的 效果。本發(fā)明中采用的高分子包埋材料單甲氧基聚乙二醇聚乳酸，由不同分子量聚乙二醇 與聚乳酸按一定比例通過開環(huán)共聚得到，為無定型聚合物，共聚物具有更大的親水性，可用 于藥物緩釋載體和組織工程細(xì)胞培養(yǎng)支架，在醫(yī)藥界已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，具有組織相容 性好，對(duì)人體安全無害等特點(diǎn)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子通過采用單甲氧基聚乙二醇聚乳酸包封后制 成的緩釋微球具有長(zhǎng)時(shí)間緩釋特點(diǎn)。聚乙二醇(polyethyleneg lycol，PEG)是由環(huán)氧乙烷與水或乙二醇逐步加成聚合 而得到的一類分子量較低的水溶性聚醚。聚乙二醇同系物的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，無臭或味 微臭無毒，具有吸濕性，絕大多數(shù)都易溶于水，可溶于乙醇、丙酮、氯仿等多數(shù)有機(jī)溶劑，通 常情況下不活潑、不水解、耐熱，可用熱壓滅菌。在室溫條件下，分子量在100以下的聚乙二 醇通常為無色或幾乎無色的透明澄清粘稠液體，分子量在2000以上的為固體。聚乙二醇水 溶液呈微酸性或中性，其分子鏈上兩端的羥基都具有反應(yīng)活性，能發(fā)生所有脂肪族羥基所 能進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)。聚乙二醇目前應(yīng)用極為廣泛，它可應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、化工等綜合 領(lǐng)域，具有以下優(yōu)點(diǎn)首先聚乙二醇(PEG)是無毒和非免疫原性親水聚合物，具有良好的生 物相容性；其次，聚乙二醇是種兩親性物質(zhì)，既可以溶解于水，又可以溶解于絕大多數(shù)的有 機(jī)溶劑，聚乙二醇具有化學(xué)惰性，對(duì)絕大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)穩(wěn)定，但在其羥基活化后又易于跟含 有氨基的化合物進(jìn)行鍵合，把許多優(yōu)良性質(zhì)轉(zhuǎn)移到結(jié)合物中；除此以外，聚乙二醇具有一系 列連續(xù)的分子量(1000-500000)，其價(jià)格相對(duì)低廉，適宜規(guī)?；a(chǎn)。聚乳酸(PLA)對(duì)人體無毒無害，是經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用作醫(yī)用手術(shù)縫合線和注射用 微囊、微球、埋植劑等制劑的材料，具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物 完全降解，最終生成二氧化碳和水，不污染環(huán)境，是公認(rèn)的環(huán)境友好材料。單甲氧基聚乙二醇聚乳酸由不同分子量聚乙二醇與聚乳酸按一定比例通過開環(huán) 共聚得到，為無定型聚合物，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為40-55°C，粘度IV(dl/g)范圍0. 10-1.0。單 甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物比聚乳酸具有更大的親水性，可用于藥物緩釋載體和組織工 程細(xì)胞培養(yǎng)支架。 作為優(yōu)選，所述所述單甲氧基聚乙二醇聚乳酸中，聚乙二醇分子量為5000，聚乙二 醇和聚乳酸的聚合比例為1 80-120。作為優(yōu)選，助溶劑選自磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7. 1-7. 3。作為優(yōu)選，乳化劑選自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、丙酮、四氫呋喃、冰醋酸1苯1甲苯中的一種或兩者以上的混合物。[oo15] 優(yōu)選地，所述助溶劑包含體積比為2—4l的二氯甲烷和丙酮混合溶劑。[oo16] 優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑包含重均分子量為4—6萬的海藻酸鈉。[oo17] 海藻酸鈉，一種天然多糖，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性1溶解性1粘性和安全性。分子式為(C。H，。。Na)n，主要由海藻酸的鈉鹽組成，由a—L一甘露糖醛酸(M單元)與b—D一古羅糖醛酸(G單元)依靠l，4一糖苷鍵連接并由不同GG(；-MMM片段組成的共聚物。[oo18] 本發(fā)明還提供了一種所述生長(zhǎng)因子緩釋微球的制備方法，包括以下步驟[oo19] 步驟l將o．8一1．2份的神經(jīng)生長(zhǎng)因子溶于8．o×lo‘一1．2×lo‘份的磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為6．7×lo—1．5×lo一3％的水相溶液；
步驟2將2．4—3．6×lo‘份的重均分子量為lo—lo．5萬的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸溶于8．o×105一1．2×lo‘份的體積比為2—4l的二氯甲烷和丙酮混合溶劑中，冰浴超聲分散o．8一1．2min，制成濃度為2—4．5％的油相溶液；
步驟3將所述水相溶液和所述油相溶液制備成油包水型乳液，將4．o×lo‘份重均分子量為4—6萬的海藻酸鈉溶于剩余重量份的份磷酸緩沖液，與所述油包水型乳液混合后冰浴超聲分散o．8一1．2min，制成微乳液；
步驟4將所述微乳液在室溫下低速攪拌3—5min，自然揮發(fā)或抽提出去二氯甲烷，制得所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球。
本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的生長(zhǎng)因子緩釋微球。
本發(fā)明還提供了所述生長(zhǎng)因子緩釋微球在制備治療骨損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑，包括所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球以及藥學(xué)上可接受的輔料。
作為優(yōu)選，所述藥學(xué)上可接受的輔料為聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)是一種高分子非離子型表面活性劑，為美國(guó)國(guó)家處方集新增加的藥物輔助材料，具有在低溫下(4—5℃)為液體，體溫下為凝膠的獨(dú)特性質(zhì)。凝膠具有黏附性能好，不易在骨創(chuàng)傷組織脫落和揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在4—5℃為可流動(dòng)的膠體，20一38℃為凝膠。
磷酸鹽緩沖液3．208—4．812×lo‘份
聚氧乙烯聚氧丙烯醚6．o一9．o×lo‘重量份
%。微球在14d內(nèi)，不僅一直持續(xù)釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子，而且所釋 放出的神經(jīng)生長(zhǎng)因子濃度可以保持在一定的水平(54. 67-76.81)fmol/yL，平均濃度為 (65.74±11.07)fmol/yL。經(jīng)檢測(cè)表明，本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子緩釋微球的突釋期僅為 18. 37%，14d后釋放度達(dá)75. 72%。以累積釋放率和時(shí)間進(jìn)行擬合，神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微 球的體外釋藥規(guī)律符合 Higuichi 方程=Q = 27. 7636t1/2-13. 4247，r = 09975 (η = 3)。生 長(zhǎng)因子緩釋微球的體外釋藥曲線也顯示本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子緩釋微球體外能夠持續(xù)釋 藥，具有明顯的緩釋作用，可以控制藥物以一定的速度釋放，延長(zhǎng)藥物的生理活性，提高藥 物的穩(wěn)定性和靶向性；將聚氧乙烯聚氧丙烯醚加入到生長(zhǎng)因子緩釋微球中制得的生長(zhǎng)因子 緩釋微球制劑具有粘附性能好的優(yōu)點(diǎn)，不易在骨創(chuàng)傷組織脫落和揮發(fā)，有效發(fā)揮藥理活性。 骨損傷動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)動(dòng)物傷后7天，各試驗(yàn)組療效與對(duì)照組相似，但好于空白 組。傷后14天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組顯著好于空白組(P < 0. 05)，且因藥物的緩釋效應(yīng)，試驗(yàn)組 療效好于對(duì)照組。傷后28天，試驗(yàn)組顯著要好于對(duì)照組(金路捷)和空白組(生理鹽水) (P < 0. 05)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，生長(zhǎng)因子緩釋微球及其制劑對(duì)骨損傷有較好的治療效果。


圖1示生長(zhǎng)因子緩釋微球掃描電鏡圖，放大倍數(shù)為500倍。圖2示生長(zhǎng)因子緩釋微球粒徑分布圖。圖3示生長(zhǎng)因子體外釋藥曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種生長(zhǎng)因子緩釋微球、制劑及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所 述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明本發(fā)明中，單甲氧基聚乙二醇聚乳酸購(gòu)自濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；神經(jīng)生長(zhǎng) 因子和NGF Elisa試劑盒購(gòu)自PEPR0TECH公司；磷酸鹽緩沖液，購(gòu)自武漢博士德生物材料公 司；海藻酸鈉，購(gòu)自Sigma公司；聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)，購(gòu)自上海醫(yī)藥公司。實(shí)施例1制備生長(zhǎng)因子緩釋微球稱取5 μ g神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物溶于0. 5g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水 相；稱取150mg單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(聚乙二醇的分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸 的聚合比例為1 100)溶于5g有機(jī)溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上 述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入20g磷酸鹽緩沖液 (磷酸鹽緩沖液中含200mg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續(xù)在室溫低速攪拌3h，除去有 機(jī)溶劑即得生長(zhǎng)因子微球膠體溶液。實(shí)施例2制備生長(zhǎng)因子緩釋微球稱取IOyg神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物溶于Ig磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水 相；稱取300mg單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(聚乙二醇的分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸 的聚合比例為1 80)溶于IOg有機(jī)溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上 述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入40g磷酸鹽緩沖液 (磷酸鹽緩沖液中含400mg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續(xù)在室溫低速攪拌5h，除去有 機(jī)溶劑即得生長(zhǎng)因子微球膠體溶液。實(shí)施例3制備生長(zhǎng)因子緩釋微球稱取20 μ g神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物溶于2g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水 相；稱取600mg單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(聚乙二醇的分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸 的聚合比例為1 120)溶于20g有機(jī)溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上 述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入80g磷酸鹽緩沖液 (磷酸鹽緩沖液中含SOOmg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續(xù)在室溫低速攪拌4h，除去有 機(jī)溶劑即得生長(zhǎng)因子微球膠體溶液。實(shí)施例4制備生長(zhǎng)因子緩釋微球稱取4 μ g神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物溶于0. 6g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水 相；稱取120mg單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(聚乙二醇的分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸 的聚合比例為1 90)溶于6g有機(jī)溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上述 水相、油相混合，超聲分散1. 2min制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入16g磷酸鹽緩沖液 (磷酸鹽緩沖液中含160mg海藻酸鈉)，超聲分散0. 8min,并繼續(xù)在室溫低速攪拌3h，除去 有機(jī)溶劑即得生長(zhǎng)因子微球膠體溶液。實(shí)施例5制備生長(zhǎng)因子緩釋微球稱取6 μ g神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物溶于0. 4g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水 相；稱取150mg單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(聚乙二醇的分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸 的聚合比例為1 110)溶于4g有機(jī)溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上述 水相、油相混合，超聲分散0. Smin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入24g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含240mg海藻酸鈉)，超聲分散1. 2min,并繼續(xù)在室溫低速攪拌5h，除去 有機(jī)溶劑即得生長(zhǎng)因子微球膠體溶液。實(shí)施例6制備生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在實(shí)施例1制備的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于20°C ) 攪拌下，少量多次加入3. 75g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實(shí)施例7制備生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在實(shí)施例2制備的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于20°C ) 攪拌下，少量多次加入7. 5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實(shí)施例8制備生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在實(shí)施例3制備的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于20°C ) 攪拌下，少量多次加入15g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實(shí)施例9制備生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在實(shí)施例4制備的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于20°C ) 攪拌下，少量多次加入3. Og聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實(shí)施例10制備生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑在實(shí)施例5制備的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于20°C ) 攪拌下，少量多次加入4. 5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實(shí)施例11分別取實(shí)施例1至5中制備的生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液各10 μ L，共5份樣本， 用光學(xué)顯微鏡觀察微球的表面形態(tài)，微球表面光滑圓整，球體大小較均勻。將微球置于載玻 片上，盡量對(duì)微球進(jìn)行分散后，在顯微鏡下隨機(jī)選取1個(gè)視野進(jìn)行拍照，以照片上的標(biāo)尺為 依據(jù)對(duì)每一個(gè)微球的直徑進(jìn)行測(cè)量。每5 μ m為單位，直徑士2. 5 μ m的全部計(jì)入，平均粒徑 為74. 2士21.3 μ m，粒徑分布范圍較窄。實(shí)施例12取神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)照品約10mg，精密稱重，置于IOOg量瓶中，加水溶解并稀釋 至刻度，搖勻，依次稀釋，使實(shí)際配置的對(duì)照品溶液濃度分別為0. 1,0.2,0.5,1,5,10,20, 50ng/L,加入到微量反應(yīng)板的微孔中。按照PEPROTECH公司提供的操作程序，采用酶聯(lián)免疫 吸附法(ELISA)在HTS7000紫外熒光高效分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品在在490nm波長(zhǎng)的吸光度 (OD)0以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子濃度C進(jìn)行對(duì)數(shù)直線回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；?歸方程為:A = 0. 48899+0. 08602C η = 7，r = 0. 9973由圖像分析可知，在l_600nm范圍內(nèi) 為線性關(guān)系較好的直線方程，神經(jīng)生長(zhǎng)因子濃度的對(duì)數(shù)與吸收度有定量關(guān)系。將實(shí)施例1制備的生長(zhǎng)因子緩釋微球膠體溶液在4°C、40000rpm條件下離心，2h后 分離樣品中上清液，測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子濃度，分別計(jì)算神經(jīng)生長(zhǎng)因子的載藥量和包封率。其 中載藥量公式
神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球所含藥物重
載藥量=χ 100%
神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球的總重包封率公式為
權(quán)利要求
1.一種生長(zhǎng)因子緩釋微球，其特征在于，包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子、重均分子量為10-10.5 萬的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸、助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和單甲氧基聚乙 二醇聚乳酸的質(zhì)量比為0.8-1. 2 2.4-3.6X104，所述生長(zhǎng)因子緩釋微球的平均粒徑為 52. 9-95. 5 μ m。
2.如權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球，其特征在于，所述單甲氧基聚乙二醇聚乳 酸中，聚乙二醇分子量為5000，聚乙二醇和聚乳酸的聚合比例為1 80-120。
3.如權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球，其特征在于，所述助溶劑包含磷酸鹽緩沖 液，所述乳化劑包含體積比為2-4 1的二氯甲烷和丙酮的混合溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球，其特征在于，所述穩(wěn)定劑包含重均分子量 為4-6萬的海藻酸鈉。
5.一種如權(quán)利要求1所述生長(zhǎng)因子緩釋微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1 將0. 8-1. 2份的神經(jīng)生長(zhǎng)因子溶于8. OX IO4-L 2 X IO5份的磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為6. 7 X 10-4-1. 5X 10_3%的水相溶液；步驟2 將2. 4-3. 6 X IO4份的重均分子量為10-10. 5萬的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸溶 于8.0X 105-1.2X 106份的體積比為2-4 1的二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，冰浴超聲分 散0. 8-1. 2min，制成濃度為2-4. 5%的油相溶液；步驟3 將所述水相溶液和所述油相溶液制備成油包水型乳液，將4. 0 X IO4份重均分 子量為4-6萬的海藻酸鈉溶于剩余重量份的磷酸緩沖液中，與所述油包水型乳液混合后冰 浴超聲分散0. 8-1. 2min,制成微乳液；步驟4 將所述微乳液在室溫下低速攪拌3-5min，自然揮發(fā)或抽提出去二氯甲烷，制得 所述生長(zhǎng)因子緩釋微球。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法制得的生長(zhǎng)因子緩釋微球。
7.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)或權(quán)利要求6所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球在制備治療骨損傷 藥物中的應(yīng)用。
8.—種生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)或權(quán)利要求6 所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球以及藥學(xué)上可接受的輔料。
9.如權(quán)利要求8所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的輔 料為聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
10.如權(quán)利要求9所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于，在低于20°C 的溫度下，將如權(quán)利要求6所述的生長(zhǎng)因子緩釋微球邊攪拌邊加入6. 0-9. OX IO3重量份的 聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生長(zhǎng)因子緩釋微球，包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子、重均分子量為10-10.5萬的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸、助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和單甲氧基聚乙二醇聚乳酸的質(zhì)量比為0.8-1.2∶2.4-3.6×104，緩釋微球的平均粒徑為52.9-95.5μm。本發(fā)明還提供了一種生長(zhǎng)因子緩釋微球制劑，包含上述生長(zhǎng)因子緩釋微球及6.0-9.0×103重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚。骨損傷動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)因子緩釋微球及其制劑對(duì)骨損傷有較好的治療效果，顯著優(yōu)于對(duì)照組和空白組P＜0.05。
文檔編號(hào)A61P19/08GK102091043SQ20111002733
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉民, 張綱, 譚穎徽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院