專利名稱：一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗 (PRRS VLP疫苗)及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬繁歹直與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)和小豬呼吸系統(tǒng)疾病的一種病毒，1991年在荷蘭被分離出來并命名 為萊利斯塔德病毒(Lelystad Virus)，1992年在美國也分離出一株能造成相同癥狀的病 毒，隨后該病毒被正式命名為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，并確立了以Lelystad Virus(LV) 為代表的歐洲株和以ATCC VR2332株為代表的美洲株。在1995年末在中國大陸也出現(xiàn)了 一種臨床表現(xiàn)為體溫升高、皮膚發(fā)紅，并伴隨高致病率和死亡率的疫情，當(dāng)時被稱作“豬高 熱病”。當(dāng)1996年該病毒被分離出來后證實該疫情是由變異的美洲株P(guān)RRSV引起的，遂確 定為豬繁殖與呼吸綜合癥，又稱“藍(lán)耳病”。在2006-2007年，在中國大陸爆發(fā)的大規(guī)模藍(lán)耳 病疫情，致病率與死亡率遠(yuǎn)高于以往疫情，這導(dǎo)致了當(dāng)時中國豬肉價格的飛漲，并對生豬養(yǎng) 殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重打擊。當(dāng)該高致病性藍(lán)耳病病毒被分離出來，并利用分子生物學(xué)方法研究 后，發(fā)現(xiàn)造成這次疫情的PRRSV在Nsp2編碼區(qū)缺少90個核苷酸，相應(yīng)編碼蛋白有30個氨 基酸的卻失，并且有證據(jù)表明這是在中國大陸發(fā)生突變的一類毒株，其30個氨基酸的缺失 雖然與其高致病性沒有關(guān)系，卻是高致病性毒株的一個明顯標(biāo)志。同時在中國爆發(fā)的高致 病性藍(lán)耳病的另一個特征是多種病原體的共同感染與繼發(fā)感染，有證據(jù)表明，在PRRSV感 染的同時也發(fā)現(xiàn)了豬瘟、豬偽狂犬病、豬流感、豬細(xì)小病毒、豬鏈球菌的共同感染，以及繼發(fā) 的豬霍亂沙門氏菌、豬胸膜肺炎放線菌肺炎、副豬嗜血桿菌感染。其中最重要的一點是高致 病性PRRSV與可以造成仔豬多系統(tǒng)綜合癥的豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)的雙重感染，這些共 同感染和繼發(fā)感染造成了病豬的主要臨床癥狀與疫情的大規(guī)模傳播。PRRSV與馬動脈炎病毒(EAV)小鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV)和猴出血熱病毒(SHFV) 等非常相似，國際上將其劃為一個新的病毒群，即動脈炎病毒科(Arteriviridae)，與冠狀 病毒(Coronaviridae)共同組成尼多病毒目(Nidovirales)(又稱網(wǎng)巢病毒目、成套病毒 目、套式病毒目)。包含有以Lelystad Virus (LV)為代表的歐洲株(A亞群)、和以ATCC VR2332株為代表的美洲株(B亞群)，中國所分離的PRRSV都為變異美洲株，屬于B亞群。PRRSV是一類小型有包膜病毒，直徑45nm-65nm。屬于單股正鏈RNA病毒，基因組 全長15Kb,除去5，端和3，端兩個非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5，UTR,3' UTR)，共有8個開放閱讀框(ORF)。 其中ORFl占基因組全長80%，分為ORFla和ORFlb兩個部分，共編碼12個非結(jié)構(gòu)蛋白 (NSP)，包括RNA依賴的RNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)以及其他未知蛋白?；蚪M余下的20%包 含0RF2-0RF7六個開放閱讀框，其中0RF2編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP2、0RF3編碼糖基化結(jié)構(gòu) 蛋白GP3、0RF4編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP4、0RF5編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP5、0RF6編碼非糖基 化結(jié)構(gòu)蛋白M、0RF7編碼核蛋白N。其中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白為GP5、M、N三種。其中N蛋白 長15kD，至少有5個抗原決定簇，其中包括兩型的共同決定簇和特異性決定簇，具有一個糖基化位點，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在維持蛋白構(gòu)象上起重要作用。其N端半 段是由Arg、Lys和His 3種堿性氨基酸組成，可能和RNA基因組間的相互作用有關(guān)。N蛋 白之間形成同源二聚體，對病毒的組裝至關(guān)重要。M蛋白約18kD，在PRRSV中非常保守，在 病毒包膜表面三次跨膜，并且N末端的16個氨基酸殘基暴露在膜外，雖然M蛋白的功能還 沒有完全研究清楚，但已有研究推測，M蛋白在PRRSV的組裝和出芽時扮演重要角色。同時 M蛋白能刺激T淋巴細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和作用。GP5蛋白約25kD，是一個 糖基化蛋白，含有4個糖基化位點，且非常不保守，三次跨膜，并有一個70個氨基酸殘基的 胞外區(qū)。有6個抗原決定簇，有證據(jù)表明GP5與PRRSV的抗體識別過程中起關(guān)鍵作用，是誘 導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價呈顯著相關(guān)性，同時GP5 還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是公認(rèn)的PRRSV的主要保護性抗原。眾所周知，疫苗是防控傳染病最有效的手段，在中國，早在2000年就CH-Ia毒株 的滅活疫苗被批準(zhǔn)上市，2007年CH-Ia毒株的減毒活苗也被批準(zhǔn)上市。然而，這兩種疫苗 的使用卻沒有達到預(yù)期效果，而且還有證據(jù)表明，許多PRRSV病例都是由于減毒活苗的使 用而引起的。在我國爆發(fā)高致病性藍(lán)耳病后，利用JXAl毒株制備的滅活苗被推出，該疫苗 的使用卻沒有得到預(yù)期的免疫保護效果。由于PRRSV的GP5蛋白是公認(rèn)的保護性抗原，與 此同時許多基因工程疫苗也被加以研究。比如Lowe J F等用含編碼0RF5的質(zhì)粒進行DNA 免疫，可使接種豬產(chǎn)生抗0RF5的特異性中和抗體，接種豬免于強毒攻擊造成的全身性病毒 血癥和肺部病變，并使間質(zhì)性肺炎和支氣管肺泡炎明顯減輕。Xue Q等用編碼PRRSV 0RF5、 0RF7和編碼豬細(xì)胞因子IL2、IFNy的真核表達質(zhì)粒聯(lián)合接種仔豬，誘導(dǎo)出體液免疫和細(xì)胞 免疫反應(yīng)。Qiu H J等以PRVBarthaK61株為載體，構(gòu)建表達PRRSV主要免疫原性蛋白GP5 的重組偽狂犬病病毒疫苗，免疫仔豬后可以對PRRSV強毒攻擊有保護效果。以及一些其他 重組病毒疫苗、亞單位疫苗都對PRRSV產(chǎn)生一定的保護效果，但都由于保護力差、安全性低 等種種原因還處于研發(fā)階段。因此克服目前PRRSV活苗、滅活苗、以及基因工程疫苗的低安 全性、低保護力等缺點，尋找新的技術(shù)策略、研發(fā)一種安全、高效、非復(fù)制的病毒疫苗，在能 較好地保護PRRSV攻擊的同時，并能較好地避免共同感染和繼發(fā)感染的發(fā)生，是安全、有效 免疫防控PRRSV的重大科學(xué)前提。病毒樣顆粒(Virus-like pratical, VLP)是由病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白組成不含病毒 核酸的病毒粒子空殼。由于VLP大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒有 區(qū)別，因此能被宿主抗原提呈細(xì)胞所識別，引起免疫應(yīng)答和效應(yīng)，且無潛在的副作用。首先， 與活苗及滅活苗相比，病毒樣顆粒疫苗沒有不安全因素；與亞單位疫苗相比，VLP是多個抗 原蛋白組成，具有很強的免疫原性；與有良好口碑的病毒體(Virosome)相比，VLP既不是由 活病毒制備而來，沒有潛在的危險性、也不需要大量的繁殖病毒，沒有安全性低、成本高以 及制備周期長等不足；由此VLP疫苗被當(dāng)今譽為病毒類疫苗發(fā)展的新里程碑。目前的乙肝 VLP 疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳頭瘤 VLP 疫苗(Gardisi 1，Merck)和流感 VLP 疫苗已 上市，戊型VLP疫苗等多個品種在臨床研究中。雖然目前對PRRS VLP形成的機制與效率問 題還不明確，但已有證據(jù)表明PRRSV的N蛋白M蛋白在病毒包裝中扮演重要角色，而且GP5 蛋白作為一個主要的表面蛋白，對PRRSV的免疫原性起決定作用。同時在本實驗室的前期 工作中以證明PRRSV的N蛋白、M蛋白、GP5蛋白可以組裝VLP并誘導(dǎo)實驗動物良好的免疫 應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗(PRRS VLP疫 苗)，本發(fā)明目的還在于公開該疫苗的制備方法。本發(fā)明目的是通過如下方案實現(xiàn)的本發(fā)明PRRS VLP疫苗含有豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M、NP、GP5三種結(jié)構(gòu)蛋白組成 的 VLP。本發(fā)明RS VLP疫苗涉及以下核酸序列①PRRSV M蛋白的核酸序列 ’②PRRSV N蛋白的核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的核酸序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括來 自 PRRSV CH-la, BJ-4、HB-I (SH)、HB-2 (SH)、Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXAl、HUN4、 SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06亞型的PRRSV CH-la/GP5,PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-I(SH)/ GP5、PRRSVHB-2(SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5,PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5,PRRSVSY0608/GP5,PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。本發(fā)明PRRS VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①PRRSV M蛋白的氨基酸序列； ②PRRSV N蛋白的氨基酸序列；③PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列；其中，所述GP5蛋白核 酸序列包括來自 PRRSV CH-la, BJ-4、HB-I (SH)、HB-2 (SH)、Em2007、NB-04, BJ0706、JX143、 JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bj sy06、NX06 亞型的 PRRSV CH-1 a/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-I(SH)/GP5,PRRSV HB-2(SH)/GP5,PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5,PRRSVBJ0706/ GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSVSY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。本發(fā)明PRRS VLP疫苗含有豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒(PRRS VLP)，并攜帶有 以下表面蛋白①PRRSV的GP5蛋白，所述GP5蛋白核酸序列包括來自PRRSV CH_la、BJ-4、 HB-I (SH)、HB-2 (SH)、Em2007、NB-04, BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、 NX06 亞型的 PRRSV CH-la/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSV HB-1 (SH)/GP5、PRRSV HB-2 (SH) / GP5、PRRSVEm2007/GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5, PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSVJXwn06/GP5, PRRSV Bjsy06/GP5、 PRRSV NX06/GP5o本發(fā)明PRRS VLP疫苗包含一個攜帶有RSV主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達載體、 雞成纖維細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞；其中，所述真核表達載體選自①PHWD2000 ； ②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/ DF-I細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì) 胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦MDCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì) 胞；所述昆蟲細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。其中，本發(fā)明pHWD2000載體是由pHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體 上游的PCMV啟動子，并用雞β-actin蛋白啟動子替換，同時在雞β-actin蛋白啟動字上 游插入hCMV-IE增強子，改造后的PCWD2000可以在真核系統(tǒng)中高效表達外源基因，同時 PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的外源基因片段。其中，本發(fā)明PRRS VLP疫苗可不含有佐劑，也可以含有如下佐劑中的一種或幾種①氫氧化鋁或磷酸鋁；②新型納米鋁佐劑；③ P3BSK4(N-palmitoyl—S—[2，3-bis(palmitoy-loxy)-(2RS)-propul]-[R]-prop yl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]- (Iysyl)3-lysine)；④水凝膠佐劑季胺化的殼聚糖。⑤rLT(重組不耐熱性腸毒素)等。本發(fā)明PRRS VLP疫苗可制成多種臨床適用的劑型，包含但不限于注射劑型、滴鼻 劑型、飲水劑型。本發(fā)明PRRS VLP疫苗包括如下幾種PRRSV CH-la/GP5疫苗、PRRSVBJ-4/GP5疫 苗、PRRSV HB-I (SH) /GP5 疫苗、PRRSV HB-2 (SH) /GP5 疫苗、PRRSV Em2007/GP5 疫苗、PRRSV NB-04/GP5 疫苗、PRRSV BJ0706/GP5 疫苗、PRRSV JX143/GP5 疫苗、PRRSV JXA1/GP5 疫苗、 PRRSV HUN4/GP5 疫苗、PRRSV SY0608/GP5 疫苗、PRRSV JXwn06/GP5 疫苗、PRRSV Bjsy06/ GP5 疫苗、PRRSV NX06/GP5 疫苗。本發(fā)明PRRS VLP疫苗的制備方法包括如下步驟以構(gòu)建重組pHWD2000真核表達載體為例①構(gòu)建pHWD2000真核表達載體；②含 有編碼PRRSV M蛋白核酸序列的重組真核表達載體；③含有編碼PRRSV N蛋白的核酸序列 的重組真核表達載體；④含有編碼重組PRRSV GP5蛋白的核酸序列的重組真核表達載體； ⑥提供一種用于表達的細(xì)胞系，將含有編碼PRRSV M、NP、GP5的核酸序列的重組真核表達載 體PHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5同轉(zhuǎn)化用于表達的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放 PRRS VLP;⑦提供用于純化PRRS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析 純化方法。其中該方法所述PRRS VLP可激發(fā)體液與細(xì)胞雙重的免疫應(yīng)答；其中所述PRRS VLP 所包含 GP5 蛋白包括來自 PRRSV CH-la, BJ-4、HB-I (SH)、HB-2 (SH)、Em2007、NB-04、 BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06 亞型的 PRRSV CH_la/GP5、PRRSV BJ-4/GP5, PRRSV HB-I(SH) /GP5, PRRSV HB-2 (SH) /GP5, PRRSV Em2007/GP5、PRRSV NB-04/ GP5,PRRSVBJ0706/GP5,PRRSV JX143/GP5,PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5,PRRSVSY0608/ GP5, PRRSV JXwn06/GP5,PRRSV Bjsy06/GP5, PRRSV NX06/GP5o其中，本發(fā)明方法涉及一個PRRS VLP表達宿主細(xì)胞系，其中，所指細(xì)胞為雞成纖維 細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì) 胞；哺乳動物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤BHK細(xì) 胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦MDCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞；⑩SF9 Cell細(xì)胞。其中，本發(fā)明制備PRRS VLP細(xì)胞培養(yǎng)方法包括如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃 度為2-100μ g/mL的糖胺聚糖，優(yōu)選 ομ g/mL ；其中，所指糖胺聚糖為硫酸肝素、硫酸軟骨 素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素，優(yōu)選肝素。其中，本發(fā)明制備PRRS VLP時的純化方法包括如下步驟蔗糖梯度離心法，所述 蔗糖梯度離心法選用最佳蔗糖濃度為1. 19g/mL ；或柱層析純化方法，用kphar0Se6FFTM分 子篩并進行DEAE-SepharoseFFTM離子交換。其中，蔗糖梯度離心的步驟為①收集規(guī)模化生產(chǎn)的PRRS VLP細(xì)胞培養(yǎng)液， 40C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液100000g 4°C離心2h，沉淀用HNE buffer 懸浮，HNE buffer 的組成為 25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ；③將懸 液進行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNE buffer配制，體系采用0. 3g/mL蔗糖3mL ；0. 45g/mL蔗糖3mL ；1. 19g/mL蔗糖ImL ；4°C IOOOOOg離心池；④收集中間層，并用折射儀測量密度；⑤ 用pH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰； 雜蛋白去除可達95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液 為ρΗ6· 5-7. 5、含有0. 05-0. 15Μ氯化鈉的PBS,洗脫液為含0. 2-0. 5Μ氯化鈉、ρΗ6. 5-7. 5的 PBS ；雜蛋白去除可達99 %以上，純化后的VLP原液為疫苗原液。本發(fā)明產(chǎn)品及方法中所述的百分含量均為質(zhì)量體積百分含量。本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒體疫苗，主要包括PRRS VLP。該VLP包 含有PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白Μ、N以及主要表面抗原GP5，可以激發(fā)良好雙重的細(xì)胞及體液免疫 應(yīng)答。經(jīng)此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐劑，制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型 免疫接種不同動物群體后，可安全、有效預(yù)防PRRSV感染，為不同種群母豬、小豬、育肥豬安 全、有效免疫防控PRRSV感染提供了理想疫苗。本發(fā)明進行了藥效實驗，分別通過注射、滴 鼻、飲水等途徑免疫小豬與懷孕母豬產(chǎn)生好的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答及天然免疫與獲得 性免疫應(yīng)答以及黏膜免疫應(yīng)答效果，且沒有免疫損傷或由疫苗接種而導(dǎo)致的發(fā)病跡象，具 有安全性。本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合癥病毒體疫苗免疫無PRRSV免疫背景的小豬、母豬與 育肥豬兩次，進一步通過VR2332、CH-Ia型毒株以及我國不同地區(qū)臨床分離的PRRSV及高 致病性PRRSV流行野株攻毒，有95%以上的免疫保護效果。用本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合癥 病毒體疫苗接種不同地區(qū)、種群的母豬、小豬，第1、第21天各免疫一次，分別采用注射、滴 鼻、飲水劑型疫苗免疫，均顯示各地區(qū)、各種群母豬、小豬沒有出現(xiàn)由疫苗接種引發(fā)的發(fā)病 現(xiàn)象，具有安全性。并能產(chǎn)生好的雙重免疫應(yīng)答和免疫保護力，其保護率達90%以上，由此 表明研發(fā)的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒體疫苗對不同地區(qū)、種群的豬群都具有較好的免疫保 護效果。下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例1 本發(fā)明PRRS VLP疫苗檢定實驗本發(fā)明實施例8制備的PRRS VLP疫苗注射劑、滴鼻劑、飲水劑型外觀見均一，無異 味和染菌；通過豚鼠、家兔試驗無熱原、異常毒性和急性毒性反應(yīng)；通過3日齡乳鼠腦內(nèi)接 種，以及3日齡小豬頸部肌肉注射試驗無發(fā)病現(xiàn)象；通過Lorry法測定蛋白含量均在劑量范 圍；通過電鏡觀察VLP直徑約45-65nm，與天然病毒一致；ELISA測定DNA含量均在50EU以 下；通過SDS-PAGE和WB檢測抗原蛋白成分存在；通過免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗體 效價在3200以上。實驗例2 本發(fā)明PRRS VLP疫苗對實驗豬體內(nèi)的免疫應(yīng)答效果實驗本發(fā)明實施例8制備的PRRS VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、 飲水疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、P3BSK4, rLT、為對照組，分別按各自途徑免疫3日 齡小豬，以及后備母豬其免疫劑量按實施例8疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)；末次免 疫后14天采集各組小豬及母豬的外周血、分離血清和免疫細(xì)胞，采集脾淋巴細(xì)胞、肺和鼻 腔灌洗液；通過ELISA法測定血清抗體效價在6400以上，采用MTT法測定中和抗體效價在 3200以上，采用流失細(xì)胞儀、ELISP0T儀測定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分子、趣 化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法鼻 腔、肺灌洗液SIgA抗體效價在160以上。結(jié)果顯示，本發(fā)明PRRS VLP疫苗不管是加入佐劑 與沒有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且試驗組有佐劑組好于無佐劑組、高劑量好于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對照組沒有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的PRRS VLP疫苗不管是 注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑型血清抗體效價高于 滴鼻、飲水劑型，噴鼻、飲水劑型黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于注射劑型。實驗例3 本發(fā)明PRRS VLP疫苗對實驗豬體內(nèi)的免疫保護效果實驗本發(fā)明實施例8制備的PRRS VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、 飲水劑型為實驗組，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、P3BSK4, rLT、及PRRSVCH-Ia滅活病毒為對照 組，分別按各自途徑免疫3日齡小豬、后備母豬，其免疫劑量按實施例8疫苗低劑量組，免 疫兩次(0，21天)，末次免疫后14天各試驗組、對照組實驗豬用IO5 tlTCID5ci臨床分離PRRSV 毒株分別頸部肌肉注射攻毒觀察保護效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明PRRS VLP疫苗均都能產(chǎn)生高 水平的保護效果，免疫保護率在90 %以上，而對照組PRRSV CH-Ia滅活病毒疫苗保護率達 60%、其他各對照組保護率為0%。由此制備的PRRS VLP疫苗在小豬和母豬體內(nèi)具有高效 的免疫保護效果。實驗例4 本發(fā)明PRRS VLP疫苗對懷孕母豬的免疫應(yīng)答及免疫保護效果實驗本發(fā)明實施例8制備的PRRS VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、 飲水劑型，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、P3BSK4, rLT和PRRSV CH-Ia滅活病毒疫苗為對照組，分 別按各自途徑免疫懷孕60天母豬，其免疫劑量按實施例8疫苗高劑量組，免疫兩次(0，21 天)；當(dāng)末次免疫后14天采集各組母豬的外周血、分離血清和免疫細(xì)胞，采集脾淋巴細(xì)胞、 肺和鼻腔灌洗液；通過ELISA法測定血清抗體效價在1觀00以上，采用MTT法測定中和抗體 效價在6400以上，采用流失細(xì)胞儀、ELISP0T儀測定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分 子、趣化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA 法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價在200以上。當(dāng)母豬分娩后觀察沒有早產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔情況。 結(jié)果顯示，本發(fā)明PRRS VLP疫苗不管是加入佐劑與沒有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng) 答，且試驗組有佐劑組好于無佐劑組、高劑量高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對照組沒有產(chǎn) 生雙重免疫應(yīng)答；本發(fā)明PRRS VLP疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿意的 雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血清抗體效價高于滴鼻、飲水劑型，滴鼻、飲水劑型黏膜和細(xì)胞免 疫效應(yīng)好于注射劑型。由此制備的PRRS VLP疫苗在懷孕母豬體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果。上述PRRS VLP疫苗通過各自方法免疫配種前母豬，配種后21天進行2次免疫，在 懷孕80天各試驗組、對照組懷孕母住用IO5 tlTCID5ci臨床分離PRRSV毒株分別頸部肌肉注射 攻毒，待母豬自然生產(chǎn)后觀察保護效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明PRRS VLP疫苗均都能產(chǎn)生高水平 的保護效果，免疫保護率在90%以上，而對照組PRRSV CH-Ia滅活病毒疫苗保護率達78%、 其他各對照組保護率達為0%。由此制備的PRRS VLP疫苗對懷孕母住具有高效的免疫保護 效果。實驗例5 本發(fā)明PRRS VLP疫苗的安全性實驗(1)無菌、支原體試驗將實施例8制備的PRRS VLP疫苗接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、 營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無菌生理鹽水做陰性對照，培養(yǎng)溫度 為25°C、35°C。結(jié)果顯示，PRRS VLP疫苗都未見細(xì)菌生長。將PRRS VLP疫苗用半流體和肉 湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無菌生理鹽水做陰性對照，結(jié)果顯示PRRS VLP疫苗無支原體生長；用DNA染色法將毒種接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)3天，傳代一次，用二苯甲 酰胺熒光染料染色。結(jié)果顯示，RS VLP疫苗無支原體生長。
(2)溶血性試驗選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌 3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋PRRS VLP疫苗(由實施例8制備)，分別 為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時后，評價血球溶解以目測 或者上清濃度檢測為準(zhǔn)，并在570nm處檢測吸光度。結(jié)果顯示，沒有發(fā)生血球破裂，無溶血 現(xiàn)象。說明PRRS VLP疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因此，PRRS VLP疫苗無溶血反應(yīng)。(3)急性毒性試驗取實施例8制備的PRRS VLP疫苗0. 5ml腹腔注射體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時設(shè)PBS陰性對照組，連續(xù)2周觀察小鼠的活動狀態(tài)、體重 變化和存活率。結(jié)果表明，實驗小鼠全部存活，沒有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動遲緩等不良癥 狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明PRRS VLP疫苗在試驗的濃度下對動物是安全的，且14天后 處死進行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急 性毒性結(jié)果取實施例8制備的PRRS VLP疫苗肌肉注射15mL，每組10只，同時設(shè)PBS陰性 對照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率變化。結(jié)果可見，Beagle狗未見毒性反應(yīng)，行為 正常，沒有死亡，與對照組狗比較無差異，各狗體重有所增加，并處死大體解剖未見臟器有 明顯的病理改變。因此，PRRS VLP疫苗無急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。(4)過敏試驗研究取實施例8制備的PRRS VLP疫苗皮下接種體重為250 350g Hartley豚鼠，每個樣品接種豚鼠5只，每只接種0. 5ml,隔日一次，共3次。第3次注射后 21天，耳靜脈分別給予相同PRRS VLP疫苗0. 5ml，并用人血白蛋白和生理鹽水以同樣的方 法分別接種3只豚鼠作為陽性、陰性對照。注射后30分鐘及3天觀察動物，陽性、陰性對照 均成立，PRRS VLP疫苗組豚鼠無死亡，且無鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過 敏癥狀。因此，PRRS VLP疫苗在動物體內(nèi)無過敏反應(yīng)。(5)兔熱源質(zhì)試驗取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測 量體溫，共測2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 50C。將實施例8制備的PRRS VLP疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測溫后15分鐘內(nèi)， 自家兔耳邊靜脈分別緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測量體溫1次，連測6次。結(jié) 果顯示PRRS VLP疫苗給予家兔個體升溫均未超過0. 2°C，3只家兔升溫總和未超過0. 4°C, 沒有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的PRRS VLP疫苗無熱源質(zhì)。(6)免疫病理損傷試驗由實施例8制備的PRRS VLP疫苗通過小豬、母豬、種豬及 育肥豬外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞及氣 管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測。試驗結(jié)果顯示，PRRSVirosome疫苗免疫接種在實驗乳豬、 母豬、種豬及育肥豬體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒有免疫器官損傷的跡象，因此具有 安全性。實驗例6 本發(fā)明PRRS VLP疫苗穩(wěn)定性實驗由實施例8制備的PRRS VLP疫苗，分別置于2_8°C、室溫(20-25°C ) >37°C 1周、2 周、1個月、3個月、6個月、12個月、18個月和M個月，取樣觀察外觀、pH值、無菌、電鏡觀察 粒徑、免疫動物觀察安全性。結(jié)果顯示PRRS VLP疫苗放置2-8°C M個月內(nèi)均無變色分層 等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無變化，電鏡觀察粒徑大小保持一致，且注射或滴鼻給小鼠或 實驗豬表現(xiàn)正常；PRRS VLP疫苗放置室溫25°C 3個月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；PRRS VLP疫苗放 置室溫37°C 1個月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說明，PRRS VLP疫苗放置2-8°C理化性 質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少M個月。
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下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例所述的效果。實施例1 本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗的基因及蛋白構(gòu)成以PRRSV的M蛋白核酸與蛋白序列、PRRSV的N蛋白的核酸與蛋白序列、PRRSV的 CH-la/GP5、BJ-4/GP5、HB-I(SH)/GP5、HB-2(SH)/GP5、Em2007/GP5、NB-04/GP5、BJ0706/GP5、 JX143/GP5、JXA1/GP5, HUN4/GP5、SY0608/GP5、JXwn06/GP5、Bjsy06/GP5、NX06/GP5 蛋白的 核酸與蛋白序列，見圖所示。實施例2.本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗的表達載體構(gòu)建以構(gòu)建重組pHWD2000表達載體為例利用PCR的方法擴增PRRSV M蛋白基因核酸 序列、N蛋白基因序列、GP5蛋白基因序列并插入到pHWD2000載體中，構(gòu)成重組pHWD2000-M、 PHWD2000-N、pHWD2000-GP5表達載體，并包含Bsa I酶切位點。實施例3.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫建立以UMNSAH/DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并建庫為例UMNSAH/DF_1細(xì)胞來源于American Type Culture Collection(ATCC)。培養(yǎng)基采用Dulbecco‘ s modified Eagle medium(DMEM)，添 加青霉素及鏈霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2% )在細(xì)胞工廠或細(xì)胞發(fā)酵罐進行 培養(yǎng)，建立細(xì)胞工作種子批庫，并及對傳代后的外援源因子、致瘤性及穩(wěn)定性等全面檢定， 細(xì)胞使用代數(shù)控制在60代以內(nèi)，均符合疫苗生產(chǎn)介質(zhì)的要求。所述細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫建立包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②人二倍體 細(xì)胞；③Vero細(xì)胞；④CHO細(xì)胞；⑤H印-2細(xì)胞；⑥MDCK細(xì)胞。實施例4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定高表達細(xì)胞系篩選與建庫PRRS VLP疫苗選用實施例3細(xì)胞庫中UMNSAH/DF-1細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將實施 例2構(gòu)建的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UMNSAH/DF-1細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定高表達RS VLP的細(xì)胞系，具體是
①在35mm 孔中，加入 pHWD2000-N 1. 0 μ g、pHWD2000_M 1. 0 μ g、pHWD2000_GP5 1. 0μ g ；
②加入5μ L OptiMEM配置的脂質(zhì)體，室溫孵育45min。然后加入到被OptiMEM潤洗過的 宿主細(xì)胞中，孵育證；③離心去除載體-脂質(zhì)體混合物，并向細(xì)胞中加入DMEM進行培養(yǎng)； ④pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5三種重組載體在細(xì)胞系中共表達，可自組裝 PRRS VLP ；⑤通過加壓篩選表達PRRS VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞株。結(jié)果顯示，在UMNSAH/ DF-I細(xì)胞15代時篩選到穩(wěn)定高表達PRRS VLP的細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞系穩(wěn)定表達與產(chǎn)量、VLP大 小與結(jié)構(gòu)、外源因子與致瘤性、染色體完整性等傳代至40代沒有表型改變。由此，建立了穩(wěn) 定高表PRRS VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞系。進一步建立具有PRRS VLP的三級細(xì)胞種子批庫， 經(jīng)對全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置液氮中保存?zhèn)溆谩Ｋ龇€(wěn)定高表PRRS VLP的細(xì)胞系包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②人二倍 體細(xì)胞；③Vero細(xì)胞；④CHO細(xì)胞；⑤H印-2細(xì)胞；⑥MDCK細(xì)胞。實施例5. PRRS VLP規(guī)模化生產(chǎn)取穩(wěn)定表達PRRS VLP的UMNSAH/DF-1工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加 入或加入10-2%胎牛血清、加入10μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠或加入微載體30L細(xì) 胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)生產(chǎn)使得細(xì)胞密度達到IX 107_8以上時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原 液。PRRS VLP規(guī)?；a(chǎn)方法包括如下方法①人二倍體細(xì)胞取穩(wěn)定表達PRRS VLP的二倍體細(xì)胞工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠放大培 養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原液。②Vero細(xì)胞取穩(wěn)定表達I3RRS VLP的Vero細(xì)胞工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng) 液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠或加入微載 體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原液。③CHO細(xì)胞取穩(wěn)定表達PRRS VLP的CHO細(xì)胞工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液 (不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠或加入微載體 的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原液。④!fep-2細(xì)胞取穩(wěn)定表達PRRS VLP的!fep-2細(xì)胞工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培 養(yǎng)液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠或加入微 載體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原液。⑤MDCK細(xì)胞取穩(wěn)定表達I3RRS VLP的MDCK細(xì)胞工作批庫細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng) 液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過20L細(xì)胞工廠或加入微載 體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時，收集細(xì)胞培養(yǎng)PRRS VLP疫苗原液。實施例6. PRRS VLP疫苗的純化①收集規(guī)?；a(chǎn)的PRRS VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì)胞及 雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用少量HNE buffer (25mMTris-HCl pH 7.4， 150mM NaCl,5mM EDTA)懸浮。③將懸液進行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNE buffer配制， 體系采用 0. 3g/mL 蔗糖 3mL ；0. 45g/mL 蔗糖 3mL ；1. 19g/mL 蔗糖 ImL ；4 °C IOOOOOg 離心 2h ；④收集中間層，并用折射儀測量密度；⑤用pH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM 介質(zhì)進行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰。雜蛋白去除可達95%以上；⑥采用 DEAE-SepharoseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化 鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS。雜蛋白去除可達99%以上，純 化后的VLP原液為疫苗原液。實施例7. PRRS VLP疫苗原液的檢定PRRS VLP原液的外觀為澄清液體；pH值為7. 0-7. 2 ；通過血平板進行雜菌鑒定結(jié) 果為陰性；通過半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進行支原體鑒定結(jié)果為陰性；通過PAGE-SDS電泳 檢測結(jié)果顯示目的條帶清晰、無其他雜帶；采用Reed&Muench法計算抗血清中和效價均高 于 1 2800。 實施例8. PRRS VLP疫苗劑型配制①注射劑型配制將純化PRRS VLP不加佐劑，配制10ug/0. 5ml的低劑量、 20ug/l. Oml高劑量的無佐劑注射劑型；將純化PRRS VLP蛋白加入氫氧化鋁或磷酸鋁配置 7. 5ug (蛋白)/0. 5mg (鋁鹽)/0. 5ml、15 μ g (蛋白)/1. Omg (鋁鹽)/0. 5ml有佐劑疫苗劑型； 將純化PRRS VLP蛋白加入納米鋁佐劑，分別配制5. Oug/O. 5ml低劑量、10ug/l. Oml高劑量
的有佐劑注射豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗劑型。以上注射疫苗溶液裝入吸頂瓶， 放2-8 °C備用。②噴鼻劑型配制將純化PRRS VLP不加佐劑吸附，配制7.2ml低劑量、 15 μ g/0. 2ml高劑量的無佐劑噴鼻疫苗劑型；將純化PRRS VLP加入等體積季胺化殼聚糖 水凝膠黏膜佐劑與傳遞系統(tǒng)，配制5. O μ g/0. 2mlU0yg/0. 2ml有佐劑噴鼻疫苗劑型；將純化PRRS VLP蛋白加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠與10 μ grLT黏膜佐劑及傳遞系統(tǒng)，配制 4. 0μ g/Ο. 2πι1、8μ g/0. 2ml有佐劑噴鼻豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗劑型。以上噴 鼻疫苗溶液裝入定量噴鼻裝置，放2-8°C備用。 ③飲水劑型配制將純化PRRS VLP 10 μ g、20 μ g分別加入5%蔗糖、0. 2%維生 素C、0. 谷維素和0. 脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7. 2，噴霧干燥，配制IOyg/劑 低劑量、20 μ g/劑高劑量的無佐劑舌下含片劑型；將純化PRRS VLP蛋白7.5yg、15yg與 15 μ grLT分別加入5%蔗糖、0.2%維生素C、0. 谷維素和0. 1 %脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖 液調(diào)PH7. 2，噴霧干燥，配制7. 5 μ g/劑低劑量、15 μ g/劑高劑量的有佐劑豬繁殖與呼吸綜 合癥病毒樣顆粒疫苗飲水劑型；以上以上飲水疫苗裝入密封塑料袋內(nèi)，放2-8°C備用。
權(quán)利要求
1.一種PRRS VLP疫苗，其特征在于該疫苗含有豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M、N、GP5三 種結(jié)構(gòu)蛋白組成的VLP。
2.如權(quán)利要求1所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下核酸序列①PRRSV M蛋白的核酸序列；②PRRSV N蛋白的核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的核酸 序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括來自來自PRRSV CH-la、BJ-4、HB-l (SH)、HB-2 (SH)、 Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXAl、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06 亞型的 PRRSV CH-la/GP5, PRRSV BJ-4/GP5, PRRSVHB-1 (SH)/GP5, PRRSV HB-2 (SH)/GP5, PRRSV Em2007/ GP5、PRRSVNB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5.PRRSVHUN4/ GP5,PRRSV SY0608/GP5,PRRSV JXwn06/GP5, PRRSV Bjsy06/GP5, PRRSV NX06/GP5o
3.如權(quán)利要求1所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下氨基酸序列 ①PRRSV M蛋白的氨基酸序列 ’②PRRSV N蛋白的氨基酸序列；③PRRSVGP5蛋白的氨基酸 序列；其中，所述GP5蛋白核酸序列包括來自來自PRRSVCH-la、BJ-4、HB-I (SH)、HB-2 (SH)、 Em2007、NB-04、BJ0706、JX143、JXAl、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06 亞型的 PRRSV CH-la/GP5、PRRSVBJ-4/GP5、PRRSV HB-1 (SH)/GP5、PRRSV HB-2 (SH)/GP5、PRRSVEm2007/ GP5、PRRSV NB-04/GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSV HUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSVJXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗含有豬繁殖與呼吸 綜合癥病毒樣顆粒(PRRS VLP)，并攜帶有以下表面蛋白①PRRSV的GP5蛋白；其中，所述 PRRSV GP5 蛋白包括來自來自 PRRSV CH-la, BJ-4、HB-1 (SH)、HB-2 (SH)、Em2007、NB-04, BJ0706、JX143、JXA1、HUN4、SY0608、JXwn06、Bjsy06、NX06 亞型的 PRRSV CH_la/GP5、PRRSV BJ-4/GP5、PRRSVHB-1 (SH) /GP5, PRRSV HB-2 (SH)/GP5、PRRSV Em2007/GP5、PRRSVNB-04/ GP5、PRRSV BJ0706/GP5、PRRSV JX143/GP5、PRRSV JXA1/GP5、PRRSVHUN4/GP5、PRRSV SY0608/GP5、PRRSV JXwn06/GP5、PRRSV Bjsy06/GP5、PRRSV NX06/GP5。
5.如權(quán)利要求1-3任一述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗包含一個攜帶有PRRSV 主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞；其中，所述真 核表達載體選自①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述雞 成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動物細(xì)胞 選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞； ⑦MDCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于其中所述的pHWD2000載體是由 PHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體上游的pCMV啟動子，并用雞β -actin蛋白 啟動子替換，同時在雞β -actin蛋白啟動字上游插入hCMV-IE增強子，改造后的pCWD2000 可以在真核系統(tǒng)中高效表達外源基因，同時PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的 外源基因片段。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗不含有佐劑， 或含有如下佐劑中的一種或幾種①鋁鹽氫氧化鋁或磷酸鋁；②新型納米鋁佐劑； ③ P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R]-c ysteinyl-[S] -seryl-[S] - (Iysyl) 3-lysine)；④水凝膠佐劑季胺化的殼聚糖、⑤ rLT 重 組不耐熱性腸毒素。
8.如權(quán)利要求1-6任一所述的PRRSVLP疫苗，其特征在于該疫苗制成多種臨床適用的 劑型注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型。
9.如權(quán)利要求1-6任一所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下 步驟①構(gòu)建PHWD2000真核表達載體；②含有編碼PRRSV M蛋白核酸序列的重組真核表達載 體；③含有編碼PRRSV N蛋白的核酸序列的重組真核表達載體；④含有編碼重組PRRSV GP5 蛋白的核酸序列的重組真核表達載體；⑤提供一種用于表達的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放 PRRS VLP;⑥提供用于純化PRRS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析 純化方法。
10.如權(quán)利要求9所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中構(gòu)建重組表達 載體的方法包括如下步驟將編碼PRRSV M蛋白、N蛋白、GP5蛋白的DNA片斷被插入到 PHWD2000 載體中，構(gòu)成重組 pHWD2000-M、pHWD2000-N、pHWD2000-GP5 表達載體。
11.如權(quán)利要求9所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的表達宿主 細(xì)胞系中所指細(xì)胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/DF-1細(xì) 胞 ’②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；哺乳動物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì)胞；③COS細(xì) 胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦MDCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞； ⑩SF9 Cell細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求9所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)方法包 括如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為2-100 μ g/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚糖為 硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
13.如權(quán)利要求9所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的純 化方法包括如下步驟蔗糖梯度離心法，蔗糖濃度為1. 19g/mL ；或柱層析純化方法，用 Sepharose6FFTM分子篩并進行DEAE-S印haroseFFTM離子交換。
14.如權(quán)利要求13所述的PRRSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的蔗糖梯 度離心的步驟為①收集規(guī)?；a(chǎn)的PRRS VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去 除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用HNE buffer懸浮，HNE buffer的 組成為25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ；③將懸液進行蔗糖梯度離心，蔗 糖采用HNE buffer配制，體系采用0. 3g/mL蔗糖3mL ；0. 45g/mL蔗糖3mL ；1. 19g/mL蔗糖 ImL ；40C IOOOOOg離心池；④收集中間層，并用折射儀測量密度；⑤用pH6. 5-7. 5的PBS平 衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；雜蛋白去除可達95% 以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介質(zhì)進行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有 0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS ；雜蛋白去除可 達99%以上，純化后的VLP原液為疫苗原液。
全文摘要
一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗及其制備方法，涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明目的在于公開一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒樣顆粒疫苗(PRRS VLP疫苗)，本發(fā)明目的還在于公開該疫苗的制備方法。本發(fā)明PRRS VLP疫苗含有豬繁殖與呼吸病毒M、N、GP5三種結(jié)構(gòu)蛋白組成的VLP，可以激發(fā)良好雙重的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。藥效實驗表明，經(jīng)此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐劑，制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型免疫接種不同動物群體后，可安全、有效預(yù)防PRRSV感染，為不同種群母豬、小豬、育肥豬安全、有效免疫防控PRRSV感染提供了理想疫苗。
文檔編號A61K39/295GK102107004SQ20111000081
公開日2011年6月29日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者呂鳳林, 曹政, 楊力, 田菲菲 申請人:重慶大學(xué)