專利名稱：：用于靜脈采集和自體移植的改進的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般地涉及如下領域自體靜脈、靜脈移植、靜脈保存、組織保存、內(nèi)膜增生、血管痙攣、藥物、設備以及血管生物學。本發(fā)明在來自國立衛(wèi)生研究院的資助No.2R01HL070715的政府支持下進行。政府擁有本發(fā)明的某些權利。
背景技術：
：·人大隱靜脈(HSV)仍然是用于冠狀和外周動脈旁路移植的最常用管道。HSV通常用直接手術暴露或者內(nèi)窺鏡靜脈采集從腿采集。將分支結(jié)扎并且將靜脈取出，并在植入之前置于“后臺(backtable)”。多數(shù)外科醫(yī)生將HSV在室溫下置于肝素化鹽溶液中。在遠端對靜脈進行插管并且用肝素化鹽溶液人工擴張(用注射器)。這允許對在采集過程中遺漏的分支進行鑒別和結(jié)扎。這種人工擴張引起靜脈損傷。靜脈還可用外科皮膚標記物進行標記，從而在植入期間優(yōu)化其取向。在全世界每年進行的超過I百萬例冠狀旁路手術中，10%至15%的冠狀靜脈移植物發(fā)生早期血栓性阻塞；還有10%至15%在之后的I年至5年由于內(nèi)膜增生而發(fā)生阻塞，再有30%至40%在隨后的5年至7年中由于內(nèi)膜增生與進行性動脈粥樣硬化的疊加而發(fā)生阻塞。12年后少于一半的靜脈移植物仍有效(Motwani&Topol，1998)。靜脈移植物阻塞弓I起心肌梗塞、肢體喪失以及死亡。動脈旁路移植失敗的首要原因是內(nèi)膜增生(Clowes&Reidy,1991)盡管血管介入近來有許多技術發(fā)展，但是內(nèi)膜增生仍然是昂貴的、與疾病相關的并且未解決的問題。內(nèi)膜增生由一連串事件介導，包括血管平滑肌增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化以及細胞外基質(zhì)產(chǎn)生(Allaire&Clowes,1997;Mosse等人，1985)。該過程引起血管腔的病理性變窄、移植物狹窄，并最終引起移植物衰竭(LoGerfo等人，1983)。測試其抑制內(nèi)膜增生之能力的許多藥物在臨床試驗中都失敗了。抗血栓劑和抗血小板劑(如華法林(warfarin)、氯卩比格雷(clopidogrel)和阿司匹林(aspirin))對內(nèi)膜增生沒有或幾乎沒有作用(Kent&Liu,2004)0藥物洗出式支架在預防冠狀動脈血管成形術之后的再狹窄中已表現(xiàn)出有效；但是，還沒有治療被批準用于自體管道。使用E2F誘餌(與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而隔離這些蛋白質(zhì)的DNA短序列)預防平滑肌增殖的以預防冠狀和外周血管靜脈移植物衰竭的兩個大型臨床試驗的最初目的失敗了。來自這些大型臨床試驗的數(shù)據(jù)指出，簡單地限制增殖應答不足以預防內(nèi)膜增生(Mann等人,1999;Alexander等人,2005)。因此，對于成功預防靜脈移植的失敗而言，需要靶向的是增殖以外的其他機制。采集期間對靜脈移植物的損傷引起血管痙攣和內(nèi)膜增生，其導致移植物阻塞。因此，鑒定出防止在采集期間對移植物的損傷以及后續(xù)內(nèi)膜增生的新的外科方法和治療劑將是非常有益的。
發(fā)明內(nèi)容因此，根據(jù)本發(fā)明，提供在移植之前處理靜脈外植體的方法，其包括(a)提供靜脈外植體；(b)將所述靜脈外植體在包含P2X7受體拮抗劑的pH7.O至pH7.6的緩沖溶液中進行穩(wěn)定化，以產(chǎn)生穩(wěn)定化靜脈外植體；以及(c)保持所述穩(wěn)定化靜脈外植體的功能活力。所述方法還可恢復在步驟(b)之前無活力的靜脈外植體的功能活力。本文將平滑肌的功能活力(functionalviability)定義為應答于去極化或激動劑而收縮的能力。對內(nèi)皮細胞而言，活力定義為預收縮的血管應答于乙酰膽堿而舒張的能力。另外，所述緩沖溶液可進一步包含肝素。所述P2X7受體拮抗劑可以是羊毛S紅/藍染料#1(erioglaucine/BlueDye#l)或亮藍G(brilliantblueG),或者它們的組合。所述緩沖溶液還可進一步包含磷酸鹽緩沖液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸鹽或勃脈力(Plasmalyte)。所述pH可以是7.35至7.45,或者7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5或7.6?！ち硗?，所述緩沖溶液可進一步包含硫酸鎂或漢克斯(Hanks’)平衡鹽溶液。另外，所述緩沖溶液可進一步包含以下一種或更多種抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑(colloidagent)、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑(endothelialfunctionpreservative)、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白27(HSP27)抑制劑、HSP20調(diào)節(jié)劑和/或MAPKAP激酶2抑制劑。進一步，所述抗收縮劑可以是以下至少一種磷酸二酯酶抑制劑(例如，S粟堿(papaverine)、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、烏地那非(udenafil)、阿伐那非西絡他唑(avanafilcilistizol)、己酮可可堿(pentoxifylline)、雙卩密達莫(dipyridamole),或其組合)、|丐通道阻斷劑(例如，氨氯地平(amlodipine)、阿雷地平(aranidipine)、阿折地平(azelnidipine)、巴尼地平(barnidipine)、西尼地平(cilnidipine)、氯維地平(clevidipine)、依福地平(efonidipine)、非洛地平(felodipine)、拉西地平(Iacidipine)、樂卡地平(Iercanidipine)、馬尼地平(mandipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(netrendipine)、普拉地平(prandipine),或其組合)、一氧化氮供體(例如，硝普鈉(sodiumnitroprusside)、硝酸甘油(nitroglycerin),或其組合)或者環(huán)核苷酸類似物(雙丁酰cAMP(dibutyrylcAMP)、雙丁酰cGMP(dibutyrylcGMP)或其組合)，或其組合。進一步，所述抗氧化劑可以是例如N-乙酰半胱氨酸、別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗壞血酸、生育酹、生育三烯酹(tocotrienol)或綠茶酹或其組合。進一步,所述寡糖可以是例如乳糖酸(lactobionicacid)、棉子糖或海藻糖或其組合。進一步，所述膠體劑可以是例如羥乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白或其組合。進一步，所述抗炎劑可以是例如皮質(zhì)甾類(例如，地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)或其組合)或者非甾類抗炎劑(例如，阿司匹林、布洛芬(ibuprophen)、萘普生水楊酸(naproxensalicylicacid)或其組合)、MAPKAP激酶2抑制劑、抗-TNF-α、抗-IL-I-β、Cox-2抑制劑，或其組合。另外，所述內(nèi)皮功能保存劑可以是例如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(例如，依那普利(enalapril)、雷米普利(ramipril)、喹那普利(quinapril)、培哚普利(perindopril)、賴諾普利(Iisinopril)、內(nèi)那普利(benazepril)、福辛普利(monopril)或其組合)、血管緊張素受體抑制劑(例如氯沙坦(Iosartan))、抑制素(statin)(例如阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fIuvastatin)、洛伐他汀(Iovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)或其組合)、二甲雙狐(metformin)、氨基咪唑氨甲酸核糖核苷酸(aminoimidazolecarboxamideribonucleotide,AICAR)或雌激素(例如，雌三醇(estriol)、雌二醇(estradiol)、雌酮(estrone)>17β-雌二醇或其組合)。另外，所述代謝調(diào)節(jié)劑可以是例如葡萄糖、腺苷胰淀素(adenosineamylin)、降隹丐素相關基因肽(calcitoninrelatedgenepeptide)、胰島素,或其組合。另外，所述水凝膠可包括例如天然多糖如藻酸鹽(alginate)、葡聚糖、殼聚糖和糖胺聚糖；或親水性聚合物如聚乙二醇、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚羥基丁酸或聚(η-異丙基丙烯酰胺)。進一步，所述HSP27抑制劑可以是例如抑制HSP27表達的siRNA或miRNA，增強HSP20表達的抗-miRNA，或其組合。另外，所述MAPKAP激酶2抑制劑可以是例如肽抑制劑。所述外植體可用不基于醇的標記物進行標記，例如但不限于羊毛罌紅/藍染料#1、靛藍(indigotine)、誘惑紅AC(AlluraRedAC)或亮藍G。所述方法可進一步包括沖洗所述靜脈外植體的管腔以使內(nèi)部沖洗壓不超過200_Hg,或不超過150mmHg。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供靜脈移植試劑盒，其包含(a)含有P2X7受體拮抗劑的組織標記筆；以及(b)生理緩沖溶液或用于制備它的試劑。另外，所述試劑盒可進一步包含適于浸浴靜脈外植體的容器。另外，所述試劑盒可進一步包含以下中的一種或更多種肝素、抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白抑制劑、硫酸鎂和/或MAPKAP激酶2抑制劑。所述緩沖溶液可包含例如磷酸鹽緩沖液、M0PS、!fepeS、PipeS、醋酸鹽或勃脈力。所述緩沖溶液可以是PH7.O至pH7.6，或者pH7.35至pH7.45。所述P2X7受體拮抗劑可以包含例如羊毛罌紅/藍染料#1、誘惑紅AC、亮藍G，或其任何組合。所述試劑盒可進一步包含用于沖洗所述靜脈外植體的管腔的設備；所述設備設計成防止所述靜脈外植體內(nèi)部的沖洗壓大于200_Hg,或大于150_Hg。所述設備可包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪毫Π踩y(pop-offvalve)。另外，所述注射器或?qū)Ч芸砂訌棤罴舛耍鲎訌棤罴舛税糜谝胨鲮o脈外植體近端的管腔。另外，所述試劑盒還進一步包含設計成把持所述靜脈外植體的夾具。本發(fā)明還提供用于沖洗所述靜脈外植體管腔的設備；所述設備設計成防止所述靜脈外植體內(nèi)部的沖洗壓大于200_Hg,或大于150_Hg。所述設備可包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪毫Π踩y。所述注射器或?qū)Ч芸砂訌棤罴舛?，所述子彈狀尖端包含用于引入所述靜脈外植體遠端的管腔。此外，所述設備還可包含用于弓I入所述靜脈外植體近端的無管腔的子彈狀塞。另外，所述設備還可包含設計成把持所述靜脈外植體的夾具。另一個實施方案包含pH7.O至pH7.6的緩沖溶液，其中所述緩沖溶液進一步包含肝素和P2X7受體拮抗劑。所述P2X7受體拮抗劑可以是例如羊毛罌紅/藍染料#1或亮藍G或其組合。另外，所述緩沖溶液可進一步包含肝素，連同羊毛罌紅/藍染料#1、亮藍G中一種或更多種，或其兩者。進一步，所述緩沖溶液可包含磷酸鹽緩沖液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸鹽或勃脈力。進一步，所述PH可以是7.35至7.45，或者7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5或7.6。另外，所述緩沖溶液可進一步包含硫酸鎂或漢克斯平衡鹽溶液。另外，所述緩沖溶液可進一步包含以下一種或更多種抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白27(HSP27)抑制劑、·HSP20調(diào)節(jié)劑、MAPKAP激酶2抑制劑，和/或其組合。進一步，所述抗收縮劑可以是磷酸二酯酶抑制劑(例如，罌粟堿、西地那非、他達拉非、伐地那非、烏地那非、阿伐那非西絡他唑、己酮可可堿、雙嘧達莫，或其組合)、鈣通道阻斷劑(例如，氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、西尼地平、氯維地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、樂卡地平、馬尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平)、一氧化氮供體(例如，硝普鈉、硝酸甘油，或其組合)或者環(huán)核苷酸類似物(例如，雙丁酰cAMP、雙丁酰cGMP，或其組合)。進一步，所述抗氧化劑可以是例如N-乙酰半胱氨酸、別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗壞血酸、生育酚、生育三烯酚或綠茶酚，或其組合。所述寡糖可以是例如乳糖酸、棉子糖、海藻糖，或其組合。所述膠體劑可以是例如羥乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白，或其組合。所述抗炎劑可以是例如皮質(zhì)甾類(例如，地塞米松、氫化可的松、可的松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍，或其組合)、非留類抗炎劑(例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生水楊酸，或其組合)、MAPKAP激酶2抑制劑、抗-TNF-α、抗-IL-I-β、Cox-2抑制劑，或其組合。此外，所述內(nèi)皮功能保存劑可以是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(例如，依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、賴諾普利、內(nèi)那普利、福辛普利，或其組合)、血管緊張素受體抑制劑(例如，氯沙坦)、抑制素(例如，阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素伐他汀、辛伐他汀，或其組合)、二甲雙胍、雌激素(例如，雌三醇、雌二醇、雌酮、17β-雌二醇，或其組合)，或其組合。進一步，所述代謝調(diào)節(jié)劑可以是例如葡萄糖、腺苷胰淀素、降鈣素相關基因肽、胰島素，或其組合。另外，所述水凝膠可以包含天然多糖如藻酸鹽、葡聚糖、殼聚糖和糖胺聚糖；或親水性聚合物，如聚乙二醇、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚羥基丁酸或聚(η-異丙基丙烯酰胺)。進一步，所述HSP27抑制劑可以是，例如抑制HSP27表達的siRNA或miRNA，增強HSP20表達的抗-miRNA，或其組合。所述MAPKAP激酶2抑制劑可以是，例如肽抑制劑。因此，本發(fā)明組合物具有廣泛的用途，其包括通過提供無菌醫(yī)療設備以及表面殺菌和去污染(decontamination)而在保健中的用途。以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，其用于進一步展示本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或更多幅并與本文所述具體實施方案相結(jié)合，可以更好地理解本發(fā)明。圖I示出人隱靜脈中可變的平滑肌功能活力。圖2A至B示出現(xiàn)有外科采集技術引起平滑肌功能活力的降低?！D3顯示現(xiàn)有外科采集技術引起內(nèi)皮功能活力的降低。圖4A至B示出現(xiàn)有外科采集技術降低了人隱靜脈的內(nèi)皮非依賴性舒張。圖5顯示，具有藍色標記的人隱靜脈移植物顯示出平滑肌功能活力的降低。圖6顯示，外科皮膚標記降低了人隱靜脈平滑肌活力。圖7示出，外科皮膚標記筆降低了豬隱靜脈的活力。圖8示出，人隱靜脈中功能性應答(對KCl有收縮應答)與細胞活力具有相關性。圖9A至B顯示，在豬隱靜脈中，羊毛罌紅在拉伸性損傷后恢復了功能活力。圖10示出在豬的隱靜脈中誘惑紅沒有恢復拉伸誘導的損傷。圖11證明在人隱靜脈中羊毛罌紅恢復了平滑肌活力。圖12A至C示出在隱靜脈中羊毛罌紅阻斷了BzATP誘導的收縮。圖13證明羊毛罌紅降低了器官培養(yǎng)模型中的人隱靜脈中的內(nèi)膜厚度。圖14示出在擴張的豬隱靜脈中羊毛罌紅降低了內(nèi)膜層增厚。圖15顯示，外科手術準備過程中的操作損害了人隱靜脈的內(nèi)皮依賴性舒張。圖16示出壓力釋放(壓力安全)閥限制了人工擴張期間人隱靜脈中的壓力。圖17示出用壓力釋放閥進行的人工擴張防止了豬隱靜脈中內(nèi)皮功能的喪失。圖18A至B示出，用罌粟堿進行的預孵育抑制了豬冠狀動脈中組胺和KCl誘導的舒張。圖19A至B示出，用罌粟堿進行的預孵育抑制了人隱靜脈中去甲腎上腺素誘導的舒張。圖20示出靜脈采集設備試劑盒。具體實施例方式因此，本發(fā)明提供用于采集、處理、保存以及移植自體管道并抑制內(nèi)膜增生的新方法和試劑。用于在植入前保存自體靜脈管道的溶液(包括肝素化鹽溶液)的PH是高酸性的(pH6.2)。這種酸性pH已顯示降低所述管道的功能。另外，用于標記所述自體管道的包含異丙醇的外科皮膚標記物的使用也降低所述管道的功能。羊毛罌紅(也被稱為FD&C藍染料#1)對靜脈無毒并且在損傷后恢復功能完整性。還顯示常見的靜脈人工擴張能導致管腔內(nèi)壓大于300mmHg，這對管道功能也具有有害的效果。將壓力安全閥置于注射器上，這將可能的最高管腔內(nèi)壓降低到130mmHg至140mmHg，從而保護所述靜脈管道。I.采集溶液在一個方面中，本發(fā)明提供pH7.O至pH7.6的緩沖溶液，用于在采集后放置靜脈。在一個實施方案中，所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液；但是，MOPS、Hepes,Pipes和醋酸鹽也是備選的制劑。還可將硫酸鎂(5mM)加入所述溶液以穩(wěn)定膜。另一個緩沖液選擇是勃脈力(Plasma-Lyte)56注射液(多電解質(zhì)注射液，I型，USP)，這是一種用于靜脈施用的單劑量容器中的無菌、無熱原的低滲溶液。每IOOmL包含234mg氯化鈉，USP(NaCl)；128mg醋酸鉀，USP(C2H3KO2)；以及32mg四水醋酸鎂(Mg(C2H3O2)2·4H20)。其不包含抗微生物劑。pH用鹽酸調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的另一個方面中，所述采集溶液能夠作為高粘度溶液制備，如Seal&Panitch(2003)中所述。這些作者描述了，基于肝素結(jié)合肽與肝素之間的相互作用而開發(fā)了具有基于親和性的控制釋放特性的快速形成的聚合物基質(zhì)。由聚乙二醇-Co-肽(約18,000g/mol)和肝素(約18，000g/mol)以3:I摩爾比組成的10%(w/v)組合物的動態(tài)機械測試顯示出與濃縮的大分子量聚合物溶液和熔體(melt)相似的粘彈性譜。另外，所述生物聚合物混合物在熱變性和機械損傷后迅速恢復。這些凝膠樣材料能夠隔離外源性肝素結(jié)合肽并且能夠以依賴于相對肝素親和力的速率在數(shù)天中釋放這些肽。最初的釋放速率為每小時3.3%(對于具有低肝素親和力的肽)到每小時0.025%(對具有強肝素親和力的肽)。通過改變肽對肝素的親和力，能夠開發(fā)一系列的肽以獲得可用于在體內(nèi)可控遞送治療劑的一系列釋放譜。II.補充性溶液添加劑在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明的溶液可包含另外的添加劑以解決本發(fā)明要保護的各個方面。例如，本發(fā)明的溶液可包含肝素(lU/ml至10U/ml)以預防血栓形成。肝素是廣泛用作可注射抗凝劑的高度硫酸化的糖胺聚糖，并且具有任何已知生物分子中最高的負電荷密度。其還可用于在各種實驗和醫(yī)療設備上(如試管和腎透析機)形成內(nèi)部抗凝劑表面。藥物級的肝素源自屠宰的肉用動物的粘膜組織(如豬的腸或牛的肺)。盡管在醫(yī)學中主要用于抗凝，但肝素在體內(nèi)真正的生理作用仍然不清楚，因為血液抗凝主要通過內(nèi)皮細胞衍生的硫酸類肝素蛋白多糖來實現(xiàn)。肝素通常貯存于肥大細胞的分泌顆粒中并且僅釋放到組織損傷部位的血管。有人提出肝素的主要目的是在組織損傷部位對抗入侵的細菌和其它異物的防御機制，而不是抗凝。另外，其保留在許多極為不同的物種中，包括沒有相似的血液凝固系統(tǒng)的一些無脊椎動物。天然肝素是分子量從3kDa至50kDa的聚合物，但是大多數(shù)市售肝素制品的平均分子量為12kDa至15kDa。肝素是碳水化合物(定義為具有經(jīng)驗式Cm(H20)n的有機化合物；也就是說只由碳、氫和氧組成，并且氫氧的原子比為2I)的糖胺聚糖家族的成員。糖胺聚糖(GAG)或粘多糖是長非支鏈多糖，由重復的二糖單元組成。所述重復的單元由與氨基己糖(包含氮的六碳糖)相連的己糖(六碳糖)或己糖醛酸組成。肝素(包括密切相關的分子硫酸類肝素)由不同硫酸化程度的重復二糖單元組成。肝素中主要的二糖單元如下。最常見的二糖單元包含2-0-硫酸艾杜糖醛酸和6-0-硫酸化的N-硫酸葡萄糖胺，IdoA(2S)-GlcNS(6S)。例如，這構(gòu)成了牛肺中肝素的85%以及豬腸粘膜中肝素的約75%。下文沒有示出包含3-0硫酸葡萄糖胺(GlcNS(3S，6S))或游離氨基(GlcNH3+)的罕見的二糖。在生理條件下，所述酯和酰胺硫酸基團去質(zhì)子化并吸引帶正電荷的反離子以形成肝素鹽。肝素通常以這種形式作為抗凝劑施用。在另一個方面中，所述采集溶液可以是覆蓋所述血管以使體積最小化而同時保持所述血管濕潤的水凝膠。另外，所述水凝膠可包含治療劑以幫助維持血管舒張。水凝膠包括合成自通過共價鍵交聯(lián)的親水性聚合物的那些，如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚富馬酸、聚(N-異丙基丙烯酰胺)等，或者是通過物理相互作用(包括疏水的和離子的)而交聯(lián)的任何凝膠樣材料。凝膠包括聚氨酯、瓊脂糖和藻酸鹽。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括罌粟堿(ImM)以抑制靜脈的收縮和痙攣。其他的抗痙攣劑是尼卡地平、硝普鈉、硝酸甘油(O.5mM至I.OmM)或雙丁酰cAMP(2mM)。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括抗氧化劑以預防所述靜脈的氧化性損傷。N-乙酰半胱氨酸(IOmM)、別嘌呤醇(ImM)、谷胱甘肽(3mM)、甘露醇(3OmM至6OmM)或綠茶酹(O.5mg/ml至I.Omg/ml)是具體的目標抗氧化劑。在另一個方面中，本發(fā)明在所述采集溶液中提供寡糖以防止所述移植物干燥。乳糖酸(IOOmM)、棉子糖(30mM)或海藻糖(30mM)是具體的寡糖。乳糖酸是二糖，其提供滲透性支持并防止細胞腫脹。棉子糖是三糖，其提供高滲性。海藻糖是具有保水特性的二糖。在另一個方面中，本發(fā)明在所述采集溶液中提供淀粉以支持膠體滲透壓。羥乙基淀粉(30mM至50mM)、葡聚糖(40g/l)、血液或白蛋白是具體考慮的膠體劑。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括抗炎劑。類固醇如地塞米松(5mg/l至IOmg/1)或水楊酸是抗炎劑的例子。在本發(fā)明的另一個方面中，將包括藥物以預防內(nèi)皮功能障礙。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、抑制素、二甲雙胍、AICAR和雌激素是這類藥物的例子。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括代謝調(diào)節(jié)劑。葡萄糖(200mM)、腺苷(5mM)和膜島素(100U/ml)是具體考慮的代謝調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括新的MAPKAP激酶2(和相關肽)肽抑制劑以降低炎癥、增強平滑肌舒張并且預防痙攣。PCT申請US2007/16246和US2008/72525描述了這種抑制劑，其通過引用并入本文中。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括SiRNA或miRNA以降低HSP27的表達從而預防內(nèi)膜增生。有義鏈siRNA序列是Dgaccaaggauggcgugguguu(seqidno:i)和2)AUACACGCUGCCCCCCGGUUU(SEQIDNO2)。有義鏈miRNA序列是l)miR_580或miR-1300，AACUCUUACUACUUAGUAAUCC(SEQIDNO3)和2)miR_552，UUGUCCACUGACCAAUCUGUU(SEQIDNO4)?？筸iR-320序列是UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU。所述siRNA和miRNA的表達是基于質(zhì)?；蚝铣?。所述DNA或合成的寡聚雙螺旋的遞送可通過可逆透化或加壓而進行(Monahan等人，2009)。ΙΙΙ·Ρ2Χ7受體拮抗劑損傷引起能夠活化ATP受體的ATP的延長釋放(Khakh&North,2006)。P2X受體是與細胞外ATP結(jié)合的配體門控離子通道家族。P2X7受體負責巨噬細胞的ATP依賴性裂解，并且也發(fā)現(xiàn)于人隱靜脈平滑肌(Cario-Toumaniantz等人，1998)。P2X7受體的活化能夠在人隱靜脈中形成能透過大分子的膜孔(Cario-Toumaniantz等人,1998)。這引起能夠活化胱天蛋白酶(caspases)并且最終由于自身溶解和凋亡而引起細胞死亡的細胞內(nèi)Ca2+的增加(DonnelIy-Roberts等人，2004)。P2X7受體的活化與p38MAPK途徑的活化以及肌動蛋白細胞骨架的改變相關(Pfeiffer等人，2004)。P2X7受體的活化還引起促進炎性應答的白細胞介素和其它細胞因子的產(chǎn)生和釋放(Donnelly-Roberts等人,2004)。近來，已顯示P2X7受體拮抗劑的全身性施用在拉伸誘導脊椎損傷的嚙齒動物模型中改善了恢復(Peng等人，2009)。多種P2X7受體拮抗劑在文獻中已有描述。例如，Alcaraz等人(2003)描述了一系列有效的P2X7受體拮抗劑的合成和藥理學評價。所述化合物在THP-I細胞中抑制BzATP介導的孔形成。？2&受體在炎性細胞(最尤其是巨噬細胞、肥大細胞和淋巴細胞)中的分布提示，P2X7拮抗劑在炎性疾病的治療中具有顯著的作用。Cairoll等人(2009)綜述了不同化學類別的強效且高選擇性的P2X7受體拮抗劑。通過引用合并到本文中的下述美國專利公開了P2X7受體拮抗劑7，709，469、6，812，226,7,741，493,7,718，693和7，326，792。通過引用合并到本文中的下述的美國專利申請公開了P2X7受體拮抗劑:2010/0292295、2010/0292224、2010/0286390、2010/0210705、2010/016817I、2010/0160389、2010/0160388、2010/0160387、·2010/0160384、2010/0160373、2010/0144829、2010/0144727、2010/0105068、2010/0075968、2010/0056595、2010/0036101、2009/026450I、2009/0215727、2009/0197928、2009/0149524、2009/0005330、2008/0132550、2008/0009541、2007/0122849、2007/0082930、2005/0054013、2005/0026916和2002/0182646。如上述討論的，本發(fā)明的一個方面包括用于標記靜脈的含有無毒染料的標記物。由FDA(E#133)批準的人造食用染料FD&C藍#1(羊毛罌紅)也已顯示出不僅是無毒的，而且對損害隱靜脈的采集技術而言是保護性的，并且是P2X7受體拮抗劑。類似羊毛罌紅的亮藍G也認為是P2X7受體拮抗劑。靛藍(E132)是被FDA批準的另一深藍色人造染料。固綠(FastGreen)(E143)是被FDA批準的另一個藍綠色人造染料。天然染料如姜黃素(curcurmin)或甜菜苷(betanin)是另外的備選方案。姜黃素是姜黃這種香料中的主要類姜黃色素(curcuminoid)，具有抗氧化和抗炎的特性。作為食品添加劑，其E編號是E100。甜菜苷是得自甜菜的紅色糖苷類食用染料，并且是天然食用染料。其它可能的染料包括染料木素藍(genesteinblue)、伊文思藍(evansblue)、印度墨(indiaink)、誘惑紅AC、酒石黃(Tartazine)和赤蘚紅(Erythrosine)。IV.設備下述討論的初步研究證明，目前使用的采集技術對隱靜脈有害。這些數(shù)據(jù)提出關于靜脈移植物衰竭的新思考模式，并且提供簡單直接的方法來緩解靜脈移植物的損傷。因此，在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括“壓力安全”閥以防止靜脈在分支結(jié)扎過程中過度擴張?？莆骷{(Qosina)壓力釋放T閥(部件號D002501)是一個例子。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明包括用于緊固靜脈的“子彈形尖端”的針狀物以及用于防止靜脈拉伸的設備。V.試劑盒本發(fā)明的實施方案還可體現(xiàn)為與外科靜脈移植方法結(jié)合使用的試劑盒。免疫檢測試劑盒將在合適的容納設備中包含各種容器、設備和/或試劑，并連同適當?shù)氖褂谜f明書。在某些實施方案中，所述試劑盒將包含采集溶液，或用于制備它的試劑。所述溶液或試劑將以無菌形式提供，任選地與用于混合并保存采集溶液的無菌容器一起提供。所述試劑盒還可有利地包含室，其用于在外植后以及移植前浸浴/保存移植組織。所述試劑盒還可包括上述各種其它補充性添加劑。如上所述，所述試劑盒的另一個要素可以是包含上述無毒染料/標記物的外科記號筆。所述筆可用標記物/染料“預先填裝”，或者可以空的形式提供，由用戶將以溶液或試劑形式的標記物/染料填裝到所述筆中。另外，試劑盒包括設備，包括上述注射器、導管和/或者裝有或包含壓力安全閥的管。包括的設備還可以是用于固定把持靜脈的設備，如夾具，任選地具有支架或基座，允許“不沾手”地定位所述植入物用于進一步處理。所述試劑盒的容器方面將通常包括用于以安全和保護性的方式存放至少一個瓶、試管、燒瓶、瓶子、包、注射器、導管或其它容器的裝置，例如緊密包裝用于銷售。這樣的裝置可包括其中裝有期望的容器、設備或試劑的注塑或吹塑的塑料容器?！I.實施例包括下述實施例以展示本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。本領域技術人員會認識到，以下實施例中所公開的技術代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明實踐中很好地發(fā)揮功能的技術，因此可認為是構(gòu)成其實踐的優(yōu)選模式。但是，根據(jù)本文公開內(nèi)容，本領域技術人員會認識至IJ，可在公開的具體實施方案中做出許多改變，而仍然得到不脫離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的相同或相似的結(jié)果。實施例I—外科標記筆對靜脈組織的毒性在由范德堡大學機構(gòu)審查委員會(InstitutionalReviewBoardoftheVanderbiltUniversity)(Nashville,TN)批準的知情同意后，從進行冠狀動脈旁路術或外周血管旁路手術的患者中收集人隱靜脈的無標記的丟棄區(qū)段(η=66)。將靜脈貯存于鹽溶液中直到外科手術結(jié)束，這時將其置于冷的移植物采集緩沖液中(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，PH7.4)并貯存于4V。在采集24小時內(nèi)測試血管。對每個HSV評價藍色標記的存在情況。從分離的無脂肪和結(jié)締組織的的隱靜脈部分切下I.Omm寬的環(huán)，剝離內(nèi)皮并懸于包含碳酸氫鹽緩沖液(120mMNaCl、4.7mMKCl,1.OmMMgSO4U.OmMNaH2P04、IOmM葡萄糖、1.5mMCaCl2和25禮Na2HCO3,ρΗ7·4)的肌肉槽(musclebath)中，于37°C用95%02/5%CO2充氣。將該環(huán)人工拉伸至4g張力，并維持在獲得的Ig靜止張力并平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)(Powerlabdataacquisitionsystem)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(RadnotiGlassTechnology)(Monrovia,CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。為了確定活力，用IlOmMKCl使環(huán)收縮(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)，并測量產(chǎn)生的力。將力轉(zhuǎn)化為應力([牛頓(N)/m2]=力(g)X0.0987/面積，其中面積等于濕重[mg/長度(以最大長度的mm數(shù))]除以I.055)105N/m2。靜脈的功能活力中存在變異性(圖I)。產(chǎn)生彡O.025X105N/m2應力的靜脈被認為是無活力的(灰色)，產(chǎn)生>0.025XIO5NAi2應力的那些是有活力的(黑色)。所測試靜脈的40%是無活力的。每個點代表不同的患者以及來自該患者的至少三個單獨的環(huán)的集合。在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前(未操作的，UM)以及外科準備之后(操作之后，AM)收集人隱靜脈的區(qū)段(η=8)。所述準備包括對靜脈進行人工擴張，用外科皮膚標記物標記以及將靜脈置于肝素化鹽溶液中。測定對IlOmMKCl(圖2Α)或去氧腎上腺素(10_6Μ，圖2Β)的收縮應答，并將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力(105N/m2)。靜脈準備期間的操作導致對KCl和去氧腎上腺素收縮應答的降低(圖2A至B)。每個點代表不同的患者以及來自每個患者的至少三個單獨的環(huán)的應答的集合。人隱靜脈還用去氧腎上腺素(10_6M)預收縮，然后用卡巴膽堿(carbachol)(5XI(T7M)處理以測定內(nèi)皮依賴性舒張(Furchgott等人，1980)。在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前(未操作的，UM)和外科準備之后(操作后，AM)收集人隱靜脈的區(qū)段(η=5)。將來自每個區(qū)段的環(huán)懸浮于肌肉槽中，用碳酸氫鹽緩沖液平衡并且用IlOmMKCl收縮。用碳酸氫鹽緩沖液中再平衡30分鐘后，將環(huán)用1(Γ6Μ的去氧腎上腺素(PE)收縮并且用5Χ10_7Μ的卡巴膽堿處理。測量力并轉(zhuǎn)化為應力105N/m2。應答表示為最大PE誘導收縮的％。外科準備期間的典型操作引起內(nèi)皮依賴性舒張的降低(圖3)。UM靜脈具有(28.74±3.542)%的內(nèi)皮依賴性舒張，而AM應答于卡巴膽堿而收縮((-5.976±0·9172)%),人隱靜脈還用去氧腎上腺素(10_6M)預收縮，然后用硝普鈉(10_7M)處理以測定內(nèi)皮非依賴性舒張。在采集準備之前(未操作的，UM)或采集準備之后(操作后，AM)收集隱靜脈的區(qū)段(η=6)。將來自每個區(qū)段的環(huán)懸浮于肌肉槽中，在碳酸氫鹽緩沖液中平衡并且用IlOmMKCl收縮。用碳酸氫鹽緩沖液再平衡30分鐘之后，將環(huán)用10_6Μ去氧腎上腺素(PE)預收縮并且用10_7Μ的硝普鈉處理。外科準備期間的典型操作降低了人隱靜脈的內(nèi)皮非依賴性舒張(圖4Α至B)。收集自同一患者的UM和AM區(qū)段應答于PE和SNP的代表性力追蹤(圖4Α)。兩組所顯示的內(nèi)皮非依賴性舒張(表示為最大PE誘導收縮的％)顯著不同。UM靜脈顯示(86.62+/-5.986)%的舒張，而AM靜脈顯示(4.292+/-1.397)%的舒張(圖4B)。在收集自進行冠狀動脈旁路術或外周血管血運重建手術之患者的38個靜脈中，16個靜脈沒有任何可見的外科標記筆顏色，而22個靜脈有可見的顏色。從靜脈上切下環(huán)，懸浮于肌肉槽中并在碳酸氫鹽緩沖液中平衡。將環(huán)用IlOmMKCl收縮并且將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力(105N/m2)。兩組靜脈產(chǎn)生的力顯著不同(圖5)。具有可見藍色標記的靜脈((O.047±0.014)105N/m2)比沒有可見標記的靜脈((O.174+0.023)105N/m2)展現(xiàn)出更低的收縮應答。將沒有任何顏色的人隱靜脈的無標記丟棄部分用于測試不同標記方法的效果。將切自該部分的環(huán)不進行標記(對照；n=12)、用外科皮膚標記物標記(CardinalHealth,#5227紫色標記墨水；n=5)、用50%異丙醇(一種用于皮膚標記物的溶劑(η=4))標記或用亞甲基藍(Akorn,Inc.,LakeForestIL；n=10)標記,并且在室溫下孵育15分鐘。將環(huán)剝離內(nèi)皮并懸浮于包含碳酸氫鹽緩沖液(120mMNaCl,4.7mMKCl、I.OmMMgSO4、I.OmMNaH2PO4UOmM葡萄糖、I.5mMCaCl2和25mMNa2HC03，pH7.4)的肌肉槽中，于37°C用95%02/5%CO2充氣。將環(huán)人工拉伸至4g張力，并以靜止的Ig張力維持以及平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(Monrovia，CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。將環(huán)用IlOmMKCl收縮(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)，并且將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力105N/m2。三個標記的組與未標記的對照組顯著不同(P(O.05)(圖6)。沒有標記的環(huán)具有(O.110±0.014)105N/m2的平均應力，用外科皮膚標記物標記的環(huán)具有(O.003±0.00110)105N/m2的平均應力，用50%異丙醇標記的環(huán)具有(O.005±0.003)IO5N/Hi2的平均應力，用亞甲基藍標記的環(huán)具有(O.014±0·01)105N/m2的平均應力。將新分離的豬隱靜脈用于測試不同標記方法的效果。收集靜脈并置于冷的移植物采集緩沖液[IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4]。將血管在4°C下貯存于移植物采集緩沖液中并在采集的24小時內(nèi)測試。為了測試活力，從隱靜脈區(qū)段中切下I.Omm寬的環(huán)并且剝離脂肪和結(jié)締組織。將隱靜脈環(huán)不處理(對照；n=6)、用外科皮膚標記物(η=3)或50%異丙醇(用于外科標記物的溶劑=3)標記，并且在室溫下孵育15分鐘。之后將環(huán)在肌肉槽中平衡，用KCl收縮，測量力并轉(zhuǎn)化為應力(105N/m2)。沒有標記的環(huán)具有(O.263±0·039)N/m2的平均應力，用外科皮膚標記物標記的環(huán)具有(O.114±0.017)N/m2的平均應力，以及用50%異丙醇標記的環(huán)具有(O.00005±0.00005)N/m2的平均應力。兩個標記組與對照未標記組顯著不同(P^O.05)ο(圖7)。·實施例2-活靜脈細胞與功能活力有相關性用活細胞測定來確定人隱靜脈細胞的活力。在由范德堡大學機構(gòu)審查委員會(Nashville,TN)批準的知情同意后，從進行冠狀動脈旁路術或外周血管旁路手術的患者中收集人隱靜脈的無標記丟棄區(qū)段(η=13)。將靜脈貯存于鹽溶液直到外科手術結(jié)束，這是將其置于冷的移植物采集緩沖液中(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。將靜脈在4°C下貯存于移植物采集緩沖液中并在采集的24小時內(nèi)測試。用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)對每個靜脈進行生理實驗和活細胞測定。為了測試活力，從沒有脂肪和結(jié)締組織的隱靜脈區(qū)段切下I.Omm寬的環(huán)，將一些剝離內(nèi)皮并懸于包含碳酸氫鹽緩沖液(120mMNaCl,4.7mMKCl,1.OmMMgSO4U.OmMNaH2PO4、IOmM葡萄糖、I.5mMCaCl2和25mMNa2HCO3,pH7.4)的肌肉槽中，于37°C用95%02/5%CO2充氣。將環(huán)人工拉伸至4g的張力，并且以獲得的Ig靜止張力維持以及平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(Monrovia，CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，并且測量產(chǎn)生的力。對KCl未收縮的任何組織認為是無活力的。對于每個環(huán)將力轉(zhuǎn)化為應力105N/m2并且對于每個靜脈進行平均。為了評估細胞的活力，將來自每個靜脈的3個環(huán)分別置于0.25ml的0.I%MTT溶液(用Dulbecco磷酸鹽緩沖液PH7.4制備)。對于陰性對照，在置于0.I%MTT溶液之前，將一個環(huán)置于20ml水中并微波10分鐘以滅活任何酶活性。將環(huán)于37°C孵育I小時。將該環(huán)置于蒸餾水中來終止反應。將組織稱重并在37°C下置于ImlCelloSolve(Sigma)中4小時以提取每個的甲臜(formazan)色素。用分光光度計(BeckmanCoulter)在570nm下測量色素濃度。從每個樣品中減去陰性對照的吸光度?；盍χ笖?shù)表示為0D57(l/mg/ml。對于3個環(huán)中計算每個靜脈的平均值。然后用得自每個靜脈的平均應力對平均活力指數(shù)作圖。數(shù)據(jù)表現(xiàn)出顯著的傾斜，顯示線粒體活力與應力活力(通過IlOmMKCl誘導的收縮來確定)之間有正比關系(R2=O.7262)(圖8)。插圖中示出低(左)和高(右)活力指數(shù)的代表性HSV環(huán)。實施例3_靜脈米集溶液和程序?qū)⑿路蛛x的豬隱靜脈收集于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgSO4,30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，PH7.4)。將血管在采集的24小時內(nèi)測試，并且在4°C貯存于移植物采集緩沖液中。將靜脈剝離脂肪和結(jié)締組織并切成2cm長的區(qū)段。將區(qū)段拉伸至2倍于其靜止長度(拉伸的；η=7)或者不操作(對照；η=12)。拉伸后，將來自這兩組的區(qū)段進一步分開。然后用棉拭子將羊毛罌紅溶液(FCF，5%異丙醇和水中2.6mM)或賦形劑沿縱向線施加到未處理(FCF；η=8)或拉伸(Stretched+FCF；n=3)的靜脈區(qū)段。將區(qū)段在勃脈力中于室溫孵育15分鐘并之后切成環(huán)。將環(huán)懸浮于包含碳酸氫鹽緩沖液(120mMNaCl,4.7mMKC1、1.OmMMgSO4,I.OmMNaH2PO4UOmM葡萄糖、I.5mMCaCldP25mMNa2HCO3,pH7.4)的肌肉槽中，在37°C通以95%02/5%C02。將環(huán)人工拉伸至4g張力，并以Ig的靜止張力維持并平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(Monrovia，CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，然后將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力105N/m2(圖9)。對照環(huán)具有(0.47±0·034)N/m2的平均應力，用羊毛罌紅染料標記的環(huán)具有(0.566±0.064)N/m2的平均應力，拉伸的環(huán)具有(0.367±0.042)N/m2的平均應力，具有羊毛罌紅染料的拉伸的環(huán)具有(0.713±0.111)N/m2的平均應力。拉伸靜脈的應力與對照非拉伸靜脈顯著Γρ<0.05)不同，與沒有羊毛罌紅染料的拉伸相比，具有羊毛罌紅染料的拉伸靜脈顯著(#Ρ<0.05)不同(圖9)。但是，在豬隱靜脈拉伸性損傷后，用另一染料(誘惑紅)處理沒有恢復功能活力(圖10)，將豬隱靜脈(η=4)不處理(對照)或拉伸至兩倍于其靜息長度(沒有染料)，切成環(huán)并懸浮于肌肉槽中的碳酸氫鹽緩沖液。來自拉伸部分的環(huán)與50μΜ誘惑紅(+紅)或與50μM羊毛罌紅(+FCF)孵育30分鐘。然后使環(huán)于碳酸氫鹽緩沖液中平衡，之后用IlOmMKCl收縮。將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力(105N/m2)。數(shù)據(jù)代表相對于對照環(huán)應答(設置為100%)的收縮。拉伸靜脈的應力與具有誘惑紅的拉伸靜脈沒有顯著的不同(NS)。與具有誘惑紅的拉伸靜脈相比，羊毛罌紅顯著地恢復了拉伸靜脈中的收縮應答(#P(0.05)。使用來自進行冠狀動脈旁路術或外周血管旁路手術患者的人隱靜脈的無標記丟棄區(qū)段來確定羊毛罌紅對人隱靜脈影響(η=4)。將靜脈貯存于鹽溶液中直到外科手術結(jié)束，這時將其置于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。在4°C下貯存于移植物采集緩沖液中的血管在采集的24小時內(nèi)測試。為了測試活力，從剝離脂肪和結(jié)締組織的隱靜脈上切下I.Omm寬的環(huán)，用羊毛罌紅溶液(FCF，5%異丙醇和水中2.6mM)或賦形劑處理并且在室溫下孵育30分鐘。之后將組織剝離內(nèi)皮并懸于包含碳酸氫鹽緩沖液的肌肉槽中，在37°C下用95%02/5%CO2充氣。將環(huán)人工拉伸至4g的張力，以Ig的靜止張力維持并平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(Monrovia，CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，并且測量產(chǎn)生的力。將力轉(zhuǎn)化為應力105N/m2，并且對賦形劑和羊毛罌紅環(huán)作圖。顯示了未處理的(對照)或用羊毛罌紅染料處理環(huán)的代表性追蹤(圖11A)。賦形劑環(huán)具有(O.015±0.012)N/m2的平均應力，羊毛罌紅處理的環(huán)具有(O.103±0·021)N/m2的平均應力。這兩組顯著不同(p彡O.05)。在采集后、外科操作之前從進行冠狀動脈旁路或外周血管旁路手術的患者收集人隱靜脈區(qū)段并保存于勃脈力中。血管在采集的2小時內(nèi)測試。將新分離的豬隱靜脈收集于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。將血管在采集的24小時內(nèi)測試。從剝離脂肪和結(jié)締組織的豬隱靜脈(圖12A，η=2)和未操作的人隱靜脈(圖12Β，η=4)上切下I.Omm寬的環(huán)。之后將環(huán)剝離內(nèi)皮并懸浮于包含碳酸氫鹽緩沖液的肌肉槽中，于37°C通以95%02/5%CO2。將該環(huán)人工拉伸至4g張力，以及以獲得的Ig的靜止張力維持并平衡2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)和Chart軟件(ADInstruments,ColoradoSprings,CO)接口的羅德諾提玻璃技術公司(Monrovia，CA)的力傳感器(159901A)獲得力測量。將環(huán)用IlOmMKCl收縮。再平衡30分鐘的之后，將環(huán)用羊毛罌紅溶液(FCF，50μM至200μΜ，30分鐘)或用賦形劑處理30分鐘，之后用100μMBzATP收縮。測量力并轉(zhuǎn)化·為應力。應答表示為最大KCl收縮的％。用賦形劑(對照)或50μM羊毛罌紅(FCF預處理)預處理之后用BzATP收縮的人隱靜脈的代表性力跟蹤示于圖12C。用羊毛罌紅(FCF)而不是賦形劑(對照)的預處理顯著地抑制了BzATP誘導的收縮ΓP<0.05)(圖12Β)。在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前(未操作，UM)和在外科準備之后(操作后，AM)，在勃脈力中從同一患者收集人隱靜脈區(qū)段，并在采集的2小時內(nèi)使用。將該區(qū)段切成Imm的環(huán),將來自每一組的一個環(huán)在福爾馬林中固定(預培養(yǎng))。在50μΜ羊毛S紅存在(FCF)或不存在(對照)的情況下，將其他環(huán)在補充有1%L-谷氨酰胺、I%青霉素/鏈霉素和30%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中在5%CO2下于37°C培養(yǎng)14天。14天后，將環(huán)以福爾馬林固定，以5μm切片并用沃爾夫-馮吉爾森染劑(VerhoffVanGiesonstain)染色。用Axiovert200捕獲該環(huán)的光學顯微圖并且用AxioVision測量內(nèi)膜厚度。數(shù)據(jù)代表內(nèi)膜厚度與培養(yǎng)前環(huán)的基礎內(nèi)膜厚度(設置為0%)的增加％。誤差線示出平均值的標準差。與對照相比，靜脈準備期間的操作提高了內(nèi)膜層的增厚(在配對t檢驗中#p=0.053)，并且羊毛罌紅處理顯著地Γρ<.05)抑制了內(nèi)膜厚度的發(fā)展(圖13)。在無菌條件下通過非觸碰法(notouchmethod)采集新鮮的豬隱靜脈并忙存于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。血管在采集的24小時內(nèi)使用。將靜脈分成三部分未處理的(未操作，η=7),擴張至>300mmHg的(擴張的,η=8),或在壓力釋放閥存在的情況下擴張的(過壓釋放，η=7)。然后將每個區(qū)段切成Imm的環(huán)，并將來自每種條件的一個環(huán)立即用福爾馬林固定(預培養(yǎng))。其他的環(huán)在5%0)2和371下，在不存在(對照)或存在50μM羊毛罌紅(FCF),50μM亮藍G(BBG)或50μM誘惑紅的情況下于補充1%L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和30%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。14天后,將環(huán)用福爾馬林固定，以5μm切片并用沃爾夫-馮吉爾森染劑染色。用Axiovert200捕獲環(huán)的光學顯微圖并且用AxioVision測量內(nèi)膜厚度。與擴張對照相比，羊毛罌紅處理抑制了擴張誘導的內(nèi)膜增厚的增強，誘惑紅則不然Γρ<.05)(圖14)。在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前(未操作，UM；η=5)和外科準備之后(操作后，AM；n=5)獲得人左乳內(nèi)動脈(LIMA；n=3)和隱靜脈的環(huán)。將切自UM區(qū)段的環(huán)在威斯康星大學溶液(UniversityofWisconsinSolution)(UM)、肝素化鹽溶液(HS)、肝素化勃脈力(HP)或包含30mM海藻糖的肝素化勃脈力(HPT)中于室溫孵育2小時。環(huán)切自靜脈、懸于肌肉槽中并在碳酸氫鹽緩沖液中平衡。將環(huán)用10_6M去氧腎上腺素預收縮，之后用5X1(Γ7Μ卡巴膽堿(carbachol)以測定內(nèi)皮依賴性舒張。來自LIMA的環(huán)具有比隱靜脈更大的內(nèi)皮依賴性舒張(圖15)。在外科準備期間的操作引起內(nèi)皮依賴性舒張的減少(圖15)。在肝素化鹽溶液中的保存[*P<O.05，與所有UM組(UM、UW、HP&HPT)的HS相比]引起內(nèi)皮依賴性舒張的減少，而肝素化勃脈力、肝素化勃脈力加上海藻糖或移植物采集溶液貝U不然(圖15)。數(shù)據(jù)代表％舒張(與去氧腎上腺素誘導的最大收縮相比)。在由范德堡大學機構(gòu)審查委員會(Nashville，TN)批準的知情同意后，從進行冠狀動脈旁路或外周血管旁路手術的患者中收集人隱靜脈的無標記丟棄區(qū)段(η=5)。將靜脈貯存于鹽溶液中直到外科手術結(jié)束，這時將其置于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)中。靜脈在采集的24小時內(nèi)測試并在4°C貯存于移植物采集緩沖液中。將壓力安全閥一端連接注射器，另一端連接插管的隱靜脈。隱靜脈的遠端也是插管的并連接到壓力傳感器。當在有或沒有壓力釋放閥的情況下用手持注射器擴張該靜脈時監(jiān)測壓力。壓力監(jiān)測器將不測量高于300mmHg的壓力。這產(chǎn)生了以下三組過壓釋放壓力(Popoff)、具有壓力安全閥的最大壓力(具有閥的最大的)以及沒有壓力安全閥的最大壓力(沒有閥的最大的)。具有壓力安全閥的靜脈具有(129±L265)mmHg的平均壓力以及(141.8±L985)mmHg的最大壓力，而沒有壓力安全閥的靜脈具有(300±0·00)mmHg的最大壓力(圖16)。具有壓力安全閥的靜脈中的平均和最大壓力與沒有壓力安全閥的靜脈顯著不同(P(0.05)O在無菌條件下通過非觸碰法采集新鮮的豬的隱靜脈并貯存于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。該血管在采集的24小時內(nèi)使用。在直列式壓力釋放閥(壓力安全)缺乏(擴張)或存在的情況下用注射器人工擴張靜脈(η=4)。對照部分是非擴張的(ND)。擴張后，將環(huán)切自該部分并懸浮于肌槽。將該環(huán)用10_6Μ去氧腎上腺素預收縮，之后用5Χ10_7Μ卡巴膽堿處理以確定內(nèi)皮依賴性舒張。數(shù)據(jù)表示為％舒張(與最大去氧腎上腺素誘導的收縮相比)。用手持注射器進行的人工擴張在內(nèi)皮依賴性舒張中引起顯著的降低(P<0.0005)并且該壓力釋放閥預防這種內(nèi)皮依賴性舒張的喪失(圖17)。從處死的豬新分離豬的冠狀動脈，并直接置于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2PO4,5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7.4)。將冠狀動脈剝離脂肪和血管外膜組織并將內(nèi)皮移除。切出橫向環(huán)(I.Omm厚)并懸浮于肌肉槽，通過絲線3-0連接到與數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換A-D面板(DataTranslation,MA)接口的力傳感器(KentScientific,CT)。數(shù)據(jù)用PowerLab軟件程序得到。將豬的冠狀動脈環(huán)懸浮于肌肉槽并在克-林二氏碳酸氫鹽緩沖液中平衡2小時。將該環(huán)拉伸并逐漸調(diào)節(jié)長度直到獲得最大的張力。該環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，測量產(chǎn)生的力并轉(zhuǎn)化為應力[牛頓(N)/m2]=力(g)X0.0987/面積，其中面積等于濕重[mg/長度(最大長度的_)]除以1.055。洗滌環(huán)并再平衡30分鐘。將環(huán)用以下進行處理5μM組胺、IlOmMKCl、ImM罌粟堿(PAP)、ImM罌粟堿處理10分鐘然后用5μM組胺，或者ImM罌粟堿處理10分鐘然后用IlOmMKC1，測量產(chǎn)生的力并將其轉(zhuǎn)化為應力。用5μM組胺(Hist)、IlOmMKCl(KCl)、ImM罌粟堿(PAP)、ImM罌粟堿10分鐘后用5μΜ組胺(Pap+Hist)或者ImM罌粟堿10分鐘后用IlOmMKCl(Pap+KCl)處理的環(huán)的代表性力追蹤示于圖ISA0將應力的減少轉(zhuǎn)化為最大原始KCl收縮(設置為100%)的百分數(shù)。罌粟堿處理降低了環(huán)中的基底張力((-15·0±3·135)%)(圖18B)。用罌粟堿預處理的環(huán)完全抑制了組胺(與98·613±11·049相比-12·0±4·163)和KCl(與(103.33±2.404)%相比-20.O±10.00)誘導的收縮(圖18Β)。在由范德堡大學機構(gòu)審查委員會(Nashville，TN)批準的知情同意后，從進行冠狀動脈旁路或外周血管旁路手術的患者中收集人隱靜脈的無標記丟棄區(qū)段(η=6)。將靜脈貯存于鹽溶液直到外科手術結(jié)束這時將其置于冷的移植物采集緩沖液(IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，PH7.4)。將靜脈在采集的24小時內(nèi)測試并在4°C貯存于移植物采集緩沖液中。將靜脈除去脂肪和血管外膜組織并且將內(nèi)皮移除。切出橫向環(huán)(I.Omm厚)并懸浮于肌肉槽中，通過絲線3-0連接到與數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換A-D面板接口的力傳感器(KentScientific,CT)。將人隱靜脈懸浮于肌肉槽并且在克-林二氏碳酸氫鹽緩沖液中平衡2小時。將環(huán)拉伸并逐漸調(diào)節(jié)長度直到獲得最大的張力。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，測量產(chǎn)生的力并將其轉(zhuǎn)化為應力[牛頓(N)/m2]=力(g)X0.0987/面積，其中面積等于濕重[mg/長度(最大長度的mm)]除以I.055。洗滌環(huán)并再平衡30分鐘。環(huán)用O.5μM去甲腎上腺素(NE)、ImM罌粟堿(PAP)處理，或用ImM罌粟堿處理10分鐘后用O.5μMNE處理，測量產(chǎn)生的力并將其轉(zhuǎn)化為應力。將應力的減少轉(zhuǎn)化為最大原始KCl收縮(設置為100%)的百分數(shù)。用O.5μMNE(NE)、ImM罌粟堿(PAP)或者ImM罌粟堿處理10分鐘后再用5μMNE處理的環(huán)的代表性力追蹤示于圖19Α。將應力的減少轉(zhuǎn)化為最大原始KCl收縮(設置為100%)的百分數(shù)。N=6。罌粟堿處理降低了環(huán)的基底張力((-9.772.0±3.226)%)。用罌粟堿預處理人隱靜脈完全抑制了NE(與(89.935±18.344)%相比的-3.210±5.119)誘導的收縮(圖19Β)。靜脈采集設備在圖20中示出。對靜脈(由于該靜脈中的閥，該靜脈是翻轉(zhuǎn)的)的遠端用子彈尖端的塑料導管(其具有用于沖洗的腔)進行插管，并用彈簧鉗緊固在導管上。將導管夾在底座上。將另一個沒有腔的子彈狀尖端的導管連接至夾在該底座相對端的靜脈近端。將該設備用棘輪打開直到該靜脈具有與體內(nèi)相同的長度。將具有延伸管和直列式壓強釋放閥的注射器連接該靜脈的遠端?，F(xiàn)在該靜脈能夠擴張并分支結(jié)扎。實施例4-預示性的臨床方案將使用標準外科技術通過外科手術采集大隱靜脈。在靜脈的遠端將用子彈狀尖端的靜脈管進行插管，并用夾具或絲帶固定。將壓強釋放閥與插管相連，閥的另一端連接IOcc或20cc注射器。在一些情況下，注射器和閥之間置有延長管。用靜脈采集溶液使靜脈擴張，鑒別支流并用絲帶或夾具結(jié)扎。用試劑盒中的標記物沿著一個長表面標記該靜脈以維持該靜脈的取向。在一些情況下，將靜脈在從患者中移出之前標記。之后靜脈將置于采集溶液中直到植入動脈循環(huán)。在一個實施方案中，筆中的染料將包含Ρ2Χ7受體拮抗劑，而采集溶液將不包含Ρ2Χ7受體拮抗劑。在另一個實施方案中，筆中的染料將不包含Ρ2Χ7受體拮抗劑，但是溶液將含有。在第三個實施方案中，筆的染料和溶液都將含有P2X7受體拮抗劑。'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k根據(jù)本公開內(nèi)容，可以無需過度實驗而實施和完成本文公開的和要求保護的全部組合物和/或方法。盡管就一些優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對本領域技術人員而言顯而易見的是，可對本文所述組合物和/或方法以及本文所述方法的步驟或步驟順序進行改變，而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體的，顯而易見的是，本文所述試劑可替換為在化學上和生理學上相關的某些試劑，而實現(xiàn)相同或相似的效果。對本領域技術人員而言顯而易見的所有這些相似的替代和改變都認為在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思中，如由附加的權利要求書所限定的。VII.參考文獻下述的參考文獻通過引用具體地合并到本文中，其程度為對本文提供補充性的示例性程序或其它細節(jié)。MotwaniJG,TopolEJ(1998)Aortocoronarysaphenousveingraftdiseasepathogenesis，predisposition，andprevention.Circulation97:916-931.ClowesAW,ReidyMA(1991)Preventionofstenosisaftervascularreconstructionpharmacologiccontrolofintimalhyperplasia—areview.JVascSurg13:885-891.AllaireE,ClowesAW(1997)Endothelialcellinjuryincardiovascularsurgery:theintimalhyperplasticresponse.AnnThoracSurg63:582—591.MossePR,CampbellGRiWangZL,CampbellJH(1985)Smoothmusclephenotypicexpressioninhumancarotidarteries.I.Comparisonofcellsfromdiffuseintimalthickeningsadjacenttoatheromatousp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劑盒，其中所述設備包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪亥踩y。33.根據(jù)權利要求32所述的試劑盒，其中所述注射器或?qū)Ч馨訌棤罴舛?，所述子彈狀尖端包含用于弓I入所述靜脈外植體近端的管腔。34.根據(jù)權利要求24所述的試劑盒，其還包含設計成把持所述靜脈外植體的夾具。35.一種用于沖洗靜脈外植體的管腔的設備，所述設備設計成防止所述靜脈外植體內(nèi)的沖洗壓大于200mmHg。36.根據(jù)權利要求35所述的設備，其中所述設備包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪亥踩y。37.根據(jù)權利要求36所述的設備，其中所述注射器或?qū)Ч馨訌棤罴舛耍鲎訌棤罴舛税糜诠璉入所述靜脈外植體遠端的管腔。38.根據(jù)權利要求36所述的設備，其還包含用于引入所述靜脈外植體近端的無管腔的子彈狀塞。39.根據(jù)權利要求35所述的設備，其還包含設計成把持所述靜脈外植體的夾具。40.根據(jù)權利要求35所述的設備，其中所述設備設計成防止所述靜脈外植體內(nèi)的沖洗壓大于150_Hg。41.ー種pH7.O至pH7.6的緩沖溶液，其中所述緩沖溶液包含肝素和P2X7受體拮抗劑。42.根據(jù)權利要求41所述的溶液，其中所述P2X7受體拮抗劑包含羊毛罌紅/藍染料#1或亮藍G。43.根據(jù)權利要求41所述的溶液，其中所述緩沖溶液包含磷酸鹽緩沖液、MOPS、H印es、Pipes、醋酸鹽或勃脈力。44.根據(jù)權利要求41所述的溶液，其中所述緩沖溶液還包含以下ー種或更多種抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白27(HSP27)抑制劑、HSP20調(diào)節(jié)劑和/或MAPKAP激酶2抑制劑。45.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述抗收縮劑是磷酸ニ酯酶抑制劑、鈣通道阻斷劑、一氧化氮供體或環(huán)核苷酸類似物。46.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述抗氧化劑是N-こ酰半胱氨酸、別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗壞血酸、生育酚、生育三烯酚或綠茶酚。47.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述寡糖是乳糖酸、棉子糖或海藻糖。48.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述膠體劑是羥こ基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白。49.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述抗炎劑是皮質(zhì)留類、非留類抗炎劑、mapkap激酶2抑制劑、抗TNF-α、抗IL-I-β或Cox-2抑制劑。50.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述內(nèi)皮功能保存劑是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制齊U、血管緊張素受體抑制劑、抑制素、ニ甲雙胍或雌激素。51.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述代謝調(diào)節(jié)劑是葡萄糖、腺苷胰淀素、降鈣素相關基因妝或膜島素。52.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述水凝膠包含天然多糖，如藻酸鹽、葡聚糖、殼聚糖和糖胺聚糖；或親水性聚合物，如聚こニ醇、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥こ基纖維素、聚羥基丁酸或聚(η-異丙基丙烯酰胺)。53.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述HSP27抑制劑是抑制HSP27表達的siRNA或miRNA。54.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述HSP20調(diào)節(jié)劑是增強HSP20表達的抗miRNA。55.根據(jù)權利要求44所述的溶液，其中所述MAPKAP激酶2抑制劑是肽抑制劑。56.根據(jù)權利要求41所述的溶液，其中所述pH是7.35至7.45。57.根據(jù)權利要求41所述的溶液，其中所述pH是7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5或7.6。全文摘要移植失敗的首要原因是隨后發(fā)生內(nèi)膜增生，這代表了對認為與平滑肌增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化以及細胞外基質(zhì)(ECM)沉積相關之損傷的反應。本發(fā)明顯示通常用于靜脈采集的外科技術(拉伸靜脈、將靜脈置于低pH溶液以及使用有毒的外科皮膚標記物)導致?lián)p傷。因此本發(fā)明提供無毒的外科標記物和其他添加劑，所述外科標記物還對拉伸誘導的功能活力喪失提供保護。本發(fā)明還提供用于降低物理應力或?qū)ζ渌a(chǎn)生影響提供保護的設備和組合物。文檔編號A61M39/06GK102834102SQ201080055389公開日2012年12月19日申請日期2010年12月8日優(yōu)先權日2009年12月8日發(fā)明者科琳·布羅菲,帕德米尼·科馬拉維拉斯,喬伊斯·莊-弗林,凱爾·霍金,蘇珊·伊格爾申請人:范德比爾特大學,美國政府，由退伍軍人事務部代表