專利名稱：梭菌神經(jīng)毒素的定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及參照參考樣品中梭菌毒素的已知濃度，用于體外確定樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法。該方法可包括電刺激與所述樣品接觸過(guò)的肌肉組織，比較各自對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果，從而確定所述未知濃度。該方法也可用于評(píng)價(jià)樣品中梭菌神經(jīng)毒素相對(duì)于參考標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)效價(jià)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，肉毒神經(jīng)毒素已經(jīng)成為治療局部肌張力異常和痙攣適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)制劑。藥物制劑可市售獲得，例如易普森公司(Ipsen Ltd.) (Dysport^)或愛(ài)力根公司(AllerganInc.) (Botox^。不含其它任何梭菌蛋白的高純度神經(jīng)毒素可從例如梅爾茨制藥(MerzPharmaceuticals) (Xeomin )獲得。另一種制劑由 Solstice Neurosciences 公司(Myobloc )注冊(cè)。還有另一種制劑由Mentor公司(PurTox1 )注冊(cè)。這些制劑在所使用的肉毒毒素類型或生物效力和效價(jià)各方面均不同。對(duì)患者的治療通常是將神經(jīng)毒素注射到受侵襲的肌肉組織，使制劑位于神經(jīng)肌肉終板附近，即靠近細(xì)胞受體，介導(dǎo)其吸收進(jìn)入到控制所述受侵襲肌肉的神經(jīng)細(xì)胞。已觀察了神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散的各種不同程度。這種擴(kuò)散可以認(rèn)為是與注射量和注射的特定神經(jīng)毒素制劑有關(guān)。由于擴(kuò)散，可在附近的肌肉組織觀察到因乙酰膽堿釋放抑制引起的系統(tǒng)性副作用。通過(guò)將注射劑量減少到治療相關(guān)的水平，可很大程度上避免未治療肌肉的意外麻痹事件。超劑量也會(huì)給患者的免疫系統(tǒng)帶來(lái)問(wèn)題，因?yàn)樽⑸涞纳窠?jīng)毒素會(huì)導(dǎo)致形成中和抗體。如果發(fā)生這種情況，毒素會(huì)失活，不能緩解不隨意肌的活動(dòng)力。在已確定效價(jià)的制劑如可售產(chǎn)品或生產(chǎn)過(guò)程中生產(chǎn)的批次中，劑量當(dāng)量或變化的差異會(huì)通過(guò)可能的副作用和免疫力的進(jìn)展增加患者的風(fēng)險(xiǎn)。因此，盡可能精確地確定包含在所述市售產(chǎn)品或批次產(chǎn)品(即沒(méi)有明顯差異)中梭菌神經(jīng)毒素的濃度是至關(guān)重要的，以便將毒素濃度調(diào)整至對(duì)患者有益的可靠有效劑量。這可以激勵(lì)生產(chǎn)者針對(duì)不同治療目的提供使生物活性即效價(jià)得到最佳開(kāi)發(fā)的制劑。EP I 597 584 BI提供了用于體外確定樣品如含有肉毒神經(jīng)毒素的樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的量的方法。該方法包括在含有突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的樣品存在下，電刺激肌肉組織，優(yōu)選小鼠的肋骨肌肉，比較該樣品誘導(dǎo)的效果和參考物質(zhì)誘導(dǎo)的效果，從而確定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的量。GB 2 416 849 A和GB 2 398 636 A提供了用于體外確定樣品如含有肉毒神經(jīng)毒 素的樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的量的方法。該方法包括在含有突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的樣品存在下，電刺激平滑肌肉組織，優(yōu)選小鼠或大鼠的肋骨肌肉，比較該樣品誘導(dǎo)的效果和參考物質(zhì)誘導(dǎo)的效果，從而確定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻滯物質(zhì)的量。US 2003/0032891 Al提供了體內(nèi)測(cè)量物質(zhì)如梭菌毒素效價(jià)的方法，其中將所述物質(zhì)施用于哺乳動(dòng)物，使哺乳動(dòng)物受到刺激并且監(jiān)測(cè)所述哺乳動(dòng)物對(duì)所述刺激產(chǎn)生的耳廓反射響應(yīng)。EP 2 015 065 Al提供了定量神經(jīng)毒素如梭菌神經(jīng)毒素效力的方法，其中將所述毒素施用于非人類哺乳動(dòng)物的后腿，對(duì)所述非人類哺乳動(dòng)物施加電刺激，測(cè)量所述后腿的收縮并與其它后腿的收縮進(jìn)行對(duì)比。Pearce 等，Toxicon，Vol. 35，No. 9，pp. 1373-1412，1997，公開(kāi)了大鼠 / 小鼠膈神經(jīng)
偏側(cè)膈結(jié)合肉毒神經(jīng)毒素的適宜性。Wohlfahrt 等，Naunyn-Schmiedeberg，s Arch Pharmacol 355, 335-340 (1997)米用小鼠橫膈膜通過(guò)劑量依賴響應(yīng)曲線比較了兩種市售肉毒毒素A制劑的效力。

Chang 等，Naunyn-Schmiedeberg，s Arch. Pharmacol. 282,129-142 (1974)比較了A型肉毒毒素和P-環(huán)蛇毒素對(duì)分離的神經(jīng)-肌肉標(biāo)本如小鼠和大鼠橫膈膜的突觸前行為。Sheridan 等，J. Appl. Toxicol. 19，S29-S33 (1999)描述了基于傳統(tǒng)的毒素濃度生物檢測(cè)法確定肉毒菌拮抗劑的效力。James等，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285,G291-G297 (2003)描述了肉毒毒素對(duì)幽門和竇平滑肌的抑制效果。GGschel等，Exp. Neurol. , vol. 147,1,1997描述了與含有已知量毒素的樣品的效價(jià)相比，用于確定樣品中肉毒毒素相對(duì)效價(jià)的濃度響應(yīng)曲線。進(jìn)行了不同肉毒毒素制劑對(duì)小鼠偏側(cè)膈的試驗(yàn)。然而，上述引用的現(xiàn)有技術(shù)的定量方法缺少管理機(jī)構(gòu)認(rèn)證要求的精確性。因此，那些公開(kāi)的方法不能用于管理目的，而是需要進(jìn)行不合時(shí)宜的小鼠殺死試驗(yàn)。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的方法并且開(kāi)發(fā)一種分別用于確定效價(jià)以及樣品中影響所述效價(jià)的梭菌神經(jīng)毒素濃度的可靠且精確的方法，其可用于管理目的。這種改進(jìn)的方法也將滿足安全和有效給藥的巨大需求。發(fā)明概述在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的方法，其包括(a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸；(c)測(cè)定所述梭菌神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果；其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的步驟(a)之后包括步驟(b)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在不含所述樣品的情況下進(jìn)行步驟(b)。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)不同濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；
(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；
(k)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同的濃度；(I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的步驟(a)之后包括步驟(b)，且步驟(f)之后包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素相對(duì)效價(jià)的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的步驟(a)之后包括步驟(b)，且步驟(f)之后包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍中選擇所述不同濃度；(n)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為F-檢驗(yàn)，或X2-檢驗(yàn)，或t_檢驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率為彡5 (以％表示)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(e ):( e )根據(jù)所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此間的相對(duì)位移，計(jì)
算第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)第二和第三個(gè)方面中的方法，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進(jìn)行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面中的任一種方法，肌肉組織暴露于所述梭菌神經(jīng)毒素的時(shí)間，也就是，使肌肉組織與樣品(分別為第一或第二含梭菌神經(jīng)毒素的樣品)接觸的時(shí)間，根據(jù)步驟(a)在不含所述樣品(分別為第一或第二樣品)之前，根據(jù)步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)分別測(cè)定所述效果，其為l-60min。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面中的任一種方法，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)所述測(cè)定之前，所述肌肉組織暴露于所述梭菌毒素的時(shí)間為5_30mino
在又一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面中的任一種方法，所述肌肉組織暴露于所述神經(jīng)毒素的時(shí)間約為15min。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面中的任一種方法，在步驟(a)和/或步驟(f)之前，所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)過(guò)程中，所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)之前和步驟(a)過(guò)程中，和/或步驟(f)之前和步驟(f)過(guò)程中，所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述記錄測(cè)得的第二效果是通過(guò)繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線進(jìn)行的，且記錄所述第二數(shù)據(jù)集是通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個(gè)濃度下確定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為20-400，或?yàn)?00-800。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效果(分別為所述第一和第二效果)選自下組所述肌肉組織的麻痹時(shí)間、所述肌肉組織收縮率的變化、所述肌肉組織收縮距離的變化、所述肌肉組織收縮力的變化、所述肌肉組織在終板電位或微型終板電位中的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效果(分別為所述第一和第二效果)為麻痹時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織選自肋間肌、后肢肌肉和后肢趾長(zhǎng)伸肌、后爪跖肌、膈神經(jīng)偏側(cè)膈、耳長(zhǎng)提肌、娃神經(jīng)肌接頭、雛雞頸二腹肌(biventer cervic muscle)、肋骨肌肉、腦組織或海鰩(sea ray)的電器官。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膈神經(jīng)偏側(cè)膈來(lái)自大鼠或小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭菌神經(jīng)毒素為肉毒毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素為選自下組的血清型A、B、C、D、E、F和G ;或?yàn)檫x自血清型A、B、C、D、E、F和G的經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的肉毒神經(jīng)毒素衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)毒素不含復(fù)合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)毒素為血清型A或B。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述電刺激是在含有消泡劑的緩沖液中進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述消泡劑選自含硅化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液中已清除氧。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括(A)-用于刺激已暴露于梭菌神經(jīng)毒素的肌肉組織，以選擇所述神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的裝置；-用于測(cè)定并記錄所述效果的裝置；以及 (B)計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及肌肉組織在本發(fā)明任一種方法中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面中的任一種方法在控制含有梭菌神經(jīng)毒素的樣品效價(jià)中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為貯存的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為凍干樣品或?yàn)橹亟M樣品。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及，例如在梭菌神經(jīng)毒素生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制中，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度中的應(yīng)用；或在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)中的應(yīng)用。發(fā)明詳述已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用本文公開(kāi)的方法，現(xiàn)有技術(shù)的量化方法中觀察到的變化可以顯著減少到不明顯的程度。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的方法，包括(a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果；其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“使肌肉組織與所述樣品接觸(根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，其可以是方法中的第一或第二樣品)”是指在所述接觸過(guò)程中，所述樣品中至少部分神經(jīng)毒素被所述肌肉組織接收，即樣品中所含的至少部分神經(jīng)毒素被所述肌肉組織中含有的適當(dāng)受體結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“不含樣品的情況下”是指步驟(C)中測(cè)定效果是在含10重量％或更低，例如不含任何樣品，或換句話說(shuō)不含任何樣品的神經(jīng)毒素的介質(zhì)(通常為適當(dāng)?shù)木彌_液)中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織不連續(xù)地但僅暫時(shí)地暴露于含梭菌神經(jīng)毒素的樣品(根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，其可以是該方法中的第一或第二樣品)。這意味著，在將所述肌肉組織暴露于神經(jīng)毒素預(yù)定的時(shí)間后，即在步驟(a)中進(jìn)行接觸以使所述肌肉組織對(duì)這種暴露作出響應(yīng)，相應(yīng)效果的測(cè)定(或根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，分別為方法中的第一或第二效果)，其中例如所述肌肉組織接受電刺激，采用下述方法在不含所述樣品的情況下進(jìn)行(根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，其可為該方法中的所述第一或第二樣品)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行所述測(cè)定之前，所述肌肉組織，例如被從含有所述樣品的器官浴槽(organ bath)中移出，并轉(zhuǎn)移到如下所述的包括不含神經(jīng)毒素的成分的器官浴槽中。隨后，進(jìn)行電刺激和效果(當(dāng)樣品為第一或第二樣品時(shí)，可以為第一或第二效果)幅度的測(cè)定。這意味著，用含有所接收的神經(jīng)毒素的肌肉組織進(jìn)行電刺激以及對(duì)所述刺激的響應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將含有神經(jīng)毒素的成分，即樣品(可為第一或第二樣品)，替換為不含神經(jīng)毒素的成分。替換后，進(jìn)行效果(當(dāng)樣品為第一或第二樣品時(shí)，可以為第一或第二效果)幅度的測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素(或梭菌毒素)”包括梭菌毒素復(fù)合物以及高純度的神經(jīng)毒素，即神經(jīng)毒素制劑，不含任何其它梭菌蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭菌神經(jīng)毒素是肉毒神經(jīng)毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素為選自下組的血清型A、B、C、D、E、F和G0術(shù)語(yǔ)“肉毒毒素復(fù)合物”包含與至少另一種無(wú)毒蛋白相關(guān)的肉毒毒素。顯然，文中使用的術(shù)語(yǔ)肉毒毒素復(fù)合物包括450kDa和900kDa的肉毒毒素復(fù)合物，其例如可從肉毒梭菌培養(yǎng)物中獲得。這類基于A型肉毒毒素復(fù)合物的制劑可市售獲得，如易普森公司(Dysporf)或愛(ài)力根公司(Botox )。另一種基于B型肉毒復(fù)合物的制劑可獲自SolsticeNeurosciences公司(Myobloc.U:丨純度的不含任何其它梭菌蛋白的A型神經(jīng)毒素可獲自Merz Pharmaceuticals (Xeomin、。它是改善幾種形式局限性肌張力障礙的首選藥物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素為選自血清型A、B、C、D、E、F和G的經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的衍生物。所述經(jīng)化學(xué)修飾的神經(jīng)毒素衍生物可以為經(jīng)丙酮酸化、磷酸化、硫酸化(sulfatation)、脂化和/或糖基化修飾的衍生物。所述經(jīng)遺傳修飾的神經(jīng)毒素衍生物可以為所述血清型蛋白中含有的一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)缺失、添加或替換得到的衍生物。經(jīng)修飾后的毒素優(yōu)選具有生物活性。生物活性毒素是能夠被攝入到細(xì)胞的毒素，從而蛋白裂解SNARE復(fù)合物中含有的一個(gè)或多個(gè)多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)所述肌肉組織于神經(jīng)毒素中暴露過(guò)之后，在不含所述樣品的情況下進(jìn)行所述電刺激和效果測(cè)定，各自劑量響應(yīng)曲線發(fā)生位移，從而本發(fā)明方法的靈敏度顯著增加。樣品中以小鼠LD5tl單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素的靈敏度顯著增加。例如，如果分別測(cè)定響應(yīng)、麻痹時(shí)間作為效果，與樣品存在的情況下測(cè)定所述效果的方法相比，所述麻痹時(shí)間增加。這使該方法的靈敏度得到有益的增加，特別適用于低濃度神經(jīng)毒素的區(qū)域。如果效價(jià)是在較低的濃度下確定的，一般神經(jīng)毒素會(huì)顯示出最大的差異，然而在相當(dāng)高的濃度下，效價(jià)彼此趨于一致。
靈敏度的增加可使各自的劑量-響應(yīng)曲線的分析更精確、更可靠。反過(guò)來(lái)可使用相對(duì)少量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠，否則，為實(shí)施本發(fā)明的任一種方法而不得不將其處死。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案不僅在技術(shù)方面，而且在倫理方面都具有進(jìn)步。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“靈敏度”是生理學(xué)常用的含義，即它定義了肌肉組織響應(yīng)外部刺激的能力。這里，通過(guò)使肌肉組織與梭菌神經(jīng)毒素接觸來(lái)進(jìn)行外部刺激。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可選擇一定的濃度范圍，如相對(duì)較低濃度梭菌神經(jīng)毒素的濃度范圍，其中所述靈敏度是增加的，即可以確定響應(yīng)，否則不能確定則只能在非容忍偏差(non-tolerabIe deviation)內(nèi)分別測(cè)定。根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；(k)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同的濃度；(I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在步驟(a)之后包括步驟(b)，或在步驟(a)之后包括步驟(b)且在步驟(f)之后包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進(jìn)行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第二和/或第一效果的確定在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織的電刺激在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。這意味著，在步驟(a)之后和在步驟(b)之前和/或在步驟⑴之后和在步驟(g)之前，如上文所述，將肌肉組織從第二和/或第一樣品中移出。術(shù)語(yǔ)“確認(rèn)出所述第一和第二效果相同的濃度”(步驟(k)和(I))表示所述第一和第二效果在定性和定量上是相同的，即誘導(dǎo)效果為如麻痹時(shí)間，且所述效果具有相同的測(cè)量值。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了獲得能進(jìn)行可靠地比較的結(jié)果，肌肉組織分別暴露于第二樣品中和第一樣品所含的神經(jīng)毒素中的時(shí)間應(yīng)該具有可比性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述暴露時(shí)間是相同的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(e)中所述記錄測(cè)得的第二效果是通過(guò)測(cè)定所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素的第二效果，并繪制測(cè)得的所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行的。如上所述，如果所述第二樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果是基于以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定的，那么可獲得校準(zhǔn)曲線。例如，在選擇的濃度范圍內(nèi)可確定IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟中所述誘導(dǎo)的效果。因此，通過(guò)步驟(e)中記錄的第二數(shù)據(jù)集繪制校準(zhǔn)曲線，通過(guò)該校準(zhǔn)曲線，根據(jù)步驟(k)及后面的步驟(I)確定所述第一樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，繪制生成的校準(zhǔn)曲線，通過(guò)圖形分析完成步驟(k)-(l)的所述確認(rèn)出和等于的步驟。 所述第一樣品的未知濃度可通過(guò)確認(rèn)出校準(zhǔn)曲線上與所述第一和第二效果具有相同值的濃度來(lái)確定，例如相同的麻痹時(shí)間，根據(jù)步驟(I)使所述濃度等于所述未知濃度。所述確定的前提條件是，第一樣品中梭菌毒素的未知濃度對(duì)肌肉組織產(chǎn)生效果，其可通過(guò)所述校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，必要時(shí)可對(duì)未知濃度的第一樣品進(jìn)行一次或多次稀釋或濃縮，從而使達(dá)到的濃度范圍可與第二樣品進(jìn)行比較，即達(dá)到相同的第一和第二效果。然后，已知稀釋或濃縮系數(shù)，可通過(guò)計(jì)算來(lái)確定未稀釋或未濃縮的第一樣品中初始存在的神經(jīng)毒素的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述確認(rèn)出和等于不是通過(guò)步驟(h)和后面的步驟(k)和(I)中僅一個(gè)濃度的單點(diǎn)測(cè)量，而是通過(guò)多個(gè)不同濃度的測(cè)量進(jìn)行的。鑒于管理機(jī)構(gòu)的要求，這一點(diǎn)尤為重要。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，最好對(duì)濃度范圍進(jìn)行優(yōu)化，從而使在該濃度范圍內(nèi)的所述第二和第一樣品能夠進(jìn)行可靠的比較。這不僅適用于關(guān)于迄今已知的和商品化梭菌神經(jīng)毒素制劑的生物效力的可比性，也可適用于未來(lái)開(kāi)發(fā)的或正在開(kāi)發(fā)的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了優(yōu)化以小鼠LD5tl單位/ml表示的濃度范圍，從而使在該濃度范圍內(nèi)的所述第二和第一樣品能夠進(jìn)行可靠的比較，最好是首先確定步驟(e)和/或步驟(h)中記錄的校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)采用合適的逐步回歸分析，則可能產(chǎn)生回歸模型以基于劑量-響應(yīng)曲線預(yù)測(cè)未知毒素樣品的效價(jià)。采用這種方法，可確認(rèn)出代表兩個(gè)不同數(shù)據(jù)群體的第一和第二樣品的濃度范圍，其中各自的劑量-響應(yīng)曲線之間的相關(guān)性達(dá)到最大值，即確定為最佳擬合。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)預(yù)定的回歸模型，通過(guò)以擬合曲線表示第一和第二樣品的各自數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍，以及在預(yù)定的置信區(qū)間分別線性化和平行化所述擬合曲線，可進(jìn)一步精確所述檢驗(yàn)。因此，根據(jù)第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)；
(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織；(h)測(cè)定對(duì)步驟(g)中獲得的所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍選擇所述不同濃度；(n)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟U )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在步驟(a)之后包括步驟(b)，()()且在步驟(f)之后包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進(jìn)行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第二和/或第一效果的確定在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織的電刺激在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。這意味著，在步驟(a)之后和在步驟(b)之前和/或在步驟(f)之后和在步驟(g)之前，如上文所述，將肌肉組織從第二和/或第一樣品中移出。完成上述程序的合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是眾所周知，如可能性-商-檢驗(yàn)(likelihood-quotient-test)。這種可能性-商-檢驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例是已知的F-檢驗(yàn)。也可使用檢驗(yàn)如X2-檢驗(yàn)(卡方檢驗(yàn)或X2-分布檢驗(yàn))或t-檢驗(yàn)。所述檢驗(yàn)也是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是F-檢驗(yàn)。通過(guò)所述檢驗(yàn)，可確定在預(yù)定的置信區(qū)間內(nèi)，取自兩個(gè)不同群體的兩個(gè)隨機(jī)樣本相對(duì)于其方差是否有本質(zhì)不同。因此，這種檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)兩個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本(此處為第二和第一樣品)的差異。 在一個(gè)實(shí)施方案中，為了獲得可靠的結(jié)果，置信區(qū)間應(yīng)該較寬，即誤拒絕的概率應(yīng)該是較低的。在一個(gè)實(shí)施方案中，誤拒絕的概率為< 5 (以％表示；(或0. 05))，以及置信區(qū)間為彡95 (以％表示；(或0.95))。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率為<5 (以％表示)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(Y)中的線性化是以最佳擬合直線表示各自數(shù)據(jù)集來(lái)進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(S)中的平行化是通過(guò)確定最佳擬合直線的共同斜率來(lái)進(jìn)行的。步驟(S )之后，根據(jù)所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對(duì)位移確定第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在步驟(5 )之后進(jìn)一步包括步驟(e ):( e )根據(jù)所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對(duì)位移計(jì)算出第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“相對(duì)效價(jià)”是指分別根據(jù)線性化和平行化的擬合曲線各自的相同濃度，在相同濃度下確定的第一樣品相對(duì)于第二樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二樣品的效價(jià)相當(dāng)于100%，第一樣品的相對(duì)效價(jià)以％表示。例如，相對(duì)于第二樣品該第一樣品獲得了 110%或90%的效價(jià)。應(yīng)用三分律即比例運(yùn)算法(the rule of three),通過(guò)分別將具有110%效價(jià)的第一樣品稀釋至100%效價(jià),獲得第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的有效濃度(目前未知的濃度)。計(jì)量單位現(xiàn)在變成相對(duì)效價(jià)，且數(shù)值以活性單位(效價(jià))表示，其根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)(第二樣品)的活性(效價(jià))來(lái)定義。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)效價(jià)是以第一和第二樣品的效價(jià)的比率表示的。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述模型用于預(yù)測(cè)使用的神經(jīng)毒素劑量的對(duì)數(shù)值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)論是刺激效果的量還是樣品中神經(jīng)毒素劑量的量均以對(duì)數(shù)值記錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，分別在第二樣品和第一樣品中至少三個(gè)不同的梭菌神經(jīng)毒素濃度下，分別測(cè)定第二效果和第一效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)集的記錄、各自校準(zhǔn)曲線的記錄、各自的校準(zhǔn)曲線以半對(duì)數(shù)圖的形式表示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用雙對(duì)數(shù)圖。確定相對(duì)效價(jià)的方法記載于歐洲藥典中。在一個(gè)實(shí)施方案中，以例如10小鼠LD5tl單位/ml為起始濃度，確定相對(duì)效價(jià)的方法適用于整個(gè)數(shù)據(jù)集的范圍。隨后，將大于10小鼠LD5tl單位/ml的值作為起始點(diǎn)，如11、12、13、14、15、16、17小鼠LD5tl單位/ml。進(jìn)行迭代直到該應(yīng)用模型達(dá)到期望和要求的精度。在一個(gè)實(shí)施方案中，一旦通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定了最佳擬合及濃度范圍，任何含有未知濃度(對(duì)應(yīng)于有效濃度)梭菌神經(jīng)毒素的第一樣品可與根據(jù)本發(fā)明方法確定的在所述濃度范圍內(nèi)的第二樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，記錄所述測(cè)定的第二效果是通過(guò)繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線來(lái)進(jìn)行的，記錄所述第二數(shù)據(jù)集是通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行的。相對(duì)效價(jià)評(píng)價(jià)的應(yīng)用，以及檢測(cè)中包含參考標(biāo)準(zhǔn)(第二樣品)，可形成更精確且更具重現(xiàn)性的評(píng)價(jià)，其為減少動(dòng)物的使用提供了機(jī)會(huì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面的任一種方法，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測(cè)定之前，使所述肌肉組織暴露于所述梭菌毒素中5-30min。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面的任一種方法，在步驟(a)和/或步驟(f)之前所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)過(guò)程中所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)之前和步驟(a)過(guò)程中，和/或步驟(f)之前和步驟(f)過(guò)程中，所述肌肉組織已經(jīng)過(guò)電刺激。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)通常采用合適的計(jì)算機(jī)程序和合適的計(jì)算機(jī)來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用合適的包含用以實(shí)施所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的 合適軟件工具的計(jì)算機(jī)程序來(lái)進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二樣品選自可市售獲得的和注冊(cè)的肉毒毒素制劑。由于這些產(chǎn)品為注冊(cè)的，并允許分別作為藥物制劑、藥劑，它們分別包括明確界定的數(shù)量和肉
毒毒素的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下生產(chǎn)的任何肉毒毒素制劑均可使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述商業(yè)制劑可作為第二樣品。因此，第二樣品可以為
Xeomin' Botox' Dysport' Myoblocli'或pUfTox 。這些制劑或者使用的肉毒毒素
類型不同，或者生物效力/活性即效價(jià)不同，例如肉毒神經(jīng)毒素的濃度或其中所含肉毒菌的類型不同。以小鼠LD5tl表示的小鼠單位為確定樣品中所含梭菌神經(jīng)毒素濃度的常用單位。LD5tl值表示將所述的量施用于小鼠群體的小鼠時(shí)，導(dǎo)致50%小鼠群體死亡的致死劑量。確定該值的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。該方法記載于歐洲藥典中。眾所周知，在基于肉毒神經(jīng)毒素的產(chǎn)品上標(biāo)記的LD5tl單位可具有產(chǎn)品特異性、生產(chǎn)商特異性，且由于缺少標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法互換。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中涉及的LD5tl單位是表征和標(biāo)iL!XeominK:時(shí)確定的單位。例如，第二樣品為Xeomin'8'。因而有關(guān)特定效價(jià)的單位為Xeomin 單位。因此，本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)可用于比較評(píng)價(jià)含梭菌神經(jīng)毒素的任何樣品相對(duì)于Xeomin 的效價(jià)。然后，該方法可直接以Xeomin 單位比較含有梭菌神經(jīng)毒素(未知的濃度)的第一樣品。Xeomin 和Botox 具有大致相當(dāng)?shù)男Я蛐r(jià)。為獲得與Xeomin 和Botox 相同的效力或效價(jià)，必須分別使用約2. 5倍量的Dysport18^P 10倍量的Myobloc 。在一個(gè)實(shí)施方案中，將這些市售制劑稀釋或濃縮至其中所含肉毒神經(jīng)毒素的預(yù)定濃度，根據(jù)所述第二樣品中所述肉毒神經(jīng)毒素的不同濃度來(lái)測(cè)定所述第二效果。繪制測(cè)得的效果對(duì)應(yīng)于肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線。分別通過(guò)所述第二數(shù)據(jù)集、所述校準(zhǔn)曲線，可確定第一樣品中肉毒神經(jīng)毒素的未知濃度。已發(fā)現(xiàn)，以至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml表示樣品(可為第一或第二樣品)中肉毒神經(jīng)毒素的濃度，本發(fā)明的方法可以有利地應(yīng)用。須指出，本應(yīng)用中給出的濃度均為小鼠LD5tl單位/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度至少為15。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度至少為20。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為10-1000。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為10-70。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為20-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二樣品為Xeomin'
在一個(gè)實(shí)施方案中，已發(fā)現(xiàn)如果將Xeomin 作為第二樣品，如果以10-70之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果，可獲得特別可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為25-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，已發(fā)現(xiàn)如果將BotoX'"作為第二樣品，如果以10-70之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果，可獲得可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為25-45。根據(jù)步驟(e)，如果第二樣品用于確定校準(zhǔn)曲線，與XeomhiR^Botox:'RMBttj二樣品具有更低濃度的或含有更低效力或效價(jià)的肉毒神經(jīng)毒素，為達(dá)到可與Xeomin 或Botoxs'誘導(dǎo)效果相比的第二效果的強(qiáng)度需要較高濃度的神經(jīng)毒素，即較高的LD5tl單位/ml值。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述第二樣品比Xeoniii '或Botox'K;具有更低的肉毒神經(jīng)毒素的濃度或效價(jià)，以20-400或100-800之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述第二樣品為Dyspord 20-400，或25-300，或30-250之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述第二樣品為Myobloc^，以100-800，或150-700，或200-600之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。在其它實(shí)施方案中，所述濃度范圍可為30-600，或30-400，或30-200，或30_100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決于與Xeomin'('或801(^19相比第二樣品中神經(jīng)毒素的效力或效價(jià)的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LD5tl單位為Xeomir^單位。根據(jù)本發(fā)明的第一變量，用于確定所述未知濃度的效果為肌肉組織的麻痹時(shí)間。測(cè)得的時(shí)間可以例如秒或分鐘計(jì)量。根據(jù)子變量，可基于肌肉收縮的距離(一旦收縮的距離等于0，則達(dá)到麻痹)，或基于肌肉抽搐頻率(一旦抽搐頻率等于0，則達(dá)到麻痹)確定麻痹時(shí)間。收縮距離可以例如厘米或毫米計(jì)量?！奥楸?的)時(shí)間”可被定義為達(dá)到最大抽搐一半的時(shí)間。這嚴(yán)格取決于毒素的濃度。根據(jù)本發(fā)明的其它變體，誘導(dǎo)的效果為肌肉組織收縮率的變化，或肌肉組織收縮的變化，或肌肉組織收縮力的變化，或肌肉組織終板電位或微型終板電位的變化。這些方法為本領(lǐng)域已知的，例如公開(kāi)于EP 1597584B1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效果(分別為誘導(dǎo)的第一和第二效果)為肌肉組織的麻痹時(shí)間?；旧希蛇x擇具有神經(jīng)肌肉特點(diǎn)的任何肌肉組織用于本發(fā)明方法中，也就是能響應(yīng)電刺激的肌肉組織。經(jīng)由肌肉組織，是指包括一種或多種含一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或粘附有神經(jīng)細(xì)胞的肌肉纖維標(biāo)本(preparation)，其可接受電刺激?？墒褂闷交『蜋M紋肌組織。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，肌肉組織包括肋間肌，如小鼠和大鼠的后肢肌肉和后肢趾長(zhǎng)伸肌，如小鼠和大鼠的后爪跖肌，如小鼠和大鼠的膈神經(jīng)偏側(cè)膈，如小鼠和大鼠的耳長(zhǎng)提肌，娃神經(jīng)肌接頭，雛雞頸二腹肌(biventer cervic muscle)。也可使用例如小鼠和大鼠的肋骨肌肉或腦組織，或海鰩(sea ray)的電器官。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)表明，使用小鼠的膈神經(jīng)偏側(cè)膈是一種適于測(cè)定梭菌毒性的工具。因此，它可用作確定梭菌毒性的檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于所述小鼠偏側(cè)膈檢測(cè)的可靠性，它可符合管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)證要求且滿足肉毒毒素A血清型或B血清型的安全及有效施用的需要。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偏側(cè)膈是嚙齒動(dòng)物如大鼠或小鼠的偏側(cè)膈。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偏側(cè)膈是小鼠的偏側(cè)膈。術(shù)語(yǔ)“小鼠或大鼠偏側(cè)膈”是指小鼠或大鼠的膈神經(jīng)偏側(cè)膈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一樣品中的梭菌毒素及所述第二樣品中的梭菌毒素是相同的梭菌毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一樣品中的梭菌毒素或神經(jīng)毒素和所述第二樣品中的梭菌毒素或神經(jīng)毒素彼此不同。為了本方法在實(shí)驗(yàn)上的實(shí)現(xiàn)，通常從動(dòng)物如小鼠或大鼠中摘取附著有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的肌肉組織，置于含有緩沖液如生理緩沖液的器官或組織浴中，對(duì)其中的條件如離子組成、葡萄糖、溫度、pH值和氧合作用(oxygenation)進(jìn)行控制,從而優(yōu)化組織的活力和性能。當(dāng)將肌肉連接到力傳感器上時(shí)，可以測(cè)定電刺激后的肌肉收縮力，這可直接測(cè)定毒素對(duì)神經(jīng)肌肉功能的影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液中的溫度為35_39°C，或36_38°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中所述溫度為36. 5-37. 5°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫度為或約為37°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液的pH值為7-8，或7. 2-7.8。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PH值約為7.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧合作用由含氧的混合氣體來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，氧合作用由二氧化碳和氧的混合氣體來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用含95份氧(基于體積)和5份二氧化碳(基于體積)的混合氣體。市售混合物已知為Carbogene。進(jìn)行電刺激以測(cè)定效果(分別為第二和第一效果)，基本上可使用引用的現(xiàn)有技術(shù)中的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法按照如下進(jìn)行，在步驟(b)或(g)中以至少等于超最大電壓的電壓進(jìn)行電刺激。采用超最大電壓被認(rèn)為是獲得肌肉組織最大抽搐反應(yīng)的最小電壓。一般地，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)幾次，結(jié)果取平均值，以獲得可靠的結(jié)果。所述電刺激可按照如下進(jìn)行，在至少等于該組織超最大電壓的電壓下，在一定的時(shí)間間隔進(jìn)行脈沖刺激。脈沖刺激是指持續(xù)一段時(shí)間的刺激作用彼此間隔一段無(wú)刺激作用的時(shí)間。該方法公開(kāi)于，例如G6sc.he丨等，Exp. Neurol, vol. 147,1,1997, Wohlfahrt 等，Naunyn-SchmiGdebergj s Arch Pharmacol(1997)355 :335-340?；蛘撸姶碳た蔀槌纱}沖刺激(train pulse stimulation)。該方法公開(kāi)于EPI 597 584 BI 中。在一個(gè)脈沖刺激的實(shí)施方案中，刺激的持續(xù)時(shí)間可以為lOiis-lms。期間，無(wú)刺激作用的持續(xù)時(shí)間可以為0. I-IOs0超最大電壓的范圍可以在例如lmV-15V之間。例如，通過(guò)兩個(gè)電極，以例如IHz頻率的脈沖例如連續(xù)電刺激所述肌肉組織。微電極可放置于或靠近神經(jīng)肌肉接頭，可以記錄自發(fā)及誘發(fā)的膜電位的胞內(nèi)記錄。這些膜電位是由乙酰膽堿激活的配體門控離子通道產(chǎn)生的，其反過(guò)來(lái)又受到毒素的影響。終板電位的分析可用于獲取與毒素對(duì)乙酰膽堿的量子釋放(quantal release)的效果有關(guān)的息。具體地，合適的肌肉組織，例如可從例如雄性或雌性小鼠切除左膈神經(jīng)偏側(cè)膈 (膈神經(jīng))，并放置于器官浴中。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種器官浴為含有克-林二氏溶液(Krebs-Ringer-Solution),或厄爾平衡鹽緩沖液(Earle ' s Balanced Salt Solution)(EBSS)，或生理鹽水的浴。所述溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。然后，按照已知的方法，分別在第一、第二樣品存在的情況下通過(guò)膈神經(jīng)刺激所述肌肉組織。采用已知的方法，例如引用的現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法，記錄并評(píng)價(jià)所述誘導(dǎo)的效果。肌肉組織可浸潰于緩沖液如生理緩沖液中。所述緩沖液可包括能量源。所述能量源可以為ATP能量源，例如以下的一種或多種ATP、糖如葡萄糖和/或肌酸、脂肪酸、氨基酸、糖原、表面活性劑和丙酮酸。所述緩沖液可為含氧的，特別是用于較長(zhǎng)檢測(cè)中。優(yōu)選地，可向器官浴中加入氧氣和葡萄糖(或其它ATP源)，以延長(zhǎng)所述肌肉組織的保質(zhì)期。添加表面活性劑尤其有助于減少泡沫，這些泡沫可能對(duì)本發(fā)明的方法有負(fù)面影響。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述表面活性劑為消泡劑。術(shù)語(yǔ)“消泡劑”包括所有影響包埋于液體中的氣泡表面張力的試劑。一種類型的消泡劑降低了包埋于液體中的氣泡表面的張力，從而破裂了氣泡。然而，消泡劑也可能增加氣泡表面的張力，使氣泡合并成較大的氣泡，其比小氣泡更容易從液體中逃逸。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測(cè)定表面張力的影響，如接觸角和潤(rùn)濕角測(cè)定。因此，消泡劑是防止形成泡沫形成或破裂已經(jīng)形成的泡沫的試劑。常用消泡劑為水不溶性油、二甲基聚硅氧烷和其它聚硅酮、醇類、硬脂酸鹽和乙二醇類。在一個(gè)實(shí)施方案中，從至少一種含硅化合物中選擇所述消泡劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種含硅化合物為硅氧烷。術(shù)語(yǔ)“硅氧烷”包括寡聚硅氧烷(oligosiloxanes)和多聚硅氧烷(polysiloxanes)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硅氧烷被烷基和/或芳基取代。這種硅氧烷是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢詰?yīng)用單個(gè)化合物形式或一種以上含硅化合物的混合物形式的含硅化合物。合適的硅化合物及合適的硅氧烷的實(shí)例可分別為a-(三甲基甲硅烷基)- _甲基聚[氧(二甲基亞硅烷)]和聚二甲基硅氧烷，但不限于此。這些化合物可市售獲得且作為藥物使用，例如商品名為_(kāi)■甲基娃油和_■甲基娃氧燒。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉，其它具有類似活性的化合物，如二甲基硅氧烷和二甲基硅油也可用于本發(fā)明的方法中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含器官浴的試劑盒，于其中刺激所述已暴露于梭菌神經(jīng)毒素的肌肉組織，其中測(cè)定所述刺激的效果(如上所述)，以及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，從而優(yōu)化濃度范圍內(nèi)，在該濃度范圍內(nèi)測(cè)定神經(jīng)毒素產(chǎn)生的效果以獲得可靠的結(jié)果。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括

(A)-用于刺激已暴露于梭菌神經(jīng)毒素的肌肉組織，以選擇所述神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的裝置；-用于測(cè)定并記錄所述效果的裝置；以及(B)計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。根據(jù)第四個(gè)方面，本發(fā)明還提供一種確定濃度范圍的改進(jìn)方法，在該濃度范圍內(nèi)，可在預(yù)定的置信區(qū)間或誤拒絕可能性內(nèi)，測(cè)定含有梭菌神經(jīng)毒素的第一樣品相對(duì)于含有梭菌神經(jīng)毒素的第二樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供確定濃度范圍的方法，其中在該濃度范圍內(nèi)，可測(cè)定含有梭菌神經(jīng)毒素的第一樣品相對(duì)于含有梭菌神經(jīng)毒素的第二樣品的效價(jià)，該方法包括以下步驟(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)以不同濃度的所述神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織；(h)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中所述濃度選自最佳擬合于所述第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍，且其中所述最佳擬合濃度范圍是按照統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)來(lái)確定的，其包括以下子步驟(a)-(S)(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在所述實(shí)施方案中，所述第二效果和所述第一效果在性質(zhì)上是相同的。為了優(yōu)化所述方法，可將上述方法與本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法結(jié)合使用。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，將本發(fā)明的方法用于質(zhì)量控制是有利的，即含梭菌神經(jīng)毒素的樣品相對(duì)于諸如生產(chǎn)過(guò)程中要求的參考標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)。
因此，在這方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明方法在質(zhì)量控制中的應(yīng)用，即含梭菌神經(jīng)毒素的樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，待確定其效價(jià)的樣品是忙存的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品已存放至少一小時(shí)，或至少一天。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為凍干樣品，或?yàn)橹亟M樣品。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明第一方面的方法的應(yīng)用，即參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度；或參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià) 。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及肌肉組織的應(yīng)用，尤其是小鼠或大鼠的偏側(cè)膈，用本發(fā)明的任一方法確定梭菌活性，或借助本發(fā)明的試劑盒確定梭菌活性。以下實(shí)施方案也屬于本發(fā)明，并且應(yīng)該理解以上描述的實(shí)施方案反之亦適用以下的方法。因此，本發(fā)明還涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，檢測(cè)第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素未知濃度的體外方法，該方法包括(a)將肌肉組織接觸第二樣品；(b)電刺激步驟(a)中所述肌肉組織；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中所述的肌肉組織；(h)測(cè)定步驟(g)中對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果；其中，在以至少為10的小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一效果與所述第二效果相同時(shí)確認(rèn)出所述濃度，并且其與所述第一樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度相等。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(k)和(I)(k)確認(rèn)出所述第一效果與第二效果相同時(shí)的濃度；(I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)之前，所述肌肉組織已進(jìn)行電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)中，所述肌肉組織已進(jìn)行電刺激。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)之前和在步驟(a)過(guò)程中和/或在步驟(f)之前和在步驟(f)過(guò)程中，所述肌肉組織已進(jìn)行電刺激。可在第二和/或第一樣品不存在或存在下，對(duì)所述肌肉組織進(jìn)行所述電刺激，前提是所述肌肉組織已暴露于所述第二和/或第一樣品中存在的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，檢測(cè)第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的體外方法，該方法包括
(i)在所述第二樣品存在下電刺激肌肉組織，選擇所述第二樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果，(ii)在所述第二樣品中不同的梭菌神經(jīng)毒素濃度下，測(cè)定(i)中的所述第二效果，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄第二數(shù)據(jù)集，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)選擇所述第一樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果，(V)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同時(shí)的濃度，和
(vi) (V)中所述濃度等于所述未知濃度，其中，在以至少為10的小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個(gè)濃度下確定所述第二效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定所述第二樣品中不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素的第二效果進(jìn)行步驟(e)或步驟(ii)中所述測(cè)定的第二效果的所述記錄，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線。因此，用步驟(e)或(ii)記錄的第二數(shù)據(jù)集繪制校準(zhǔn)曲線，借助該曲線分別通過(guò)步驟(k)和后續(xù)步驟(1)，步驟(V)和后續(xù)步驟(vi)確定所述第一樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，繪制生成校準(zhǔn)曲線，通過(guò)圖表分析進(jìn)行分別進(jìn)行步驟(k)-(l)以及步驟(V)和后續(xù)步驟(vi)的確認(rèn)和等于的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為至少15，或?yàn)橹辽?0。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度為10-1000。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二樣品的濃度為1070。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二樣品的濃度為15-60。在又一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為20-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述提到市售制劑可用作第二樣品。因此，第二樣品可以為Xeomin , Botox1(、Dy sport 、Myobioc 或 PurTox'在一個(gè)實(shí)施方案中，所用單位是Xeomin 單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些市售可獲得的制劑可稀釋或濃縮成本文包括的肉毒神經(jīng)毒素的預(yù)定濃度，且根據(jù)所述第二樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的各種濃度而進(jìn)行所述第二效果的測(cè)定。繪制所述測(cè)定的效果對(duì)應(yīng)于肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄成校準(zhǔn)曲線。分別用所述第二數(shù)據(jù)集，所述校準(zhǔn)曲線，確定第一樣品中肉毒神經(jīng)毒素的未知濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)如果將XeomirriM乍為第二樣品，如果在10-70的至少一個(gè)濃度下確定第二效果，可以得到特別可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為25-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)如果將Botox 作為第二樣品，如果在10-70的至少一個(gè)濃度下測(cè)定第二效果，可以得到可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為15-60。還是在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度為25-45。如果按照步驟(ii)，用第二樣品確定校準(zhǔn)曲線，第二樣品相比Xeomin 或Botox'6'具有更低濃度的或包含更低效力或效價(jià)的梭菌神經(jīng)毒素，為了使第二效果達(dá)到與Xeomin 或Botox 誘導(dǎo)的效果相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度需要較高的神經(jīng)毒素濃度，即更高的LD5tl單位/ml 值。 在一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品含有比Xeom in R或Botox a更低的肉毒神經(jīng)毒素的濃度或效價(jià)，在20-400，或100-800的至少一個(gè)濃度下確定第二效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品是Dysport'在20-400，或25-300，或30-250
的至少一個(gè)濃度下確定第二效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品是Myobloc'在100-800，或150-700，或200-600的至少一個(gè)濃度下確定第二效果。在其它實(shí)施方案中，濃度范圍可以為30-600，或30-400，或30-200，或30-100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決于與Xeoniii/或Botox*相比，第二樣品中神經(jīng)毒素的
效力或效價(jià)的濃度。如上所述，如果基于以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定所述第二樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果，可得到校準(zhǔn)曲線。例如，可以確定在指示的濃度范圍內(nèi)的IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟中誘導(dǎo)的所述效果。通過(guò)從校準(zhǔn)曲線確認(rèn)出其中所述第一和所述第二效果具有相同的值(例如相同的麻痹時(shí)間)的濃度，按照步驟(I)所述濃度即等于所述未知濃度，從而可確定第一樣品的所述未知濃度。所述確定的前提是，第一樣品中未知濃度的梭菌毒素對(duì)肌肉組織產(chǎn)生效果可通過(guò)所述校準(zhǔn)曲線定量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲知，必要時(shí)可對(duì)未知濃度的第一樣品稀釋或濃縮一次或幾次，從而達(dá)到一定濃度范圍，其與第二樣品具有可比性，即達(dá)到相同的第一和第二效果。然后，已知稀釋或濃縮系數(shù)，可計(jì)算確定未稀釋或未濃縮樣品中初始存在的神經(jīng)毒素的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的實(shí)施為，使用前述現(xiàn)有技術(shù)的方法，在至少等于超大電壓的電壓下，分別實(shí)施步驟(b)或(g)，⑴和(iii)的電刺激。在一個(gè)實(shí)施方案中，肌肉組織是小鼠橫隔膜。因此，參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法包括⑴在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側(cè)膈，選擇所述第二樣品對(duì)所述小鼠偏側(cè)膈誘導(dǎo)的第二效果，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素下，測(cè)定(i)中所述第二效果，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測(cè)定所述第一樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果，(V)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同時(shí)的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等于所述未知濃度，其中，在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二效、果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉組織是大鼠或小鼠膈神經(jīng)偏側(cè)膈，誘導(dǎo)效果是麻痹時(shí)間，且所述梭菌肉毒毒素是A血清型肉毒神經(jīng)毒素。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括參照第二樣品中A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中A血清型肉毒神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側(cè)膈，選擇所述第二樣品對(duì)所述小鼠偏側(cè)膈誘導(dǎo)的第二麻痹時(shí)間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素下，測(cè)定(i)中所述第二效果，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，
(iv)測(cè)定所述第一樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果，(V)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同時(shí)的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等于所述未知濃度，其中，在10-70，或15-60，或20-45以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二麻痹時(shí)間，其中第二樣品為Xeomin1IBotox^在一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是在16. 6小鼠LD5tl單位/ml至56. 3小鼠LD5tl單位/ml范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是在20小鼠LD5tl單位/ml至55小鼠LD5tl單位/ml范圍內(nèi)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是在25小鼠單位/mlLD5Q至50小鼠LD5tl單位/ml范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括參照第二樣品中A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中A血清型肉毒毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側(cè)膈，選擇所述第二樣品對(duì)所述小鼠偏側(cè)膈誘導(dǎo)的第二麻痹時(shí)間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素下，測(cè)定(i)中所述第二效果，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測(cè)定所述第一樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果，(V)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同時(shí)的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等于所述未知濃度，其中，在20-400，或25-300，或30-250以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二麻痹時(shí)間，其中第二樣品為Dysportl在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法包括參照第二樣品中B型肉毒毒素或A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中B血清型肉毒神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側(cè)膈，選擇所述第二樣品對(duì)所述小鼠偏側(cè)膈誘導(dǎo)的第二麻痹時(shí)間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素下，測(cè)定(i)中所述第二效果，繪制所述測(cè)定的第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測(cè)定所述第一樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果，(V)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同時(shí)的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等于所述未知濃度，其中，在100-800，或150-700，或200-600以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃
度下確定所述第二麻痹時(shí)間，其中第二樣品為MyobIoc'然而，確定神經(jīng)毒素濃度或神經(jīng)毒素效價(jià)的檢測(cè)方法不僅在前述描述的組織上進(jìn)行，也可在細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行。根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及基于細(xì)胞培養(yǎng)物確定梭菌神經(jīng)毒素活性的檢測(cè)方法，參照參考樣品中梭菌毒素的已知濃度，測(cè)定樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度。該方法應(yīng)用于蛋白的定量，如當(dāng)將對(duì)梭菌肉毒神經(jīng)毒素敏感的細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于所述神經(jīng)毒素時(shí)，從SNARE復(fù)合物的裂解物中得到的SNAP25。該方法也應(yīng)用于參照參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)。Pellet, S.，等，大鼠原代脊髓細(xì)胞(RSC)檢測(cè)方法和確定A型肉毒神經(jīng)毒素的小鼠生物檢測(cè)方法的比較，藥理學(xué)與毒理學(xué)方法雜志(Journal of Pharmacological andToxicological Methods) (2010), doi :10. 1016/j. vascn. 2010. 01. 003,提供了確定純化 A血清型肉毒神經(jīng)毒性效價(jià)的細(xì)胞檢測(cè)方法作為小鼠生物檢測(cè)方法的替代方法。Keller, J. E.，等，培養(yǎng)的脊髓細(xì)胞中肉毒神經(jīng)毒素作用的持久性，F(xiàn)EBS Letters456(1999) 137-142，公開(kāi)了肉毒神經(jīng)毒素A(BoNT/A)和肉毒神經(jīng)毒素E (BoNT/E)活性持久性不同的機(jī)制。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的方法，開(kāi)發(fā)一種可靠且精確的方法用于分別確定影響所述效價(jià)的樣品中梭菌神經(jīng)毒的效價(jià)和濃度，所述方法可用于管理目的。這種改進(jìn)的方法可滿足安全和有效施用的廣泛需要。通過(guò)本方法達(dá)到該進(jìn)一步目的，其將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于或接觸包含梭菌神經(jīng)毒素的樣品，其中在測(cè)定效果(其由所述梭菌神經(jīng)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞而產(chǎn)生)之前，用水介質(zhì)取代所述樣品，該水介質(zhì)為例如緩沖液，或例如不包含梭菌神經(jīng)毒素或所述梭菌神經(jīng)毒素的中性緩沖液，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)物在所述水介質(zhì)中暴露一段時(shí)間，例如大于I小時(shí)，或大于2小時(shí)，或大于3小時(shí)，或大于4小時(shí)，或大于5小時(shí)。測(cè)定之前,細(xì)胞培養(yǎng)物與所述水介質(zhì)接觸時(shí)間可達(dá)到100小時(shí)或甚至更多。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包含神經(jīng)毒素的樣品中暴露過(guò)或接觸后，與不包含梭菌肉毒神經(jīng)毒素的水介質(zhì)接觸，隨后在不含所述樣品的情況下測(cè)定所述效果，各自的劑量響應(yīng)曲線發(fā)生位移，從而本發(fā)明方法的靈敏度明顯增力口。尤其在所述樣品中以LD5tl小鼠單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下，靈敏度增加。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的效果的方法，其包括 (a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與包含所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸；(c)測(cè)定所述梭菌神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的所述效果；其中，
步驟(c)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行；并且在所述步驟(C)中的測(cè)定前和所述步驟(a)中的接觸后，所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不包含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸0. 5-100小時(shí)。在第二個(gè)方面中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，測(cè)定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中測(cè)定的對(duì)應(yīng)濃度下所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果；(k)確認(rèn)出所述第一效果與第二效果相同時(shí)的濃度；(I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度。其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行；并且在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不包含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸0. 5-100小時(shí)。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)的方法，該方法包括(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行；并且在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不包含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸0. 5-100小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍內(nèi)選擇所述不同濃度；(n)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；
(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；
( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個(gè)實(shí)施方案中，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是F-檢驗(yàn)，或X2-檢驗(yàn)，或t_檢驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，各子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率彡5 (以％表示)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(e ):( e )根據(jù)所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此間的相對(duì)位移，計(jì)
算第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效果(包括第一和/或第二效果)是來(lái)自SNARE復(fù)合物的蛋白裂解物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是SNAP25。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前，所述細(xì)胞培養(yǎng)物與所述梭菌毒素接觸5-45小時(shí)，或15-40小時(shí)，或25-35小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不包含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸0. 5-100小時(shí)，或1-95小時(shí)，或6-90小時(shí)，或7_80小時(shí)，或8-70小時(shí)，或9-60小時(shí)，或10-50小時(shí)，或11-50小時(shí)，或12-40小時(shí)，或15-40小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，裂解細(xì)胞培養(yǎng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸前，裂解細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定通過(guò)Western-Blot分析或ELISA方法進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物選自神經(jīng)細(xì)胞系或原代神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，記錄所述測(cè)定的第二效果，通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線記錄所述第二數(shù)據(jù)集。在一個(gè)實(shí)施方案中，在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少在一種濃度下測(cè)定所述第二效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是20-400，或100-800。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠LD5tl單位是Xeomin 單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭菌神經(jīng)毒素是肉毒毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素是選自A、B、C、D、E、F和G的血清型；或選自A、B、C、D、E、F和G血清型的肉毒神經(jīng)毒素經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)毒素是A或C或E血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)毒素不包含復(fù)合蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)物在本發(fā)明任一方法中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一、第二和第三個(gè)方面中任一方面的方法在控制包含梭菌神經(jīng)毒素的樣品效價(jià)中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是貯存的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是凍干樣品，或重組樣品。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的方法在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度測(cè)定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度中的應(yīng)用；或在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)測(cè)定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)中的應(yīng)用，例如，梭菌神經(jīng)毒素生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制。與現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)物的已知方法相比，根據(jù)本發(fā)明的方法定量梭菌肉毒神經(jīng)毒素的生物活性的準(zhǔn)確度和精確度明顯提高。本發(fā)明的方法可滿足管理要求。已發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用本文公開(kāi)的方法，可將現(xiàn)有技術(shù)中觀察到的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)物定量的 變化明顯減少至微小程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的效果的方法，包括(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與包含所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的效果。其中，步驟(C)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述樣品(根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)方面的方法，樣品可以為第一或第二樣品)接觸”是指在所述接觸中所述細(xì)胞培養(yǎng)物接收所述樣品中至少部分所述神經(jīng)毒素，即，包含于所述樣品的至少部分神經(jīng)毒素與細(xì)胞培養(yǎng)物的所述細(xì)胞中含有的合適受體結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“在不含樣品的情況下”是指在介質(zhì)中中測(cè)定步驟(C)中的效果，所述介質(zhì)通常為合適的緩沖液，其包含10wt%或更少的樣品，例如不含任何樣品或換句話說(shuō)不含任何樣品的神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)不是連續(xù)地，而僅僅是短暫地，暴露于(接觸)包含梭菌神經(jīng)毒素的樣品(根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)方面的方法，其可以為第一或第二樣品)。這是指將所述細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于神經(jīng)毒素預(yù)定時(shí)間，即步驟(a)中進(jìn)行接觸以使所述細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)暴露產(chǎn)生響應(yīng)，然后在不含所述樣品(根據(jù)本發(fā)明其它方面的方法，可以為所述第一或第二樣品)的情況下應(yīng)用以下描述的方法相應(yīng)地測(cè)定效果(根據(jù)本發(fā)明其它方面的方法，分別為第一或第二效果)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述測(cè)定之前，將所述細(xì)胞培養(yǎng)物從含有所述樣品的浴(bath)中移除，轉(zhuǎn)入如下所述的不含神經(jīng)毒素成分的浴中。之后，測(cè)定效果強(qiáng)度(當(dāng)樣品為第一或第二樣品時(shí)，其可以為第一或第二效果)，即對(duì)效果進(jìn)行定量。這是指在含有接收的神經(jīng)毒素的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生了對(duì)所述刺激的響應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有神經(jīng)毒素的成分，即樣品(可以為第一或第二樣品)被不含神經(jīng)毒素的成分替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)例如傾出將樣品從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除，并被如下所述的不含神經(jīng)毒素的成分替換。替換之后，測(cè)定效果強(qiáng)度(當(dāng)樣品為第一或第二樣品時(shí)，其可以為第一或第二效果)。術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素(或梭菌毒素)”包含梭菌毒素復(fù)合物和高純度神經(jīng)毒素，即不含任何其它梭菌蛋白的神經(jīng)毒素制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭菌神經(jīng)毒素是肉毒神經(jīng)毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型。術(shù)語(yǔ)“肉毒毒素復(fù)合物”包括與至少另一個(gè)非毒素蛋白有關(guān)的肉毒毒素。明顯地，本文所用術(shù)語(yǔ)肉毒毒素復(fù)合物包含450kDa和900kDa的肉毒毒素復(fù)合物，其例如可從肉毒桿菌的培養(yǎng)物中得到。以A型肉毒毒素復(fù)合物為基礎(chǔ)的制劑可市售獲得，例如易普森公司(Dysport )或愛(ài)力根公司(Botox )。以B型肉毒復(fù)合物為基礎(chǔ)的另一制劑可從SolsticeNeurosciences公司(MyoblocR)儀得。不包含其它任何梭菌蛋白的高純度A型神經(jīng)毒素
由梅爾茨制藥公司(Xeomin )提供。這是 改善一些類型局部肌張力障礙的首選藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肉毒神經(jīng)毒素是A、B、C、D、E、F和G血清型經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的衍生物。所述神經(jīng)毒素經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物是指經(jīng)丙酮酸化、磷酸化、硫酸化、脂化和/或糖基化修飾的衍生物。所述神經(jīng)毒素經(jīng)遺傳修飾的衍生物是指通過(guò)缺失、添加或替換所述血清型蛋白中含有的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行修飾的衍生物。這種經(jīng)修飾的毒素優(yōu)選具有生物活性。具有生物活性的毒素是能夠被細(xì)胞吸收的毒素，由此可通過(guò)蛋白水解切割一個(gè)或多個(gè)多肽，例如SNARE復(fù)合物中的SNAP25。可通過(guò)測(cè)定和定量蛋白水解切割的多肽例如SNAP25的濃度，計(jì)算所用毒素的濃度或效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的三個(gè)方面的任一種方法，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于(接觸)所述梭菌毒素5. 0-45小時(shí)，或15-40小時(shí)，或25-35小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不包含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸0. 5-100小時(shí)，或1-95小時(shí)，或6-90小時(shí)，或7_80小時(shí)，或8-70小時(shí)，或9-60小時(shí)，或10-50小時(shí)，或11-50小時(shí)，或12-40小時(shí)，或15-40小時(shí)。術(shù)語(yǔ)“水介質(zhì)”定義為含水的液體或流體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水介質(zhì)是緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是中性緩沖液。術(shù)語(yǔ)“中性”包括pH范圍為6-8，或 6. 5-7. 5，或約 7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水介質(zhì)的溫度是20_40°C，或25_40°C，或30_40°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度是約37 °C。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測(cè)定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸后，裂解細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語(yǔ)“裂解”是例如通過(guò)危害其完整的病毒、酶或滲透機(jī)制破壞細(xì)胞。含有裂解的細(xì)胞成分的液體稱為“裂解物”。例如，裂解物可用于Western和Southern印跡,分別分析單獨(dú)的或作為復(fù)合物的特定蛋白、脂質(zhì)和核苷酸的組分。裂解中，可使用公知的裂解緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)的接觸之前，裂解細(xì)胞培養(yǎng)物。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將所述細(xì)胞培養(yǎng)物在包含神經(jīng)毒素的樣品中暴露過(guò)或接觸后，與不包含梭菌肉毒神經(jīng)毒素的水介質(zhì)接觸，隨后在不含所述樣品的情況下測(cè)定所述效果，各自的劑量響應(yīng)曲線發(fā)生位移，從而本發(fā)明方法的靈敏度明顯增力口。尤其在所述樣品中以LD5tl小鼠單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下，靈敏度增加。例如，通過(guò)確定從SNARE復(fù)合物切割的蛋白如SNAP25，分別作為響應(yīng)、效果，該方法產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)是方法的靈敏度增加，尤其適用于較低濃度神經(jīng)毒素的區(qū)域。如果在較低濃度下確定效價(jià)，神經(jīng)毒素通常會(huì)顯示最大的差異，而在相當(dāng)高濃度下，效價(jià)會(huì)彼此趨于一致。靈敏度的增加可以更精確和更可靠地分析各自的劑量響應(yīng)曲線。反過(guò)來(lái)可使用相 對(duì)少量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如為實(shí)施本發(fā)明的任一種方法而不得不被處死的小鼠。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案不僅是技術(shù)方面，而且在倫理方面具有進(jìn)步。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靈敏度”是指生理學(xué)中普遍使用的含義，即它定義了細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)外部刺激響應(yīng)的能力。本文中，通過(guò)使細(xì)胞培養(yǎng)物與梭菌神經(jīng)毒素接觸來(lái)進(jìn)行外部刺激。在發(fā)明的范圍內(nèi)可選擇一定濃度范圍，例如相對(duì)較低濃度的梭菌神經(jīng)毒素濃度范圍，其中所述靈敏度是增加的，即可以確定響應(yīng)，否則不能確定則只能在非容忍偏差內(nèi)分別確定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，測(cè)定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果；(k)確認(rèn)出所述第一效果與第二效果相同時(shí)的濃度；(I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度。其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，確定第二和/或第一效果。這是指在步驟(a)和/或步驟(f)之后，分別從第一和/或第二樣品中移除所述細(xì)胞培養(yǎng)物，從上述的細(xì)胞培養(yǎng)物中移除第二和/或第一樣品。術(shù)語(yǔ)“確認(rèn)出所述第一效果與第二效果相同時(shí)的濃度”(步驟(k)和(I))是指所述第一和第二效果在性質(zhì)上和數(shù)量上相同，即所述誘導(dǎo)效果是例如蛋白或多肽的裂解物如SNARE復(fù)合物的SNAP25，所述效果有相同的測(cè)量值。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了能夠獲得可靠的比較結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)物分別暴露于第二和第一樣品中神經(jīng)毒素的時(shí)間應(yīng)該具有可比性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述暴露時(shí)間相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(e)中所述記錄測(cè)得的第二效果是通過(guò)測(cè)定所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素的第二效果，并繪制測(cè)得的所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行的。如上所述，如果所述第二樣品對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果是基于以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定的，那么可獲得校準(zhǔn)曲線。例如，可在選擇的濃度范圍內(nèi)以IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟確定所述誘導(dǎo)的效果。因此，根據(jù)步驟(e)中記錄的第二數(shù)據(jù)集，繪制校準(zhǔn)曲線，通過(guò)該校準(zhǔn)曲線，根據(jù)步驟(k)及后面的步驟(I)確認(rèn)出所述第一樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度。 在一個(gè)實(shí)施方案中，繪制生成的校準(zhǔn)曲線，依據(jù)步驟(k)-(l)，通過(guò)圖形分析完成確認(rèn)和等于的步驟。所述第一樣品的未知濃度可由校準(zhǔn)曲線上與所述第一和第二效果具有相同值的濃度來(lái)確定，例如，產(chǎn)生的SNAP25的濃度相同，根據(jù)步驟(I)所述濃度等于所述未知濃度。所述確定的前提是第一樣品中未知濃度的梭菌毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生效果，其可通過(guò)所述校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，必要時(shí)可對(duì)未知濃度的第一樣品稀釋或濃縮一次或多次，從而使達(dá)到的濃度范圍可與第二樣品進(jìn)行比較，即達(dá)到相同的第一和第二效果。然后，已知稀釋或濃縮系數(shù)，可通過(guò)計(jì)算來(lái)確定未稀釋或未濃縮的第一樣品中初始存在的神經(jīng)毒素的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述確認(rèn)和等于不是通過(guò)步驟(h)和后面的步驟(k)和(I)中僅一個(gè)濃度的單點(diǎn)測(cè)量，而是通過(guò)多個(gè)不同濃度的測(cè)量進(jìn)行的。鑒于管理機(jī)構(gòu)的要求，這一點(diǎn)尤為重要。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，最好優(yōu)化濃度范圍以使所述第二和第一樣品能夠進(jìn)行可靠的比較。這不僅適用于迄今已知的和商業(yè)化的梭菌神經(jīng)毒素制劑的生物效力的可比性，也適用于未來(lái)開(kāi)發(fā)的或正在開(kāi)發(fā)的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了優(yōu)化以小鼠LD5tl單位/ml表示的濃度范圍，從而使所述第二和第一樣品能夠進(jìn)行可靠的比較，最好首先確定步驟(e)和/或步驟(h)中記錄的校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差。運(yùn)用合適的逐步回歸分析，可生成回歸模型，以基于劑量響應(yīng)曲線預(yù)測(cè)未知毒素樣品的效價(jià)。采用這種方法，可確認(rèn)代表兩個(gè)不同數(shù)據(jù)群體的第一和第二樣品的濃度范圍，其中各自的劑量響應(yīng)曲線之間的相關(guān)性達(dá)到最大值，即確定為最佳擬合。在一個(gè)實(shí)施方案中，分別通過(guò)預(yù)定的回歸模型，以擬合曲線表示第一和第二樣品的各自數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍，以及在預(yù)定的置信區(qū)間分別線性化和平行化所述擬合曲線，可進(jìn)一步精確所述檢驗(yàn)。因此，根據(jù)第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)的方法，該方法包括(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸；
(h)測(cè)定步驟(g)中獲得的對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍選擇所述不同濃度；(n)通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)得到的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)得到的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個(gè)實(shí)施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，確定第二和/或第
一效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，測(cè)定效果。這是指在步驟(a)和/或步驟(f)之后，分別從第一和/或第二樣品中移除所述細(xì)胞培養(yǎng)物，或從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除第二和/或第一樣品。適合處理上述數(shù)序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是已知的，例如可能性-商-檢驗(yàn)。所述可能性-商-檢驗(yàn)的實(shí)例是已知的F-檢驗(yàn)。也可運(yùn)用例如X2-檢驗(yàn)(卡方檢驗(yàn)或X2-分布-檢驗(yàn))或t-檢驗(yàn)。所述檢驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是F-檢驗(yàn)。通過(guò)所述檢驗(yàn)，可確定在預(yù)定置信區(qū)間內(nèi)，取自兩個(gè)不同群體的兩個(gè)隨機(jī)樣本相對(duì)于其方差是否有本質(zhì)不同。因此，這種檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)兩個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本的差異，本文指第二和第一樣品的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了得到可靠結(jié)果，置信區(qū)間很寬。例如，誤拒絕概率相對(duì)較低。在一個(gè)實(shí)施方案中，誤拒絕概率< 5 (以％表示；(或0. 05))，置信區(qū)間彡95 (以％表示；(或0. 95))。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率彡5 (以％表示)。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟U)中的線性化是通過(guò)以最佳擬合直線表示各自數(shù)據(jù)集進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(S)中的平行化是通過(guò)確定最佳擬合直線的共同斜率來(lái)進(jìn)行。步驟(S )之后，根據(jù)所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對(duì)位移確定第一樣品和第二樣品的相對(duì)效價(jià)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在步驟(5 )之后進(jìn)一步包括步驟(e ):( e )根據(jù)所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此間的相對(duì)位移計(jì)算出第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“相對(duì)效價(jià)”是指在相同濃度下，分別在來(lái)自各自線性化和平行化的擬合曲線的相同濃度下，確定第一樣品相對(duì)于第二樣品的效價(jià)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二樣品的效價(jià)等于100%，則第一樣品的相對(duì)效價(jià)以％方式表示。例如，相對(duì)于第二樣品，第一樣品獲得了例如110%或90%的效價(jià)。應(yīng)用三分律即比例運(yùn)算法(the rule of three),通過(guò)分別稀釋具有110%效價(jià)的第一樣品至100%效價(jià),獲得目前未知的第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的有效濃度。測(cè)定單位變?yōu)橄鄬?duì)效價(jià)，數(shù)值表示為活性單位(效價(jià))，所述活性單位以參考標(biāo)準(zhǔn)(第二樣品)的活性(效價(jià))定義。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)效價(jià)表示為第一和第二樣品的效價(jià)的比值。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述模型用于預(yù)測(cè)所用神經(jīng)毒素劑量的對(duì)數(shù)值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，刺激效果的量和樣品中神經(jīng)毒素劑量的量均以對(duì)數(shù)值記錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，分別在第二樣品和第一樣品中至少三個(gè)不同濃度的梭菌神經(jīng)毒素下，分別測(cè)定第二效果和第一效果。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)集的所述記錄，各自校準(zhǔn)曲線的所述記錄，各自的校準(zhǔn)曲線分別以半對(duì)數(shù)圖的形式表示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以雙對(duì)數(shù)圖表示。確定相對(duì)效價(jià)的方法記錄在歐洲藥典。在一個(gè)實(shí)施方案中，以如10小鼠LD5tl單位/ml為起始濃度，確定相對(duì)效價(jià)的方法適用于整個(gè)數(shù)據(jù)集的范圍。之后，以大于10小鼠LD5tl單位/ml的值為起點(diǎn)，例如11、12、13、14、15、16、17小鼠LD5tl單位/ml。進(jìn)行迭代直至所用模型達(dá)到期望和要求的精度。在一個(gè)實(shí)施方案中，一旦通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定了最佳擬合及濃度范圍，任何含有未知濃度(對(duì)應(yīng)于有效濃度)梭菌神經(jīng)毒素的第一樣品可與根據(jù)本發(fā)明方法確定的在所述濃度范圍內(nèi)的第二樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線記錄所述測(cè)定的第二效果，通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線記錄所述第二數(shù)據(jù)集。相對(duì)效價(jià)評(píng)價(jià)的應(yīng)用，以及檢測(cè)中包含參考標(biāo)準(zhǔn)(第二樣品)，可形成更精確且更具重現(xiàn)性的評(píng)價(jià)，為減少動(dòng)物的使用提供了機(jī)會(huì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)通常通過(guò)合適的計(jì)算機(jī)程序和合適的計(jì)算機(jī)執(zhí)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用合適的包含用以實(shí)施所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的合適軟件工具的計(jì)算機(jī)程序來(lái)進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施本發(fā)明的方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二樣品選自可市售獲得的和注冊(cè)的肉毒毒素制劑。因這些產(chǎn)品已注冊(cè)并可分別用于藥物制劑和藥劑，它們分別包含明確限定的量和肉毒毒素濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，任何在標(biāo)準(zhǔn)條件下生產(chǎn)的肉毒毒素制劑均可使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述提及的市售制劑可用作第二樣品。因此，第二樣品可以為XeominJ\ BotoxK ^ DysportR, Myob丨ocK或PurToxA。這些制劑所用的肉毒毒素類
型或生物效力/活性即效價(jià)不同，例如肉毒神經(jīng)毒素的濃度或其所包含的肉毒類型不同。以小鼠LD5tl表示的小鼠單位為定義樣品中所含梭菌神經(jīng)毒素濃度的常用單位。LD5tl值表示將所述的量施用于小鼠群體的小鼠時(shí)，導(dǎo)致50%小鼠群體死亡的致死劑量。確定所述值的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。該方法記載于歐洲藥典中。已知，在基于肉毒神經(jīng)毒素產(chǎn)品上標(biāo)記的LD5tl單位有產(chǎn)品特異性，生產(chǎn)商特異性，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)不能互換。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文涉及的LD5tl單位是表征和標(biāo)UXeominx時(shí)確定的單位，例如第二樣品是Xeominsi。相應(yīng)地，涉及特定效果的單位是Xeomin 單位。因此，本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)可用于比較評(píng)價(jià)包含梭菌神經(jīng)毒素的任何樣品相對(duì)于Xeomin 的效價(jià)。該方法可直接將含有梭菌神經(jīng)毒素(未知濃度)的第一樣品以Xeomin 單位進(jìn)行比較。 Xeomin 和Botox 具有大致相當(dāng)?shù)男Я蛐r(jià)。為了得到與Xeomin w和Botox 相同的效力或效價(jià)，需分別應(yīng)用約2. 5倍量的DyspoiI^P 10倍量的Myobloc'在一個(gè)實(shí)施方案中，這些市售獲得的制劑被稀釋或濃縮成其中包括的梭菌神經(jīng)毒素的預(yù)定濃度，根據(jù)所述第二樣品中所述梭菌神經(jīng)毒素的不同濃度來(lái)測(cè)定所述第二效果。繪制測(cè)定的效果對(duì)應(yīng)于肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄校準(zhǔn)曲線。分別用所述第二數(shù)據(jù)集，所述校準(zhǔn)曲線，可確定第一樣品中肉毒神經(jīng)毒素的未知濃度。已發(fā)現(xiàn)，以至少10的小鼠LD5tl單位/ml表示樣品(可為第一或第二樣品)中肉毒神經(jīng)毒素的濃度，可有利地應(yīng)用本發(fā)明的方法。須指出，本應(yīng)用中給出的濃度均為小鼠LD5tl單位/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，除了神經(jīng)毒素外，樣品還包括水。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包括于水中的神經(jīng)毒素的溶液或懸浮劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中神經(jīng)毒素的所述濃度至少是15。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度至少是20。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濃度是10-1000。在一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是10-70。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是20-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二樣品足Xeomin 。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)Xeomin'R作為第二樣品時(shí)，如果以10-70之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果，可得到特別可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是25-45。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)Botox#作為第二樣品時(shí)，如果以10-70之間的至少一個(gè)
濃度確定第二效果，可得到可靠的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是15-60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度是25-45。根據(jù)步驟(e)，如果用第二樣品確定校準(zhǔn)曲線，與Xeomin 或Botox 相比，第二樣品具有更低濃度的或含有更低肉毒神經(jīng)毒素效力或效價(jià)，為達(dá)到與Xeomin 或Botox 誘導(dǎo)效果具有可比性的第二效果的強(qiáng)度需要較高濃度的神經(jīng)毒素，即較高的LD5tl單位/ml值。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品比Xeomin 或Botox 具有更低的肉毒神經(jīng)毒素的濃度或效價(jià)，以20-400或100-800之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品為Dysport ，以20-400，或25-300，或30-250
之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中第二樣品是Myoblock',以100-800，或150-700，或200-600之間的至少一個(gè)濃度確定第二效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濃度范圍可以為30-600，或30-400，或30-200，或30-100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決于與Xeomin 或Botox 相比，第二樣品中神經(jīng)毒素的
效力或效價(jià)的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，LD5tl單位是Xeomin 單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于所述細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)的可靠性，其可符合管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)證要求和滿足施用肉毒毒素如血清型A或血清型C或血清型E的安全性和有效性的需要。在又一個(gè)實(shí)施方案中，第一樣品中所述梭菌毒素與所述第二樣品中所述梭菌毒素是相同的梭菌毒素。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一樣品中所述梭菌毒素或神經(jīng)毒素與所述第二樣品中所述梭菌毒素或神經(jīng)毒素是彼此不同的。為了在實(shí)驗(yàn)上實(shí)現(xiàn)本方法，通常使用對(duì)暴露于肉毒毒素有響應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，SP肉毒毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生效果，如在SNARE復(fù)合物中蛋白或多肽裂解物。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)物”包括在有機(jī)體外的控制條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)物”是指培養(yǎng)的源自多細(xì)胞真核生物的細(xì)胞，尤其是動(dòng)物細(xì)胞。然而，該術(shù)語(yǔ)也包含植物、真菌和微生物包括病毒、細(xì)菌和原生生物的細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可從組織分離用于體外培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將組織塊置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基，生長(zhǎng)出的細(xì)胞用于進(jìn)行培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用破壞細(xì)胞外基質(zhì)的酶例如膠原酶、胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶進(jìn)行酶消化從軟組織中純化細(xì)胞。如果使用永久性細(xì)胞系，那么通常這種細(xì)胞系通過(guò)隨機(jī)突變或有意的(deliberate)修飾而具有無(wú)限增殖能力。細(xì)胞可在懸浮液貼壁培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞類型，細(xì)胞可以不粘附到表面上而在懸浮液中自然存活。粘附細(xì)胞需要表面，例如組織培養(yǎng)塑料或微載體(micocarrier),其被細(xì)胞外基質(zhì)成分包被以增加粘附性能,并提供生長(zhǎng)和分化所需的其它信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為使本發(fā)明的方法可在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞可在合適的溫度和混合氣體中生長(zhǎng)和維持，例如在37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每種細(xì)胞類型的培養(yǎng)條件都有很大不同，條件的變化對(duì)特定細(xì)胞類型會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的表型不同。除了溫度和混合氣體，培養(yǎng)體系中最普遍的變化因素是生長(zhǎng)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方的PH值、葡萄糖濃度、生長(zhǎng)因子和其它營(yíng)養(yǎng)物等可以不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知培養(yǎng)細(xì)胞的不同種類。收獲后，可將細(xì)胞培養(yǎng)物用于本發(fā)明中的任一種方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞系或原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”包括無(wú)限增殖的細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”包括從組織中直接獲得的非永久細(xì)胞系。、
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞包括脊髓神經(jīng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞如脊髓神經(jīng)細(xì)胞從嚙齒動(dòng)物中獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞為小鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞或大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，現(xiàn)有技術(shù)部分(見(jiàn)Pellet，S.等；Keller，J.E.等)所用的細(xì)胞培養(yǎng)物可用于本發(fā)明目的。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明還提供確定濃度范圍的改進(jìn)方法，其中在預(yù)定的置信區(qū)間或誤拒絕概率內(nèi)，可以確定包含梭菌神經(jīng) 毒素的第一樣品相對(duì)于包含梭菌神經(jīng)毒素的第二樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供可在確認(rèn)的濃度范圍內(nèi)確定包含梭菌神經(jīng)毒素的第一樣品相對(duì)于包含梭菌神經(jīng)毒素的第二樣品的效價(jià)的方法，該方法包括以下步驟(a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與第二樣品接觸；(c)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集；(f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸；(h)測(cè)定所述神經(jīng)毒誘導(dǎo)對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素下重復(fù)步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)定的所述第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中，所用濃度選自最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍，其中通過(guò)包括以下子步驟(a ) - ( S )的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定所述最佳擬合(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在所述實(shí)施方案中，所述第二和所述第一效果性質(zhì)上相同。為精確此方法，可將上述描述的方法與根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法結(jié)合使用。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，本發(fā)明的方法可有利地用于質(zhì)量控制，即包含梭菌神經(jīng)毒素的樣品相對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中要求的參考標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)。因此，在所述的方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明方法在質(zhì)量控制中的應(yīng)用，即包含梭菌神經(jīng)毒素的樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定忙存樣品的效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品已忙存至少一小時(shí)，或至少一天。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是凍干樣品，或重組樣品。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的方法，在參照第二樣品中已知濃度的梭菌神經(jīng)毒素確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度中的應(yīng)用；或在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素相對(duì)效價(jià)中的應(yīng)用。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及在本發(fā)明任一方法中，細(xì)胞培養(yǎng)物尤其是含有脊髓神經(jīng)細(xì)胞如來(lái)自于大鼠或小鼠的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，在確定梭菌活性中的應(yīng)用。以下實(shí)施方案也屬于本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解上述的實(shí)施方案反之可用于以下列出的方法中。圖I顯示以分鐘表示的麻痹時(shí)間(達(dá)到偏側(cè)膈初始收縮力一半時(shí)所需的時(shí)間)對(duì)應(yīng)于以器官浴中小鼠LD5tl單位表示的肉毒神經(jīng)毒素NT濃度(半對(duì)數(shù)量級(jí))的曲線圖。曲線■表示樣品，其中在神經(jīng)毒素存下測(cè)定誘導(dǎo)效果，以及曲線 表示樣品，其中組織已在包含神經(jīng)毒素的樣品中暴露15分鐘。隨后，將肌肉組織從浴(bath)中移除，樣品被不含神經(jīng)毒素的組分取代。進(jìn)行電刺激后，測(cè)定誘導(dǎo)效果。曲線表示根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的擬合線。實(shí)施例I制備小鼠偏側(cè)膈，并加入到盛有厄爾平衡鹽緩沖液(Earle' s Balanced SaltSolution)的器官浴中，用于標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定。在偏側(cè)膈的膈神經(jīng)上安裝鉬電極，通過(guò)鉬電極對(duì)神經(jīng)進(jìn)行電刺激，隨后對(duì)偏側(cè)膈收縮產(chǎn)生影響。將偏側(cè)膈夾在器官浴中。在夾持過(guò)程中，關(guān)閉刺激，但夾緊后立即開(kāi)啟。選擇刺激的電流強(qiáng)度，從而使膈肌的收縮力可被測(cè)定。在可測(cè)定持續(xù)的收縮力之后，將介質(zhì)更換為含有肉毒神經(jīng)毒素的介質(zhì)。針對(duì)每個(gè)濃度(每個(gè)濃度 至少數(shù)次)測(cè)定達(dá)到所述收縮力一半時(shí)所需的時(shí)間(麻痹時(shí)間)，并繪制其對(duì)應(yīng)于所述器官浴中添加的肉毒神經(jīng)毒素的濃度的曲線。
權(quán)利要求
1.測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的效果的方法，包括 (a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與含有所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸； (C)測(cè)定所述梭菌神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的效果； 其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行；以及 在步驟(C)所述測(cè)定之前，且在步驟(a)所述接觸之后，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸O. 5-100h。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度，該方法包括 (a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第二樣品接觸； (C)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集； (f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸； (h)測(cè)定對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果； (k)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同的濃度； (I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度； 其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行；以及在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)測(cè)定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之后，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸O.5-100h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)，該方法包括 (a)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第二樣品接觸； (C)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集； (f)使細(xì)胞培養(yǎng)物與所述第一樣品接觸； (h)測(cè)定對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的第一效果； (i)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(f)-(h)； (j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集；其中步驟(c)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行；以及在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)測(cè)定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之后，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸O.5-100h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)ー步包括步驟(m)和(η) (m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍中選擇所述不同濃度； (η)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(α)-(δ) (α)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍； (β)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍；(Y)分別線性化所述擬合曲線； (δ )平行化所述線性化的擬合曲線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為F-檢驗(yàn)，或\2_檢驗(yàn)，或卜檢驗(yàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中每個(gè)子步驟(α)-(δ)的誤拒絕概率為≤5 (以％表不)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(ε) (ε )根據(jù)所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此的相對(duì)位移，計(jì)算第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述效果是蛋白從SNARE復(fù)合體的裂解。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述蛋白為SNAP25。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測(cè)定之前，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與所述梭菌毒素接觸5-45h，或15-40h，或.25-35h。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測(cè)定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之后，使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與不含梭菌毒素的水介質(zhì)接觸O. 5-100h,或l-95h，或6-90h，或7_80h，或 8-70h，或 9-60h，或 10_50h，或 ll_50h，或 12_40h，或 15_40h。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測(cè)定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之后，對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行裂解。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法,其中所述測(cè)定采用Western-Blot分析或ELISA進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物選自神經(jīng)細(xì)胞系或初級(jí)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求2-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述記錄測(cè)得的第二效果是通過(guò)繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線進(jìn)行的，且記錄所述第二數(shù)據(jù)集是通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線進(jìn)行的。
16.根據(jù)權(quán)利要求2-15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD50單位/ml所表示的至少一個(gè)濃度下確定的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或.20-45。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述濃度為20-400，或?yàn)?00-800。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的方法,其中所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述梭菌神經(jīng)毒素為肉毒毒素。
21.計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施權(quán)利要求3-20任一項(xiàng)所述方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。
22.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的方法在控制含有梭菌神經(jīng)毒素的樣品效價(jià)中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其中所述樣品為貯存的樣品。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的應(yīng)用，其中所述樣品為凍干樣品或?yàn)橹亟M樣品。
25.權(quán)利要求I所述的方法在例如梭菌神經(jīng)毒素生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制中，在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度中的應(yīng)用；或在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)中的應(yīng)用。
26.測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的方法，包括 (a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸； (C)測(cè)定所述梭菌神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果； 其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第ー樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度，該方法包括 (a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸； (C)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集； (f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸； (h)測(cè)定對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果； (k)確認(rèn)出所述第一和第二效果相同的濃度； (I) (k)中所述濃度等于所述未知濃度； 其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)，該方法包括 (a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸； (C)測(cè)定所述神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第二效果，從而記錄第二數(shù)據(jù)集； (f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸； (h)測(cè)定對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的第一效果； (i)以不同濃度的所述梭菌神經(jīng)毒素重復(fù)步驟(f)-(h)； (j)記錄步驟(i)中在對(duì)應(yīng)濃度下測(cè)得的第一效果，從而記錄第一數(shù)據(jù)集； 其中步驟(c)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進(jìn)行。
29.權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)ー步包括步驟(m)和(η) (m)從最佳擬合于第一和第二數(shù)據(jù)集的濃度范圍中選擇所述不同濃度； (η)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(α)-(δ) (α)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍； (β)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數(shù)據(jù)集的數(shù)值范圍； (Y)分別線性化所述擬合曲線； (δ )平行化所述線性化的擬合曲線。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為F-檢驗(yàn)，或X2檢驗(yàn)，或t-檢驗(yàn)。
31.權(quán)利要求29或30所述的方法，其中每個(gè)子步驟(α)-(δ)的誤拒絕概率為^ 5 (以％表不)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28-31任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(ε): (ε )根據(jù)所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此的相對(duì)位移，計(jì)算第一樣品相對(duì)于第二樣品的相對(duì)效價(jià)。
33.根據(jù)權(quán)利要求26-32任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肌肉組織接受電刺激。
34.根據(jù)權(quán)利要求26-33任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)之后包括步驟(b)，或在步驟(a)之后包括步驟(b)且在步驟(f)之后包括步驟(g)； (b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織； (g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-34任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進(jìn)行，或其中步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進(jìn)行。
36.根據(jù)權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測(cè)定之前，使所述肌肉組織暴露于所述梭菌毒素5-30min。
37.根據(jù)權(quán)利要求26-36任一項(xiàng)所述的方法，其中所述記錄測(cè)得的第二效果是通過(guò)繪制所述第二效果對(duì)應(yīng)于濃度的曲線進(jìn)行的，且記錄所述第二數(shù)據(jù)集是通過(guò)記錄校準(zhǔn)曲線進(jìn)行的。
38.根據(jù)權(quán)利要求27-37任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個(gè)濃度下確定的。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述濃度為20-400，或?yàn)?00-800。
41.根據(jù)權(quán)利要求38-40任一項(xiàng)所述的方法,其中所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。
42.根據(jù)權(quán)利要求26-41任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和第二效果選自下組所述肌肉組織的麻痹時(shí)間、所述肌肉組織收縮率的變化、所述肌肉組織收縮距離的變化、所述肌肉組織收縮力的變化、所述肌肉組織在終板電位或微型終板電位中的變化。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述第一和第二效果為麻痹時(shí)間。
44.根據(jù)權(quán)利要求26-43任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肌肉組織選自肋間肌、后肢肌肉和后肢趾長(zhǎng)伸肌、后爪跖肌、膈神經(jīng)偏側(cè)膈、耳長(zhǎng)提肌、蛙神經(jīng)肌接頭、雛雞頸二腹肌、肋骨肌肉、腦組織或海鰩的電器官。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述膈神經(jīng)偏側(cè)膈來(lái)自大鼠或小鼠。
46.根據(jù)權(quán)利要求26-45任一項(xiàng)所述的方法，其中所述梭菌神經(jīng)毒素為肉毒毒素。
47.根據(jù)權(quán)利要求26-46任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電刺激在含有消泡劑的緩沖液 中進(jìn)行。
48.計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包括包含用于實(shí)施權(quán)利要求28-47任一項(xiàng)所述方法的軟件工具的計(jì)算機(jī)程序。
49.試劑盒，其包括 (A)-用于刺激已暴露于梭菌神經(jīng)毒素的肌肉組織，以選擇所述神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的裝置； -用于測(cè)定并記錄所述效果的裝置；以及 (B)-權(quán)利要求48所述的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。
50.權(quán)利要求26-47任一項(xiàng)所述的方法在控制含有梭菌神經(jīng)毒素的樣品效價(jià)中的應(yīng)用。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的應(yīng)用，其中所述樣品為貯存的樣品。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的應(yīng)用，其中所述樣品為凍干樣品或?yàn)橹亟M樣品。
53.權(quán)利要求26所述的方法在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的未知濃度中的應(yīng)用；或在參照第二樣品中梭菌神經(jīng)毒素的效價(jià)，確定第一樣品中梭菌神經(jīng)毒素的相對(duì)效價(jià)中的應(yīng)用。
全文摘要
測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)肌肉組織誘導(dǎo)的效果的方法，包括(a)使肌肉組織或細(xì)胞培養(yǎng)物與含有所述梭菌神經(jīng)毒素的樣品接觸；(c)測(cè)定梭菌神經(jīng)毒素對(duì)所述肌肉組織誘導(dǎo)的效果；其中步驟(c)在不含所述樣品的情況下進(jìn)行。
文檔編號(hào)A61B5/0488GK102639054SQ201080052392
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者卡爾·海因茨·艾斯勒, 哈羅德·泰勒, 杰德·J·曼德, 馬丁·韋 申請(qǐng)人:梅斯制藥兩合股份有限公司