專利名稱：中國南海信號芋螺神經(jīng)毒素基因Lt3.1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中國南海信號芋螺M-超家族毒素基因Lt3. 1及其編碼的多 肽序列l(wèi)t3a和該多肽的制備技術(shù)，以及該毒素在神經(jīng)生物學(xué)研究，離子通道藥 物和鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芋螺屬于軟體動物門腹足綱芋螺科(Conidae)，多數(shù)棲息在熱帶海洋的淺海 水域，少數(shù)在水深幾米至200余米的深水區(qū)，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名。 芋螺是比較年輕的生物，化石記錄證明芋螺屬最早出現(xiàn)于始新世(Eocene)，中 生代(tnesozoic)時(shí)期與陸地上恐龍同時(shí)滅絕的海洋捕食性軟體動物菊石的消失 客觀上促進(jìn)了芋螺的第一次大規(guī)模的物種形成。芋螺的第二次大規(guī)模的輻射始于 中新世(Miocene)，基本上持續(xù)到現(xiàn)在。每個(gè)芋螺物種的形成都伴隨全新的毒液 成分和有效的毒液輸送裝置的進(jìn)化。芋螺具有強(qiáng)大的自然進(jìn)化能力，全球有超過500種芋螺，單一種屬中就包括 數(shù)百種物種，這使芋螺成為海洋無脊椎動物中進(jìn)化最成功的生物。芋螺是食肉動 物，靠毒液來捕食，根據(jù)其捕食習(xí)性可分為食魚芋螺(piscivorous)、食螺芋螺 (molluscivorous)、食蟲芋螺(vermivorous)。食蟲性芋螺種類最多，占全部芋 螺種類的70%左右。食魚性芋螺占芋螺總數(shù)最少，但毒性最強(qiáng)，報(bào)道的芋螺致死 事件基本上是該類芋螺造成的，如織錦芋螺(C. t^"Je)、地紋芋螺 (61. ge。gr邵/ 〃s) 等。芋螺毒液是捕食與防御作用的主要武器，它是由許多單一毒肽組成的雞尾酒 樣的混合毒素，稱為芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特異地作用于神經(jīng)系統(tǒng) 的電壓門控和配體門控離子通道的不用亞型和遞質(zhì)受體，因此被廣泛用于神經(jīng)生 物學(xué)研究。芋螺毒素通常為由7 41個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽。大多富含 半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。與蜘蛛、蝎、蛇、?？仍S多動物的毒素比較(40 80個(gè)氨基酸左右)，芋螺毒素的肽鏈短得多，富含二硫鍵，分子結(jié) 構(gòu)更為緊密，生物活性更高。大多數(shù)芋螺毒素均由單一的mRNA編碼，原始的翻譯 產(chǎn)物是一種特定的多肽前體，約為70-120個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)蛋白酶水解后得到 成熟肽。二十世紀(jì)八十年代初，美國猶它大學(xué)01iveraBM學(xué)者實(shí)驗(yàn)室最早開展了芋螺 毒素全面系統(tǒng)研究工作。芋螺毒素以其分子小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對受體作用范圍廣并 且活性強(qiáng)的特點(diǎn)，已經(jīng)躍居于動物神經(jīng)毒素研究的首位。由于它們作用靶點(diǎn)廣泛， 能高度特異地結(jié)合細(xì)胞膜上祌經(jīng)遞質(zhì)和激肽的受體和各種離子通道， 一方面，可 以被直接開發(fā)成藥物或作為新藥的先導(dǎo)化合物應(yīng)用于臨床；另一方面，可以成為 神經(jīng)生物學(xué)中發(fā)現(xiàn)鑒定新受體，研究受體構(gòu)效關(guān)系及其調(diào)控細(xì)胞分子機(jī)理的重要 探針，并推動了離子通道的進(jìn)化研究。保守估計(jì)有50000種以上不同的芋螺毒素存在，至今已經(jīng)得到分離的芋螺毒 素有近千種，數(shù)十種芋螺毒素已申請美國專利。它們在鎮(zhèn)痛、局部缺血性保護(hù)、 癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，有的已進(jìn)入臨床研 究或己被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。目前，由Elan 公司進(jìn)行開發(fā)的CTX M V1IA (SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用 分布于神經(jīng)組織的N-型鈣離子通道，無需第二信使或蛋白，不成癮，已成為治療難治性神經(jīng)疼痛的新一代藥物，已通過了in期臨床試驗(yàn)，正式被FDA批準(zhǔn)上市。而另一個(gè)衍生于w-CTX C VID的化合物AM336作用類似于Ziconotide，因其對 N-鈣通道的選擇性更強(qiáng)，副作用更低，已經(jīng)批準(zhǔn)作為對抗嚴(yán)重抗嗎啡作用慢性疼 痛的治療藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。此外，Conantokin-G作為NMDA受體高度選擇 性的拮抗劑，對難以治療的癲癇有效，也己完成I期臨床試驗(yàn)。芋螺毒素藥用研 究的其他方向還有具有去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素， 可用于治療抑郁癥。以及抑制d1-腎上腺素受體的一些芋螺毒素，可用于治療 良性前列腺過度增生引起的尿失禁。與此同時(shí)，圍繞著增強(qiáng)藥物分子的穩(wěn)定性， 降低過敏反應(yīng)以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在進(jìn)行。 另一方面，芋螺毒素作為研究離子通道和膜受體的極好探針或工具，已經(jīng)成 為電壓門控型鈣離子通道(VSCCs)和N型乙酰膽堿受體(nAChRs)等通道、受體 鑒定和診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具，在神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。芋螺在我國南海海域有廣泛分布，已查明的芋螺約有80余種，主要分布在 臺灣、廣東、廣西、海南諸省以及西沙和南沙群島等。近年來國內(nèi)也開展了芋螺 毒素的生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及藥理作用等方面的研究工作。中國科學(xué)院北京 藥物化學(xué)研究所的陳冀勝研究員等人己自桶形芋螺(C.A"""'/7"S)、獨(dú)特芋螺 (C. cara"eri"/7e^s)、菖蒲芋螺(C. ye;a7J咖)、地紋芋螺等類芋螺中分離 鑒定了十余種新序列的芋螺毒素。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所的盧柏松、黃 培堂以及戴秋云等從我國的線紋芋螺、織錦芋螺中也發(fā)現(xiàn)了一些新的毒素成分和 基因序列。熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)彭世清、羅素蘭等己從菖蒲芋螺基因組中克隆到兩個(gè)新 芋螺毒素基因(GenBank登記號AY316159， AY316160);同時(shí)還從海南產(chǎn)的大理 石芋螺股mw re"5)、幻芋螺(C歷a^A9)、信號芋螺(C7i"e/^iA )、勇 士芋螺(C.肌7es)、獨(dú)特芋螺、織錦芋螺、桶形芋螺、疵篙芋螺(Ch'7A/"s) 等共12個(gè)種中分別發(fā)現(xiàn)了多種具有藥用功能的芋螺毒素及其基因。雖然我國有 著豐富的芋螺資源，但由于起步較晚，目前對于芋螺毒素的研究尚處于初期階段， 有著廣闊的研究空間和開發(fā)前景。由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能方面差異較大，具有種類繁 多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜和高度遺傳多樣性特征。構(gòu)建信號芋螺毒管cDNA文庫可以系統(tǒng)地 研究食蟲芋螺的毒素組成、表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)新的食蟲芋螺特有的毒素序列。迄今為 止，國外已構(gòu)建了多種芋螺的cDNA文庫，中國南海信號芋螺是一種食蟲性芋螺， 世界上尚沒有關(guān)于它的毒素研究的報(bào)道。因此，開展我國南海信號芋螺毒素的生物化學(xué)、藥理學(xué)尤其是其分子生物學(xué) 和基因工程技術(shù)領(lǐng)域的探索研究將有助于對新毒素分子相應(yīng)受體及其作用機(jī)制 的深入研究，而且可為我國芋螺海洋資源的藥用開發(fā)利用提供重要理論依據(jù)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的中國南海信號芋螺M-超家族毒素基因 Lt3. 1及其編碼的多肽序列l(wèi)t3a及其片段、類似物和衍生物。 本發(fā)明的另一目的是提供該多肽的分離純化方法。 本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這些多肽的用途。本發(fā)明的第一方面，提供一種新的神經(jīng)毒素多肽，其包括含有序列表〈400〉2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性變異多肽、或其活性衍生物。 上述的新的祌經(jīng)毒素多肽優(yōu)選自以下組之一(a) 由序列表〈400〉2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b) 將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或舔加 而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。本發(fā)明的第二方面，提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含有選自以下組之一核苷酸序列(a) 編碼上述多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳的，該多核苷酸編碼〈400〉2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的第三方面，提供上述的神經(jīng)毒素多肽的成熟肽 DECC1EQWCDGACDCCS(其中其中為羧化谷氨酸，"￡"為羥化脯氨酸) 及其修飾物，以及含有上述成熟肽片段的多肽。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供上述多肽的用途本發(fā)明獲得的中國南海信號芋螺 神經(jīng)毒素多肽的成熟肽是一種神經(jīng)毒素lt3a(注由于前體肽和成熟肽畢竟是兩種不一樣的多肽，為了區(qū)分，前體肽在本專利申請中叫做神經(jīng)毒素多肽，而其成熟肽叫做神經(jīng)毒素lt3a)，具有生物活性。該神經(jīng)毒素具有鎮(zhèn)痛作用。分離純化 的lt3a能增大鈉離子通道的開放電流。因此，本發(fā)明的中國南海信號芋螺神經(jīng) 毒素lt3b可用于制備祌經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和鎮(zhèn)痛藥物。


圖1為信號芋螺粗毒經(jīng)S印hadex G25分離的層析峰2為芋螺粗毒凝膠過濾后洗脫各峰的電泳圖1: G25峰III經(jīng)過1KD超濾膜超濾后；2: G25峰I; 3: G25峰II圖3為凝膠色譜II號峰的離子交換層析4為芋螺毒素lt3a高效液相色譜5為芋螺毒素lt3a的MOLDI-TOF質(zhì)譜6為芋螺毒素lt3a對大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞電壓門控鈉離子通道電流的影響圖6A鉗制電壓為-80mV,刺激電壓從-80mV至+30mV，脈沖間隔為10mV,刺 激電壓的脈沖寬度為100ms。對照和加IOO nM lt3a后電流峰形的變化圖6BI-V曲線表明了對照和加100 nM 1t3a 20 min后峰電流的變化圖7為重組芋螺毒素1t3a生理模型上的鎮(zhèn)痛藥效 NS:空白對照組，H: lt3a樣品高劑量組，M: lt3a樣品中劑量組，L: lt3a樣 品低劑量組具體實(shí)施方式
在本發(fā)明申請中，"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明 的多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可 以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基) 被取代，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(m)成熟多肽與另外一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列 或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。 本發(fā)明中的多核苷酸指RNA序列、DNA序列或cDNA。本發(fā)明用構(gòu)建cDNA文庫的方法，從中國南海信號芋螺毒管中克隆得到的芋 螺毒素M-超家族成員的基因Lt3. 1，其DNA序列如序列表中〈400〉1序列所示。上述本發(fā)明基因編碼的多肽的氨基酸序列如序列表〈400〉2所示，該多肽是 一前體肽，其成熟肽(神經(jīng)毒素lt3a)的氨基酸序列如序列表中〈400〉3序列所 示該成熟肽由n個(gè)氨基酸組成，分子量為1964.85道爾頓。本發(fā)明所選擇的信號芋螺屬于中國南海食蟲性信號芋螺(Co/7〃s "'"eratos)，采自海南省三亞市。中國南海信號芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建首先分離信號芋螺毒管，提取總 RNA。取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈產(chǎn)物。再取cDNA用于連接反應(yīng)，轉(zhuǎn) 化液分別涂板，其余用于搖總庫菌液，從平板上挑取單克隆保種。本發(fā)明通過對以上重組克隆大規(guī)模序列測定，得到EST序列編碼中國南海信 號芋螺神經(jīng)毒素M-超家族成員基因，命名為Lt3. 1(其DNA序列如序列表中〈400〉1序列所示)。新基因編碼的前體肽的氨基酸序列如序列表〈400〉2所示，而該前體 肽的成熟肽氨基酸序列如序列表中〈400〉3序列所示由17個(gè)氨基酸組成，分子量 為1964.85道爾頓，具有典型芋螺毒素一級結(jié)構(gòu)的特征，分子內(nèi)具有三對二硫鍵。本發(fā)明通過分離純化得到了一條多肽lt3a， DgCCEEQWCDGACDCCS，分 子量為1964.85道爾頓，具有翻譯后修飾，其中其中為羧化谷氨酸， 為羥化脯氨酸。其分子內(nèi)第一個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸成一對二硫鍵，第二個(gè)和第五 個(gè)半胱氨酸成一對二硫鍵，第三個(gè)和第六個(gè)半胱氨酸成一對二硫鍵。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何 形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:信號芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定總RNA的提取和cDNA合成分離中國南海信號芋螺毒管，參照Gibco BRL 公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行毒管總RNA提取。取1 U g信號芋螺毒管總RNA 以SMART III 0lignuclotide(5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3') 和CDSIII/3' PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3。N—,N-3')進(jìn)行 逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10nl cDNA第一鏈產(chǎn)物。信號芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定取cDNA1.5pl用于連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化 后涂板。從平板中挑取單克隆保種并隨機(jī)挑取一定數(shù)目的單克隆進(jìn)行測序和生物 信息學(xué)分析。實(shí)施例2:信號芋螺粗毒提取將新鮮分離的毒液管放置于培養(yǎng)皿，采用三種不同方式獲取粗毒。1)擠出 法。捏住毒囊一端，將漿液從毒液管擠出。2)勻漿法。將毒管及毒囊解剖出來 后，放到冰浴的燒杯里，用勻漿器粉碎。3)液氮碾磨法。在碾缽中加入液氮， 使毒管和毒泡磨成粉末。將三種方法獲得的毒液分別在1.1%的乙酸緩沖液中萃 取，反復(fù)離心收集上清液，即時(shí)上凝膠層析或者放置于-20。C冷凍保存。實(shí)施例3:凝膠色譜分離純化將實(shí)施例2萃取的粗毒用S印hadexG-25層析柱(用1. 1%的乙酸溶液平衡) 進(jìn)行初步分離，流速為lml/min。信號芋螺粗毒經(jīng)S印hadex G25分離的層析峰圖如圖1所示。收集各個(gè)洗脫峰，然后用SDS-PAGE電泳確定每個(gè)峰所含組分的 大致分子量，結(jié)果如圖2所示。將收集的各峰用Tris-HC1調(diào)節(jié)pH到8. 8，然后分別上樣到Q s印harose high performance陰離子交換柱(20X2. 6cm，預(yù)先用pH8. 8的50mM Tris-HCl溶液 平衡)進(jìn)行離子交換層析，同時(shí)收集穿透峰；流速lml/min。用0 lMNaCl溶液 進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰。其中，G25凝膠色譜II號峰7的離子交換層析 圖分別如圖3所示。實(shí)施例4: RP-HPLC分離純化、質(zhì)譜與測序?qū)㈦x子交換層析中收集的各組分用Stirred cell 8200超濾裝置(配截留分子量為1KD的濾膜)過濾濃縮。濾缸內(nèi)液用Hypersil BDS C18 RP-HPLC柱再次純化，所用的平衡液為BufferA(O. 1%TFA)，洗脫液為Buffer B(含0.1%TFA 的乙腈)，流速為0.8ml/min。高效液相色譜圖如圖4所示。圖4所示的高效液 相色譜圖是收集圖3的V峰來進(jìn)行的。收集洗脫峰，用MOLDI-TOF質(zhì)譜分析后， 在ABI 492cLC型蛋白質(zhì)序列測定儀上用Edm肌降解法測定氨基酸序列，獲得 的信號芋螺毒素lt3a的氨基酸序列與序列表400〈3〉一致。實(shí)施例5:信號芋螺毒素lt3a對鈉離子通道的作用選用細(xì)胞表面光滑的DRG細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞電流膜片鉗實(shí)驗(yàn)。利用內(nèi)液中CsCl 與外液中TEA-Cl阻斷鉀離子電流，內(nèi)液中NaF和外液中LaCl阻斷鈣離子電流。 細(xì)胞鉗制電壓為一80mV,刺激電壓為一80mV到+ 30mV，步階為10mV，刺激電壓 脈沖寬度為100mS。記錄的電流為鈉內(nèi)向電流。將用上述方法分離純化獲得的新 的芋螺毒素lt3a加到細(xì)胞外液中至終濃度為100nM，約20min后，當(dāng)芋螺毒素 均勻擴(kuò)散到溶液中后，鈉通道的開放電流比對照有明顯的增大，增大比例15%左 右。實(shí)施例6:生理模型上的中樞鎮(zhèn)痛藥效實(shí)驗(yàn)法 基本方案小鼠熱板法選取NIH系小鼠100只，體重20土2g,全為雌性。實(shí)驗(yàn)前先對小鼠進(jìn)行篩選，將小鼠放于事先加熱到55'C的熱板測痛儀上，用秒表記錄小鼠自投入熱板至出 現(xiàn)舔后足的時(shí)間為該鼠的痛閾值，測定2次，挑選出痛閾值不超過20s的小鼠為 合格者進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將篩選后的小鼠隨機(jī)分成4組，即空白對照組、lt3a樣 品低、中、高劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行腹腔注射給藥，其中l(wèi)t3a 樣品低、中、高劑量組給予劑量分別為0. 07mg/kg， 0. 14mg/kg， 0. 28mg/kg，空 白對照組給予等體積的生理鹽水。于注射給藥后0.5h、 lh、 L5h、 2h、 3h測定 一次，如痛閾值超過60s則按60s計(jì)算(注意時(shí)間不宜太久以免燙傷小鼠足部)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并計(jì)算痛閾提高百分率。痛閾提高百分率=(用藥 后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)+用藥前平均痛閾值乂 100%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，空白對照組小鼠給藥前后的痛閾值基本穩(wěn)定，提示經(jīng)過篩 選后的小鼠對熱刺激反應(yīng)的耐受性較好。受試樣品lt3a的低、中、高劑量組小 鼠給藥后的痛閾值均不同程度的提高，其中給藥0. 5h時(shí)，受試樣品lt3a的三個(gè) 劑量組小鼠的痛閾值與同期空白對照組相比，具有顯著性差異 (P〈0. 01, P<0. 001);給藥lh和2h時(shí)，受試樣品lt3a的中、高劑量組小鼠的痛 閾值與同期空白對照組相比，具有顯著性差異(P〈0. 01, P<0. 001);給藥3h時(shí)， 受試樣品的痛閾值降至最低，其中l(wèi)t3a的中、高劑量組與空白對照組相比，具 有顯著性差異(P〈0. 05, P<0. 001);由此可初步認(rèn)為lt3a的中、高劑量組具有一 定的鎮(zhèn)痛作用。(見圖7)序列表〈110〉中山大學(xué)〈120〉中國南海信號芋螺神經(jīng)毒素基因U3. 1及其應(yīng)用〈160〉3〈210〉1<211〉479〈212〉DNA〈213〉中國南海信號芋螺(Conus 7itterarw)〈400>1gtcacaccac ggctacagct ctgtixacct gtagaacgac ttgcacgctx tgctcgtagc tttgctgatc gcactctggtcagccagacgttctggtcttcaagggacga gcccaacatc tcatggatta tcagattttgacaaggaaca gcgtgg卿g gtttcccctgatgctgtgaa c卿gcggtgtCgCgCCCElC tgEL"tCttttCgtcaacccca3ggttCgtg3 ELC犯CgCtCgccgcaatggt tgctgggcgg gtctcttgtccagtcacgcc tgttgaaaat 犯ctggatac 鄉(xiāng)3aaggag gcgacggagc ttttatccac taagaatg8C tgaccaasct犯gagcagac 60 gggagtgctg 120 agatcgacct 180 ggg^t犯g3 240 ttgtgactgc 300 aaccacagcg 360 gaacatgatt 420 ccnga犯犯 479<210〉2〈211〉69〈212〉PRT〈213〉中國南海信號芋螺(Conus 7i"ers/7A9)〈400〉2Met Leu Lys Met Gly Val Leu Leu Phe Thr Phe1 5 10Pro Leu Thr Thr Leu Glu Leu Asp Thr Asp Arg20 25 His Ala Ala lie Lys Gin Asp Leu Lys Pro Gin35 40 lie Arg Leu His Ala Pro Arg Asp Glu Cys Cys50 55 Cys Asp Gly Ala Cys Asp Cys Cys Ser65 69Leu Val Leu Phe 15Pro Val Glu Arg 30Glu Arg Arg Gly 45Glu Pro Gin Trp 60〈210〉3<211〉17<212>PRT〈213〉中國南海信號芋螺(Conus h'"erar〃s) <220>〈221〉M0D一RES <222〉(2, 5, 6)〈223〉羧化谷氨酸，羥化脯氨酸，羧化谷氨酸 〈400>3Asp Glu Cys Cys Glu Pro Gin Trp Cys Asp Gly Ala Cys Asp Cys 15 10 15Cys Ser1權(quán)利要求
1、一種神經(jīng)毒素多肽，其包括含有序列表&lt;400&gt;2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性變異多肽、或其活性衍生物。
2、 按照權(quán)利要求1所述的神經(jīng)毒素多肽，其特征在于該神經(jīng)毒素多肽選自以下組之一(a) 由序列表<400〉2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b) 將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或舔加 而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
3、 一種多核苷酸，該多核苷酸包含有選自以下組之一核苷酸序列(a) 編碼權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4、 按權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于該核苷酸是編碼序列表〈400〉2所示的氨基酸序列的多核苷酸。
5、 權(quán)利要求2的所述的神經(jīng)毒素多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表 400〈3>所示。
6、 權(quán)利要求l、 2或5所述多肽作為神經(jīng)生物學(xué)工具藥物和鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用。
7、 權(quán)利要求5所述的神經(jīng)毒素多肽的成熟肽片段DgCCiEQWCDGACDCCS， 其中為羧化谷氨酸，為羥化脯氨酸，用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的 工具藥和鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求l、 2或5所述多肽作為增加鈉離子通道開放電流的試劑的應(yīng)用。
9、 權(quán)利要求l、 2或5所述多肽作為離子通道類型的檢測的探針的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的中國南海信號芋螺M-超家族毒素基因Lt3.1及其編碼的多肽序列l(wèi)t3a，以及該多肽在制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫的方法，從中國南海信號芋螺毒管中克隆得到
文檔編號C07K14/435GK101220089SQ200710031779
公開日2008年7月16日 申請日期2007年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者任政華, 劉君梁, 周茂軍, 孫丹丹, 徐安龍, 曾夏蕓, 磊 王, 皮燦輝 申請人:中山大學(xué)