專利名稱：包含IL-15受體α和/或編碼IL-15受體α的核酸分子的疫苗和免疫治療劑,以及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及改進的疫苗，用于使個體對免疫原預防性和/或治療性免疫的改進的方法，以及改進的免疫治療組合物和改進的免疫治療方法。發(fā)明背景
免疫治療是指調節(jié)人的免疫反應來產生需要的治療效果。免疫治療劑是指當對個體施用時，充分調節(jié)所述個體的免疫系統以最終減少與不希望的免疫反應相關的癥狀或因増大需要的免疫反應而最終減輕癥狀的組合物。在一些情況下，免疫治療是接種方案的一部分，在所述接種方案中，對個體施用的疫苗使所述個體暴露于免疫原，從而在此類情況下，所述個體對所述免疫原產生免疫反應，免疫治療劑增大了免疫反應和/或選擇性地增強了一部分免疫反應(諸如細胞免疫(cellular arm)或體液免疫(humoral arm)),所述免疫反應是治療或預防特定的病狀、感染或疾病所需要的。可通過遞送調節(jié)人的免疫反應從而誘導改進的免疫反應的藥劑來改進疫苗方案。在對個體施用的疫苗使所述個體暴露于免疫原從而所述個體對所述免疫原產生免疫反應的一些接種方案中，所提供的藥劑增大免疫反應和/或選擇性地增強一部分免疫反應(諸如細胞免疫或體液免疫)，所述免疫反應是治療或預防特定的病狀、感染或疾病所需要的。疫苗可用于使個體對靶抗原(諸如過敏原、病原體抗原或與涉及人類疾病的細胞相關的抗原)免疫。與涉及人類疾病的細胞相關的抗原包括癌癥相關的腫瘤抗原和與涉及自身免疫疾病的細胞相關的抗原。在設計此類疫苗吋，已認識到，在接種個體的細胞中產生靶抗原的疫苗可有效誘導免疫系統的細胞免疫。具體來講，活減毒疫苗、使用無毒載體的重組疫苗和DNA疫苗各自在接種個體的細胞中引起抗原的產生，從而產生免疫系統的細胞免疫的誘導。另ー方面，雖然死疫苗或滅活疫苗和僅包含蛋白質的亞單位疫苗會誘導有效的體液反應，但是它們并不誘導良好的細胞免疫反應。為了提供保護避免病原體感染以及提供用于治療病原體感染、癌癥或自身免疫疾病的有效的免疫介導治療，細胞免疫反應往往是必要的。因此，往往優(yōu)選在接種個體的細胞中產生靶抗原的疫苗，諸如活減毒疫苗、使用無毒載體的重組疫苗和DNA疫苗。通過DNA疫苗技術來產生有效的⑶8+T細胞反應是DNA疫苗開發(fā)者追求的目標。據報道，在HIV模型以及其它病毒感染中，⑶8+T細胞有助于控制人(Koup等，1994 ；Cao等，1995 ；Musey 等，1997 ；0gg 等，1998 ；Betts 等，1999)和非人靈長類動物模型(Jin 等，1999 ；Schmitz 等，1999 ；Barouch 等，2000 ；Amara 等，2001 ；Shiver 等，2002)的病毒復制。已將許多不同的策略與DNA疫苗技術一起使用，這些策略包括改進的遞送技術、增強的構建體設計、異源預激-加強策略(heterologous prime-boost strategies)和使用分子佐劑。包括趨化因子和細胞因子的分子佐劑可以合并到疫苗策略中從而使免疫反應偏向細胞免疫或體液免疫。諸如IL-12和IL-15的細胞因子可有效增強鼠科和非人靈長類動物模型中的免疫反應(Morrow和Weiner, 2008)。已證實白細胞介素-15 (IL-15)在⑶8+T細胞的產生和維持中發(fā)揮作用，因為其由共用的β Y鏈來傳導信號，所述共用的β Y鏈還由IL-2所利用。已證實IL-15在預激(Priming)自然殺傷細胞和⑶8+T細胞期間經由IL_15Ra反式遞呈(trans-presented)在抗原遞呈細胞的表面上(Dubois 等，2002 ；Koka 等，2004 ；Lucas 等，2007 ；Sato 等，2007)。近期還證實了 IL-15Rci在IL-15分泌的調控中發(fā)揮作用(Duitman等，2008)。據認為，這種細胞表面復合物允許IL-15由促進細胞分裂和這些細胞存活的記憶CD8+T細胞上的β Y 受體來傳導信號(Lodolce 等，1998 ;Kennedy 等,2000 ;Lodolce 等,2001 ;Burkett 等，2003 ；Burkett 等，2004 ；Sandau 等，2004 ；Schluns 等，2004a ；Schluns 等，2004b)。與單獨的任何ー種分子相比，一起作為復合物的IL-15和IL-15RCI顯示增強的穩(wěn)定性和分泌
(Bergamaschi 等，2008)。就質粒編碼的IL-15在接種模型中的使用來說，早前已報道了使用其作為HIV-I疫苗佐劑來增強小鼠的溶胞和記憶CD8+T細胞反應(Oh等，2003 ；Kutzler等，2005 ；Zhang等，2006 ；Calarota等，2008 ；Li等，2008)。對恒河猴的研究也證實IL-15增強CD4+T細胞的效應子功能的能力(Picker等，2006)以及救援效應子⑶4+和⑶8+T細胞兩者的雙重IFN- Y /TNF反應的能力(Halwani等，2008)。重要地是，對恒河猴加用具有SIV/HIV抗原的pIL-15在SHIV89. 6p攻毒之后產生增強的保護(Boyer等，2007)。雖然此類疫苗常常有效地使個體對病原體感染或人類疾病預防性或治療性免疫，但是仍需要改進的疫苗。需要產生增強的免疫反應的組合物和方法。仍需要改進的策略來使有效的DNA疫苗成為可能，包括增強對DNA疫苗的免疫反應的新佐劑。同樣，雖然ー些免疫治療劑可用于調節(jié)患者的免疫反應，但是仍需要改進的免疫治療組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及核酸分子，其包含編碼具有IL-15Ra免疫調節(jié)功能和/或IL-15結合功能和/或與IL-15受體復合物的其它亞單位結合的功能的蛋白質的SEQ ID NO :1或其片段。本發(fā)明涉及一種組合物，其包含編碼免疫原的分離的核酸分子連同編碼IL-15Ra或其功能片段的分離的核酸分子。本發(fā)明進一步涉及一種組合物，其包含編碼免疫原和IL-15RCI或其功能片段的分尚的核酸分子。本發(fā)明涉及可注射的藥物組合物，其包含編碼免疫原的分離的核酸分子連同編碼IL-15Rα或其功能片段的分尚的核酸分子。本發(fā)明涉及可注射的藥物組合物，其包含編碼免疫原和IL-Ra或其功能片段的分尚的核酸分子。在本發(fā)明的ー些方面中，所述免疫原是病原體抗原、癌癥相關的抗原或來自與自身免疫疾病相關的細胞的抗原。在ー些方面中，所述病原體是引起慢性感染的病原體。
本發(fā)明進ー步涉及誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，所述方法包括對所述個體施用組合物，所述組合物包含編碼免疫原的分離的核酸分子連同編碼IL-15RCI或其功能片段的分離的核酸分子。本發(fā)明進ー步涉及誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，所述方法包括對所述個體施用編碼免疫原和IL-15Ra或其功能片段的核酸分子。本發(fā)明進一步涉及重組疫苗，其包含編碼可操作地連接于調控元件的免疫原的核苷酸序列，編碼IL-15RCI或其功能片段的核苷酸序列；并且，涉及誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，所述方法包括對個體施用此重組疫苗。本發(fā)明進一步涉及一種活減毒病原體，其包含編碼IL-15RCI或其功能片段的核苷酸序列；并且，涉及誘導個體對病原體的免疫反應的方法，所 述 方法包括對個體施用所述活減毒病原體。附圖簡述

圖1A-1E展示與IL-15Ra單克隆抗體的產生相關的結果和信息。圖IA展示重組人IL-15Ra蛋白在12. O至.16 μ g蛋白質的2倍稀釋液中的考馬斯染色。圖IB展示商業(yè)化抗人IL-15Ra抗體可在直接的ELISA中檢測重組IL-15Rα蛋白。圖IC展示用于BALB/c小鼠中的抗人IL-15Ra單克隆抗體產生的免疫程序。圖ID通過ELISA展示來自克隆KKl. 23的雜交瘤上清液具有對重組IL-15Rα蛋白的高抗體效價。圖IE展示純化的單克隆抗體KKl. 23在ELISA中結合重組IL_15Ra并且通過蛋白質印跡分析具體地展示。圖2A-2G涉及IL-15R a DNA質粒的構建和表達。圖2A描繪如何將人IL_15Ra CDNA插入pVAXl表達載體中。圖2B和2C展示質粒IL-15Ra表達了適當大小的蛋白質(約30kDa)，分別由用R&D和KKl. 23單克隆抗人IL-15R α抗體進行的放射性活體外翻譯來檢測。圖2D展示單克隆KKl. 23抗體(IgGl同種型)不結合非轉染的HeLa細胞(20χ)。圖2Ε展示由小鼠IgGl同種型對照染色的pTRACER-IL-15Ra轉染細胞(綠色)(20x)。圖2F和2G分別以20x和60x展示KKl. 23抗人IL-15R α抗體(紅色)結合pIL_15R a -pTRACER轉染的細胞。圖3A-3C展示與單獨遞送的任何一種質粒相比，pIL-15和pIL_15Ra的組合增強免疫反應。圖3A展示用含有載體、抗原質粒(HIV-Igag和pol)、pIL_15和/或pIL_15R α的組合的DNA制劑注射的BALB/c小鼠組的免疫程序。pIL-15/pIL_15Rα的組合是在同一只腿上給予或在兩只不同的腿上分開給予(一只腿上給予PIL-15，另ー只腿上給予pIL-15Ra)0使用電穿孔3次進行肌內免疫，并在最后的加強之后一周將小鼠處死。圖3B和3C展示細胞反應。在IFN-Y ELISpot試驗中使用來自免疫小鼠的脾細胞。用培養(yǎng)基(陰性對照)、伴刀豆球蛋白A(陽性對照)或抗原肽(HIV-Igag和pol池)將脾細胞刺激過夜并將IFN-Y斑點形成單元計數。圖4A和4B展示在無pIL-15情況下，IL_15Ra DNA質粒的免疫原性是劑量依賴方式的。如圖3A所示，將BALB/c小鼠用含有載體、5 μ g抗原質粒(HIV-Igag和pol)和漸增劑量的IL-15Ra (7. 5、10或15μ g)的組合的DNA制劑來免疫。在用RlO (陰性對照)、ConA (陽性對照)和HIV-Igag肽池或HIV-Ipol肽池刺激的脾細胞上進行IFN- y ELIspot0圖4A中展示使用HIV-Igag肽池的實驗數據。圖4B中展示使用HIV-Ipol肽池的實驗數據。
圖5A和5B展示pIL_15R α主要通過CD8+T細胞增強IFN- Y分泌。由CD8+T細胞貢獻的IFN- Y分泌是通過使用Miltenyi珠使來自免疫小鼠脾細胞的CD8+T細胞的體外去除來測量。圖5Α展示全脾細胞(黒色條形圖)和CD8去除的脾細胞(灰色條形圖)的總抗原反應，并且所述總抗原反應是通過IFN-YELISpot來測量。在圖5Β中，對HIV-Igag ρ24抗原蛋白質的抗體效價是從用如物料和方法中所述的相同構建體和時間安排免疫的BALB/c小鼠的血清樣品測定。將在處死時獲取的血清的稀釋液在接種ρ24的ELISA板上操作并且用抗小鼠IgG-HRP抗體檢測以測定抗原特異性IgG的水平。在繪圖之前，將僅有稀釋劑的孔中的背景反應從樣品OD值中減去。圖6Α至6C展示pIL-15和pIL_15Ra的組合沒有增強記憶反應。將小鼠免疫三次并在處死之前靜養(yǎng)30周。圖6A展示IFN- Y分泌是通過IFN- y ELISpot從免疫小鼠的脾細胞中測量。圖6B展示用于從免疫小鼠測定記憶反應的細胞內細胞因子染色。將來自免疫小鼠的脾細胞在布雷菲爾德菌素A存在下用培養(yǎng)基、PMA/離子霉素或優(yōu)勢和亞優(yōu)勢HIV-Igag和pol抗原肽刺激5小吋。在圖6C中，從免疫小鼠獲取血清并在HIV-IgagP24ELISA上操作。分析血清稀釋液的抗原特異性IgG。在繪圖之前，將僅有稀釋劑的孔中的背景反應僅從樣品OD值中減去。 圖7A至7C展示在沒有內源性IL-15的情況下pIL_15Ra可以作為佐劑。為了探究IL-15Ra作為佐劑的機理，我們考察了人IL-15Ra結合鼠IL-15的能力。圖7A展示放射性標記的人IL-15Ra結合小鼠IL-15并且與抗小鼠IL-15抗體一起共同免疫沉淀。根據在圖3A中的程序，在對照C57BL/6(在圖7B中展示)和IL-15敲除的小鼠(在圖7C中展示)中也重復了免疫，并且對脾細胞進行IFN-YELISpots。優(yōu)選實施方案的詳細描述如本文所用的術語“IL_15Ra”是指白細胞介素15受體α蛋白。如本文所用的“功能片段”意指IL_15Ra的片段，當與免疫原一起遞送時，與在沒有所述片段的情況下遞送免疫原時誘導的免疫相比，所述片段提供増大的免疫反應。片段長度通常是10個或10個以上氨基酸。如本文所用的術語“靶蛋白”意指由本發(fā)明的基因構建體編碼的肽和蛋白質，其充當免疫反應的靶蛋白。術語“靶蛋白”和“免疫原”可互換使用，并且是指可引出免疫反應的蛋白質。靶蛋白是免疫原性的蛋白質，其與來自病原體或不希望的細胞類型(諸如癌細胞或需要免疫反應的涉及自身免疫疾病的細胞)的蛋白質共用至少ー個表位。針對靶蛋白的免疫反應將保護個體免受與所述靶蛋白相關的特定感染或疾病，和/或治療個體的與所述靶蛋白相關的特定感染或疾病。如本文所用的術語“遺傳構建體”是指包含編碼靶蛋白或免疫調節(jié)蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述編碼序列包括可操作地連接于調控元件的起始和終止信號，所述起始和終止信號包括能夠在施用所述核酸分子的個體的細胞中引導表達的啟動子和多腺苷酸化信號。如本文所用的術語“可表達形式”是指基因構建體，其含有可操作地連接于編碼靶蛋白或免疫調節(jié)蛋白的編碼序列的必要調控元件，以在存在于所述個體的細胞中時，使得所述編碼序列可得以表達。如本文所用的術語“共用ー個表位”是指包含至少ー個與另ー種蛋白質的表位相同或大體上類似的表位的蛋白質。
如本文所用的術語“大體上類似的表位”意指具有與蛋白質的表位不相同的結構，但仍然引起與所述蛋白質交叉反應的細胞或體液免疫反應的表位。如本文所用的術語“細胞內病原體”意指病毒或病原生生物體，它們的繁殖或生命周期的至少部分是處于宿主細胞內，并且在宿主細胞中產生病原體蛋白質或引起病原體蛋白質的產生。如本文所用的術語“過度増殖性疾病”意指特征為細胞過度増殖的疾病和病癥。如本文所用的術語“過度増殖性相關的蛋白質”意指與過度増殖性疾病相關的蛋白質。本發(fā)明源自以下發(fā)現當作為疫苗的部分來遞送時，編碼IL_15Ra和其功能片段的核酸分子和其組合調節(jié)免疫反應。因此，編碼IL-15Ra和其功能片段的核酸分子和其組合可作為免疫治療劑與疫苗組合來遞送或作為疫苗的組分來遞送。此外，本發(fā)明源自以下發(fā)現當作為疫苗的部分來遞送時，編碼IL_15Ra或其功能片段的核酸分子連同IL-15或其功能片段的核酸分子調節(jié)免疫反應。因此，編碼IL-15Ra或其功能片段的核酸分子連同IL-15或功能片段的核酸分子可作為免疫治療劑與疫苗組合來遞送或作為疫苗的和其組合來遞送。本發(fā)明的ー些方面提供IL_15Ra蛋白質的核酸編碼序列在治療疫苗中的用途，特別是在不需要CD8+記憶T細胞反應的此類情況下在治療疫苗中的用途。此類治療疫苗包括其中的抗原標靶是在正常以及疾病相關的細胞中表達的抗原的疫苗，借此，帶有抗原的細胞的短期消除具有治療效果，而沒有針對表達所述抗原的正常細胞的長期免疫反應。因此，本發(fā)明的這方面特別可用于針對癌細胞上的抗原(也存在于正常細胞上的抗原)的治療疫苗、針對由與自身免疫疾病相關的細胞表達的抗原(也存在于正常細胞上的抗原)的治療疫苗，以及針對涉及不希望有持久免疫反應的慢性感染的病原體抗原的治療疫苗。慢性感染是指病原體未被清除的病原體感染。實例包括但不限于HCV、HSV、CMV、水痘、HIV等，相對來說，急性感染諸如脊髓灰質炎、天花、腮腺炎等。本發(fā)明ー些方面提供編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列連同編碼IL-15的核酸編碼序列在治療疫苗中的用途，特別是在不需要增強的爆發(fā)免疫反應(burst immuneresponse)的此類情況下在治療疫苗中的用途。在免疫反應的初始誘導后，IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列和編碼IL-15的核酸編碼序列的組合提供累加的佐劑效應。可以對與編碼IL-15的核酸編碼序列或編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列相同的位點施用編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列，并且所述核酸編碼序列可以遞送到不同位點以便實現累加的免疫反應。人IL_15Ra的核苷酸序列公開為基因庫登錄號NM172200和NM002189，將其各自以引用方式并入本文。人IL-15Ra的蛋白質序列公開為基因庫登錄號Q13261、NP002180和NP751950，將其各自以引用方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，將編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列進行優(yōu)化以達到高水平的表達。在本發(fā)明的一些實施方案中，將編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列進行優(yōu)化，諸如SEQ ID NO :1的核酸編碼序列。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列是未優(yōu)化的，諸如SEQ ID NO :2的核酸編碼序列。人IL-15的核苷酸序列公開為基因庫登錄號匪172174和NM000585，將其各自以引用方式并入本文。人IL-15的蛋白質序列公開為基因庫登錄號CAA86100、CAA62616、AAI00964、CAA72044、AAH18149和AAU21241，將其各自以引用方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，將編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列進行優(yōu)化以達到高水平的表達。在一些實施方案中，使用諸如在美國專利第10/560,650號(US 20070041941)中描述的改進的IL-15構建體，將所述美國專利以引用方式并入本文。在一些實施方案中，使用諸如在美國專利第12/160，766號中描述的改進的IL-15構建體，將所述美國專利以引用方式并入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列是SEQ ID NO :3。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列和編碼靶抗原的核酸編碼序列各自在相同質粒上。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供一種組合物，其包含兩個質粒第一質粒包含編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列；第二質粒包含編碼靶抗原的核酸編碼序列，所述核酸編碼序列各自在相同質粒上。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供兩種組合物。第一種組合物包含ー個質粒，其包 含編碼IL-15Ra蛋白的核酸編碼序列，并且第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列，所述核酸編碼序列各自在相同質粒上。兩種組合物可提供在獨立的容器中并且包裝成試劑盒。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列、編碼IL-15的核酸編碼序列和編碼靶抗原的核酸編碼序列各自在相同質粒上。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供包含兩個質粒的組合物。編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列和編碼IL-15的核酸編碼序列在一個質粒上并且編碼靶抗原的核酸編碼序列在第二質粒上。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供包含三個質粒的組合物。編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列在第一質粒上，編碼IL-15的核酸編碼序列在第二質粒上并且編碼靶抗原的核酸編碼序列在第三質粒上。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供兩種組合物，第一種組合物包含ー個質粒并且第二種組合物包含ー個質粒。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列和編碼靶抗原的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15的核酸編碼序列。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列和編碼靶抗原的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15Ra的核酸編碼序列。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列和編碼IL-15Ra的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列。所述多種組合物可提供在被包裝形成試劑盒的獨立容器中。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供兩種組合物，第一種組合物包含兩個質粒并且第二種組合物包含ー個質粒。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含第一質粒，其包含編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列；和第二質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15的核酸編碼序列。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含第一質粒，其包含編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列；和第二質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL_15Ra的核酸編碼序列。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含第一質粒，其包含編碼IL-15蛋白的核酸編碼序列；和第二質粒，其包含編碼IL_15Ra的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列。所述多種組合物可提供在被包裝形成試劑盒的獨立容器中。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明提供三種組合物，第一種組合物包含ー個質粒，第二種組合物包含ー個質粒并且第三種組合物包含ー個質粒。在一些此類實施方案中，第一種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL_15Ra蛋白的核酸編碼序列。第二種組合物包含ー個質粒，其包含編碼靶抗原的核酸編碼序列。第三種組合物包含ー個質粒，其包含編碼IL-15的核酸編碼序列。所述多種組合物可提供在被包裝形成試劑盒的獨立容器中。編碼免疫調節(jié)蛋白的分離的cDNA可用作構建可產生所述免疫調節(jié)蛋白的構建體的起始物質?？墒褂脴藴始夹g和易獲得的起始物質制備編碼免疫調節(jié)蛋白的核酸分子?？墒褂迷S多眾所周知技術的任何技術來遞送核酸分子，這些技術包括DNA注射(也稱為DNA接種)、重組載體，諸如重組腺病毒、重組腺病毒相關的病毒和重組牛痘病毒。 DNA疫苗描述于美國專利第5，593，972、第5，739，118號、第5，817，637號、第5，830，876 號、第 5，962，428 號、第 5，981，505 號、第 5，580，859 號、第 5，703，055 號、第5，676，594號以及這些專利中引用的優(yōu)先權申請中，將各專利以引用方式并入本文。除了在那些申請中描述的遞送方案外，遞送DNA的替代方法描述于美國專利第4，945，050號和第5，036，006號中，將這兩個申請以引用方式并入本文。施用途徑包括但不限于肌內、鼻內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、動脈內、眼內和ロ部以及局部、透皮、通過吸入或栓劑施用或對粘膜組織施用，諸如通過對陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織灌洗施用。優(yōu)選的施用途徑包括粘膜組織、肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。遺傳構建體可借助包括但不限于傳統注射器、無針注射裝置或“微彈轟擊基因槍Uiiicroprojectile bombardment gene gunsノ，，的萬法來施用。另ー種施用途徑涉及使用電穿孔來遞送遺傳構建體，如在美國專利第5，273，525號、第 5，439，440 號、第 5，702，359 號、第 5，810，762 號、第 5，993，434 號、第 6，014，584 號、第 6, 055, 453 號、第 6, 068, 650 號、第 6, 110, 161 號、第 6, 120, 493 號、第 6, 135, 990 號、第 6，181，964 號、第 6，216，034 號、第 6，233，482 號、第 6，241，701 號、第 6，347，247 號、第 6, 418, 341 號、第 6, 451, 002 號、第 6, 516, 223 號、第 6, 567, 694 號、第 6, 569, 149 號、第 6，610，044 號、第 6，654，636 號、第 6，678，556 號、第 6，697，669 號、第 6，763，264 號、第6，778，853號、第6，865，416號、第6，939，862號和第6，958，060號中所述，所述美國專利在此以引用方式并入本文。當被細胞吸收時，遺傳構建體可作為發(fā)揮作用的染色體外分子保留在細胞中。可以ー個質?；蚨鄠€質粒的形式將DNA引入細胞內，所述DNA在所述細胞中短暫存在(transient basis)。或者,可對所述細胞施用RNA。本發(fā)明也涵蓋提供作為線性微型染色體的遺傳構建體，其包括著絲點、端粒和復制起點?；驑嫿w可構成對受試者施用的減毒活微生物或重組微生物載體中的遺傳物質的部分?；驑嫿w可以是重組病毒疫苗的基因組的部分，其中所述遺傳物質保留在染色體外。遺傳構建體包括核酸分子的基因表達所必需的調控元件。所述元件包括啟動子、起始密碼子、終止密碼子和多腺苷酸化信號。此外，編碼靶蛋白或免疫調節(jié)蛋白的序列的基因表達常常需要增強子。這些元件必需可操作地連接于編碼所需蛋白質的序列，而且所述調控元件必需在其所施用的個體中是可操作的。通常認為起始密碼子和終止密碼子是編碼所需蛋白質的核苷酸序列的部分。然而，這些元件必需在施用基因構建體的個體中是功能性的。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列一起在框架中。使用的啟動子和多腺苷酸化信號必須在所述個體細胞內是功能性的。用于實踐本發(fā)明，尤其用于產生人用遺傳疫苗的啟動子的實例包括但不限于來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷病毒(MV)(諸如BIV長末端重復序列(LTR)啟動子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)、ALV、巨細胞病毒(CMV)(諸如CMV早期瞬時啟動子)、Epstein Barr病毒(EBV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)以及來自人類基因的啟動子，諸如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和人金屬硫蛋白。 用于實踐本發(fā)明，尤其用于產生人用遺傳疫苗的多腺苷酸化信號的實例包括但不限于SV40多腺苷酸化信號、牛生長激素多腺苷酸化(bgh-PolyA)信號和LTR多腺苷酸化信號。具體來講，使用在pCEP4質粒(Invitrogen, San Diego Calif.)中的SV40多腺苷酸化信號，稱為SV40多腺苷酸化信號。除了 DNA表達所需的調控元件外，在DNA分子中也可以包括其它元件。此類其它的元件包括增強子。增強子可選自包括但不限于以下的組人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸，以及病毒增強子，諸如來自CMV、RSV和EBV的病毒增強子。為了使構建體保持在染色體外并且在細胞中產生所述構建體的多個拷貝，可提供具有哺乳動物復制起點的遺傳構建體。來自Invitrogen (San Diego, Calif.)的質粒pVAX
I、pCEP4和pREP4都含有Epstein Barr病毒復制起點和產生高拷貝游離型復制而無整合作用的核抗原EBNA-I編碼區(qū)域。在與免疫應用相關的ー些優(yōu)選實施方案中，遞送的核酸分子包括編碼靶蛋白、免疫調節(jié)蛋白和，此外，進ー步增強對此類靶蛋白的免疫反應的蛋白質的基因的核苷酸序列。此類基因的實例是編碼其它細胞因子和淋巴因子的基因，所述因子諸如α-干擾素、Y-干擾素、血小板衍生生長因子O3DGF)、TNF、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、11_4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15，包括具有缺失的信號序列并且任選包括來自IgE的信號肽的IL-15。在所述方法中使用的組合物可進ー步包含ー種或多種以下蛋白和/或編碼此類蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美國專利第10/139，423號(對應于美國公布第20030176378號)中所述主要組織相容性復合體抗原，包括主要組織相容性復合體I類抗原或主要組織相容性復合體II類抗原；死亡結構域受體，包括但不限于Apo-1、Fas、TNFR-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6 ;死亡信號，即與死亡結構域受體相互作用的蛋白質，包括但不限于FADD、FAP-1、TRADD, RIP、FLICE和RAIDD ;或包括結合死亡結構域受體并引發(fā)細胞凋亡的配體的死亡信號，包括但不限于FAS-L和TNF ;以及，與死亡結構域受體相互作用的介體，包括但不限于FADD>MORTI和MyD88 ;包括殺死細胞的蛋白質的毒素,諸如但不限于昆蟲毒和蛇毒、細菌內毒素(諸如綠膿桿菌(Psuedomoneus)內毒素)、雙鏈核糖體滅活蛋白質(諸如蓖麻毒素，包括單鏈毒素和白樹毒素)。在所述方法中使用的組合物可進ー步包含ー種或多種以下蛋白和/或編碼此類蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美國專利第10/560,650號(對應于美國公布第20070041941號)中所述IL_15，其包括包含連接于IL-15蛋白序列的非IL-15信號肽的融合蛋白(諸如包含連接于IL-15蛋白序列的IgE信號肽的融合蛋白)，⑶40L、TRAIL ；TRAILrecDRC5、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40 LIGAND、NKG2D、F461811 或 MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153 (CD30L)、Fos、c-jun、Sp-l、Apl、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAPK、SAPl、JNK2、JNK1B2、JNKlBU JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF-κ -B2、p49 剪接形式、NF- κ -B2、plOO 剪接形式、NF- κ -Β2、ρ105 剪接形式、NF- κ -Β50Κ 鏈前體、NFkBp50,人 IL-I α、人 IL-2、人 IL-4、鼠 IL-4、人 IL-5、人 IL-10、人 IL-15、人 IL-18、人 TNF- α、人 TNF-β、人白細胞介素 12、MadCAM-U NGF IL-7、VEGF、TNF-R、Fas、CD40L、IL-4, CSF、G-CSF, GM-CSF、M-CSF, LFA-3、I CAM-3, I CAM-2, ICAM-U PECAM、P150. 95、Mac-1, LFA-UCD34、RANTES, IL-8、MIP-I a、E-選擇體、CD2、MCP-I、L-選擇體、P-選擇體、FLT、Apo-I、Fas、TNFR-I、p55、WSL-U DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF、DR4 (TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA-1 和 CD86 (B7. 2)。在所述方法中使用的組合物可進ー步包含ー種或多種以下蛋白和/或編碼此類 蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美國專利第10/560，653號(對應于美國公布第 20070104686 號)中所述Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、滅活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl 和 TAP2。如果出于任何原因需要消除接受遺傳構建體的細胞，那么可加入擔當細胞破壞標靶的另一元件。在所述遺傳構建體中可包括可表達形式的皰疹胸腺嘧啶激酶(tk)基因?？蓪€體施用藥物更昔洛,(gangcyclovir),而此藥物將會引起任何產生tk的細胞的選擇性殺死，從而提供用于具有所述遺傳構建體的細胞的選擇性破壞的方法。為了最大化蛋白質產生，可選擇良好適合于施用所述構建體的細胞中的基因表達的調控序列。此外，可選擇在細胞中最有效轉錄的密碼子。本領域普通技術人員可以制造在細胞中有功能性的DNA構建體。在一些實施方案中，可以提供基因構建體以便產生本文所描述的連接于IgE信號肽的免疫調節(jié)蛋白的編碼序列。本發(fā)明的ー種方法包括以下步驟通過肌內、鼻內、腹膜內、皮下、皮內或局部施用核酸分子或通過灌洗選自由吸入、陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組成的組的粘膜組織施用核酸分子。在一些實施方案中，將核酸分子與多核苷酸功能增強劑或遺傳疫苗促進劑一起遞送給細胞。多核苷酸功能增強劑描述于美國專利第5，593，972號和第5，962，428號中，這兩個專利各自以引用方式并入本文。遺傳疫苗促進劑描述于美國專利第5，739，118號中，將其以引用方式并入本文。與核酸分子聯合施用的輔劑可以作為與核酸分子的混合物施用，或在施用核酸分子的同時、之前或之后獨立地施用。此外，可具有起轉染劑和/或復制劑和/或炎性劑功能并且可以與多核苷酸功能增強劑共同施用的其它藥劑包括生長因子、細胞因子和淋巴因子，諸如α-干擾素、Y-干擾素、GM-CSF、血小板衍生生長因子(TOGF)、TNF、表皮生長因子(EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纖維細胞生長因子、表面活性劑(諸如免疫刺激性復合物(ISCOMS))、LPS類似物(包括單磷酰脂A(WL))、胞壁酰肽、醌類似物和泡囊(諸如角鯊烯和角鯊烯)，并且透明質酸也可以與遺傳構建體一起施用。在一些實施方案中，免疫調節(jié)蛋白可用作多核苷酸功能增強劑。在一些實施方案中，為了增強遞送/攝取，將核酸分子與聚(丙交酷-共聚-こ交酷)(PLG)聯合提供。根據本發(fā)明的藥物組合物包含約I納克至約2000微克的DNA。在ー些優(yōu)選實施方案中，根據本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約10納克至約800微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約O. I至約500微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約I至約350微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約25至約250微克的DNA。在ー些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約100至約200微克的DNA。根據本發(fā)明的藥物組合物是根據所用的施用模式來配制。在藥物組合物是可注射
的藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱原和無顆粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。通常，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情況下，優(yōu)選等滲溶液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，將血管收縮劑加入制劑中。根據本發(fā)明的實施方案，提供了誘導對免疫原的免疫反應的方法，該方法包括對個體遞送免疫原和IL-15RCI或其功能片段的組合。所述疫苗可以是活減毒疫苗、重組疫苗或核酸或DNA疫苗。本發(fā)明可用于引出對靶蛋白，即對特別與病原體、過敏原或個體自身的“異?！奔毎嚓P的蛋白質的增強的免疫反應。本發(fā)明可用于使個體對致病因子和病原生生物體免疫，以使對病原體蛋白質的免疫反應提供對所述病原體的保護性免疫。本發(fā)明可用于通過引出對特別與所述過度増殖性細胞相關的靶蛋白的免疫反應來對抗過度増殖性疾病和病癥，諸如癌癥。本發(fā)明可用于通過引起對特別與涉及所述自身免疫病狀的細胞相關的靶蛋白的免疫反應來抵抗自身免疫疾病和病癥。根據本發(fā)明的ー些方面，將編碼靶蛋白和免疫調節(jié)蛋白的DNA或RNA引入表達它的個體的組織細胞中，從而產生編碼的蛋白質。編碼所述靶蛋白和免疫調節(jié)蛋白的DNA或RNA序列與個體的細胞表達所必需的調控元件連接。用于DNA表達的調控元件包括啟動子和多腺苷酸化信號。此外，所述遺傳構建體中也可以包括諸如Kozak區(qū)域的其它元件。在一些實施方案中，編碼靶蛋白的可表達形式的序列和編碼兩種免疫調節(jié)蛋白的可表達形式的序列均出現在遞送到個體的同一核酸分子上。在一些實施方案中，編碼靶蛋白的可表達形式的序列出現在與編碼免疫調節(jié)蛋白的可表達形式的序列的不同的核酸分子上。在一些實施方案中，編碼靶蛋白的序列的可表達形式和編碼ー種或多種免疫調節(jié)蛋白質的可表達形式的序列出現在與含有編碼免疫調節(jié)蛋白的可表達形式的序列的核酸分子不同的核酸分子上?？筛鶕景l(fā)明來產生和遞送多種不同的核酸分子。核酸分子可以質粒DNA、重組載體的核酸分子或減毒疫苗中提供的遺傳物質的部分形式來提供?；蛘撸谝恍嵤┓桨钢?，除了編碼它們的核酸分子之外或代替編碼它們的核酸分子，靶蛋白和免疫調節(jié)蛋白可以蛋白質形式遞送。
遺傳構建體可包含編碼可操作地連接于基因表達所需的調控元件的靶蛋白或免疫調節(jié)蛋白的核苷酸序列。根據本發(fā)明，提供基因構建體組合物，其包括ー個包含編碼靶蛋白的可表達形式的核苷酸序列的構建體和ー個包含編碼免疫調節(jié)蛋白的可表達形式的核苷酸序列的構建體。將包括所述基因構建體組合的DNA或RNA分子遞送到活細胞中引起DNA或RNA的表達以及靶蛋白和ー種或多種免疫調節(jié)蛋白的產生。產生了對靶蛋白的增強免疫反應。本發(fā)明可用于使個體對諸如病毒、原核生物和病原真核生物體(諸如單細胞病原生物體和多細胞寄生蟲)的病原體免疫。本發(fā)明特別可用于使個體對感染細胞并且不被囊封的病原體免疫，所述病原體諸如病毒和原核生物，諸如淋病病毒、李斯特菌和志賀菌。此夕卜，本發(fā)明也可用于使個體對原生動物病原體免疫，所述原生動物病原體包括在生命周期中它們是細胞內病原體的階段。表I提供ー些病毒科和屬的列表，可根據本發(fā)明產生用于所述病毒科和屬的疫苗。包含編碼包含至少ー個與病原體抗原(諸如列于表中的抗原)上呈現的表位相同或大體上類似的表位的肽的DNA序列的DNA構建體可用于疫苗。此外，本發(fā)明也可用于使個體對其它病原體免疫，所述其它病原體包括原核和真核原生動物病原體 以及諸如列于表2中的多細胞寄生蟲。本領域技術人員可容易地鑒別和區(qū)分引起慢性感染的病原體與感染后被清除的病原體(即急性傳染)。表表I-病毒微小核糖核酸病毒科屬鼻病毒(醫(yī)學)引起-50%普通感冒病例。腸病毒(醫(yī)學)包括脊髄灰質炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和人腸道病毒，諸如甲肝病毒。ロ瘡病毒(獸醫(yī)學)它們是ロ蹄疫病毒。靶抗原VP1、VP2、VP3、VP4、VPG杯狀病毒科屬諾瓦克群病毒(醫(yī)學)它們是流行性胃腸炎的重要致病病因。披膜病毒科屬α病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)實例包括辛德畢斯病毒、羅斯河病毒和委內瑞拉東方&西方馬腦炎病毒。呼腸孤病毒(醫(yī)學)風疫病毒。黃病毒科實例包括(醫(yī)學)登革熱病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒和虱傳腦炎病毒。西尼羅河病毒(基因庫NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、Μ12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518 和 AF202541)代表性靶抗原E NS5 C
丙肝病毒(醫(yī)學)這些病毒不屬于任何科，但又被認為是被膜病毒或黃病毒。大多數類似于被膜病毒科。冠狀病毒科(醫(yī)學和獸醫(yī)學)傳染性支氣管炎病毒(家禽)豬可傳播性胃腸道病毒(豬)豬凝血性腦脊髄炎病毒(豬)貓傳染性腹膜炎病毒(貓)貓腸道冠狀病毒(貓)犬冠狀病毒(犬) SARS相關的冠狀病毒人呼吸道冠狀病毒引起約40%的普通感冒病例。EX. 224E、0C43注意-冠狀病毒可引起非甲、非こ或非丙型肝炎靶抗原E1-也稱為M或基質蛋白E2-也稱為S或刺突蛋白E3-也稱為BE或血凝素-elterose糖蛋白(不存在于所有冠狀病毒中)N_殼包核酸彈狀病毒科屬水皰病毒、狂犬病病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)狂犬??；靶抗原G蛋白、N蛋白線狀病毒科(醫(yī)學)出血熱病毒，諸如馬堡病毒和埃博拉病毒副粘病毒科屬副粘病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)腮腺炎病毒、新城疫病毒(重要的雞病原體)麻疹病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)麻疹、犬瘟熱肺病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)呼吸道合胞病毒
正粘液病毒科(醫(yī)學)流感病毒布尼亞病毒科屬布尼亞病毒(醫(yī)學)加利福尼亞腦炎、拉克羅斯腦炎(La Crosse)白蛉熱病毒(醫(yī)學)里夫特山谷熱漢坦病韋Puremala是一種hemahagin熱病韋內羅畢病毒(獸醫(yī)學)內羅畢綿羊病還有許多未分類的布尼亞病毒沙粒病毒科(醫(yī)學)LCM、拉沙熱病毒呼腸孤病毒科屬呼腸孤病毒ー種可能的人病原體輪狀病毒兒童急性胃腸炎環(huán)狀病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)科羅拉多虱傳熱、
萊邦博(Lebombo)(人)馬腦炎、藍舌病逆轉錄病毒科亞科致癌病毒(獸醫(yī)學)(醫(yī)學)貓白血病病毒、HTLVI和HTLVII慢病毒(醫(yī)學和獸醫(yī)學)HIV、貓免疫缺陷病毒、馬傳染性貧血病毒Spumavirinal乳多泡病韋科亞科多瘤病毒(醫(yī)學)BKU和JCU病毒亞科乳頭瘤病毒(醫(yī)學)與癌癥或乳頭瘤惡性進展相關的許多病毒類型。 腺病毒(醫(yī)學)EX AD7、ARD.、0.B.-引起呼吸道疾病-一些腺病毒，諸如275引起腸炎細小病毒科(獸醫(yī)學)貓細小病毒引起貓腸炎貓瘟病毒犬細小病毒豬細小病毒皰疹病毒科亞科α皰疫病毒屬單純皰疹病毒(醫(yī)學)HSVI (基因庫 X14112、NC001806)、HSVII(NC001798)水痘病毒(醫(yī)學獸醫(yī)學)假性狂犬病水痘病毒亞科β皰疹病毒屬巨細胞病毒(醫(yī)學)HCMV鼠巨細胞病毒亞科y皰疹病毒屬淋巴隱病毒(醫(yī)學)EBV-(伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma))痘病毒科亞科帶狀痘病毒(醫(yī)學-獸醫(yī)學)
屬天花(天花病毒)牛痘(牛痘病毒)副痘病毒-獸醫(yī)學禽痘病毒-獸醫(yī)學山羊痘病毒兔痘病毒
豬痘病毒亞科昆蟲痘病毒肝DNA病毒科こ肝病毒未分類的肝炎δ病毒表2細菌病原體病原性革蘭陽性球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌和鏈球菌。病原性革蘭陰性球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。病原性革蘭陰性腸道桿菌包括腸桿菌；假單胞菌、不動細菌和艾肯菌、類鼻疽；沙門菌；志賀菌；嗜血桿菌；軟性下疳；布魯菌；土拉菌；耶爾森菌(巴斯德菌)；念珠狀鏈桿菌和螺旋菌；單核細胞增生李斯特菌；紅斑丹毒絲菌；白喉桿菌、霍亂桿菌、炭疽桿菌；杜諾萬菌(性病性肉芽腫)和巴爾通氏體。病原性厭氧菌包括破傷風桿菌；肉毒梭菌；其它梭菌；結核桿菌；麻風桿菌和其它分枝桿菌。病原性螺旋體病包括梅毒；密螺旋體病熱帶肉芽腫、品他病和地方性梅毒和鉤端螺旋體病。由較高級病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放線菌病；諾卡菌??；隱球菌病、酵母病、組織胞漿菌病和球孢子菌??；念珠菌病、曲霉病和毛霉菌?。绘咦咏z菌??；巴西芽生菌病、霉樣真菌病、球擬酵母菌病、足分枝菌病和染色芽生菌病和皮膚真菌病。立克次體感染包括立克次體感染和立克次體病。支原體和衣原體感染的實例包括支原體肺炎；性病性淋巴肉芽腫；鸚鵡熱；和產期衣原體感染。病原性真核生物病原性原生動物和蠕蟲以及由其引起的感染包括阿米巴病；瘧疾；利什曼??；錐蟲病；弓形體病；卡氏肺囊蟲??；巴貝蟲病；賈第鞭毛蟲病；旋毛蟲?。唤z蟲?。谎x?。痪€蟲??；吸蟲病和絳蟲(cestode/tapeworm)感染。為了產生預防病原體感染的遺傳疫苗，在遺傳構建體中必須包括編碼免疫原性蛋白質(可對所述免疫原性蛋白質產生保護性免疫反應)的遺傳物質作為標靶的編碼序列。因為DNA和RNA兩者都相對較小并且可以相對容易地產生，所以本發(fā)明提供允許用多種病原體抗原接種的另外的優(yōu)點。遺傳疫苗中使用的遺傳構建體可包括編碼許多病原體抗原的遺傳物質。例如，在單ー構建體中可以包括若干病毒基因從而提供多個標靶。表I和表2包括一些病原體和生物體的列表,可以制備保護個體免受它們感染的遺傳疫苗。在一些優(yōu)選實施方案中，使個體對病原體免疫的方法針對人類免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、丙肝病毒(HCV)、西尼羅河病毒(West Nile Virus, WNV)或こ肝病毒(HBV)。本發(fā)明的另ー個方面提供一種賦予對過度増殖性疾病中特有的過度増殖性細胞的保護性免疫反應的方法和一種治療患有過度增殖性疾病的個體的方法。過度增殖性疾病的實例包括所有形式的癌癥和銀屑病。已發(fā)現向個體的細胞中引入包括編碼免疫原性的“過度増殖性細胞”相關的蛋白質的核苷酸序列的遺傳構建體會引起個體的接種細胞中產生那些蛋白質。為了對過度增殖性疾病免疫，對個體施用包括編碼與過度増殖性疾病相關的蛋白質的核苷酸序列的遺傳構建體。 為了使過度増殖性相關的蛋白質成為有效的免疫原性標靶，其必須專門在過度增殖性細胞中產生或與正常細胞相比，在過度增殖性細胞中以較高水平產生。靶抗原包括此類蛋白質、其片段和肽；其包含出現在此類蛋白質上的至少ー個表位。在一些情況下，過度増殖性相關的蛋白質是編碼蛋白質的基因突變的產物。突變的基因編碼的蛋白質與正常蛋白質幾乎相同，只是其氨基酸序列稍有不同從而產生正常蛋白質上沒有的不同表位。此類革巴蛋白包括由諸如myb、myc、fyn的致癌基因和轉位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF編碼的蛋白質。除了作為靶抗原的致癌基因產物之外，用于抗癌治療和保護性療法的靶蛋白包括由B細胞淋巴瘤產生的抗體可變區(qū)和由T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區(qū)，在一些實施方案中，它們也可用作自身免疫疾病的靶抗原?？梢杂闷渌[瘤相關的蛋白質，諸如在腫瘤細胞中以較高水平出現的蛋白質來作為靶蛋白，包括單克隆抗體17-IA識別的蛋白質和葉酸結合蛋白或PSA。雖然本發(fā)明可用于使個體對若干癌癥形式中的一種或多種癌癥形式免疫，但是本發(fā)明特別可用于使易患癌癥或已患上癌癥并且因此易復發(fā)的個體預防性免疫。遺傳學和技術以及流行病學的發(fā)展使得對個體患上癌癥的可能性確定和風險評估成為可能。使用遺傳篩選和/或家族健康史，有可能預測特定個體患上若干癌癥類型中的任一類型癌癥的可能性。類似地，已經患上癌癥并且已受治療去除癌癥或處于緩解期的那些個體尤其容易復發(fā)和復現癌癥。作為治療療法的一部分，可以使這些個體對其已被確診患有的癌癥免疫以對抗癌癥復現。因此，一旦得知個體患過某種類型的癌癥并有復發(fā)的風險，就可對他們免疫以使其免疫系統準備對抗任何未來出現的癌癥。本發(fā)明提供一種治療患有過度增殖性疾病的個體的方法。在此類方法中，引入的遺傳構建體擔當免疫治療劑，引導和促進個體的免疫系統對抗產生靶蛋白的過度增殖性細胞。本發(fā)明提供一種治療患有自身免疫疾病和病癥的個體的方法，所述方法賦予對與自身免疫相關的標靶(包括細胞受體和產生針對“自身”的抗體的細胞)的廣泛保護性免疫反應。T細胞介導的自身免疫疾病包括類風濕性關節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)、干燥綜合征(Sjogren' s syndrome)、肉樣瘤病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener, s granulomatosis)、克羅恩氏病(Crohn' s disease)和潰瘍性結腸炎。這些疾病各自的特征為T細胞受體結合內源性抗原并且引發(fā)與自身免疫疾病相關的炎癥級聯。對T細胞可變區(qū)的接種將引出包括CTL的免疫反應以消除那些T細胞。在RA中，涉及所述疾病的T細胞受體(TCR)的ー些特定可變區(qū)已得到表征。這些TCR包括V. β.-3、νβ.-14、20ν. β . _17和Va_17。因此，用編碼這些蛋白質的至少ー種蛋白質的DNA構建體接種將引出靶向涉及RA的T細胞的免疫反應。參見H0Well，M.D.等，1991Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 :10921-10925 ；Piliard, X.等，1991 Science253 :325-329 ；ffilliams,ff. V.等，1992 J Clin. Invest. 90 :326-333 ;將各參考文獻以引用方式并入本文。在MS中，涉及所述疾病的TCR的ー些特定可變區(qū)已得到表征。這些TCR包括VfP和Va-IO。因此，用編碼這些蛋白質的至少ー種蛋白質的DNA構建體接種將引出靶向涉及MS的T細胞的免疫反應。參見Wucherpfennig, K. W.等，1990Science 248 :1016-1019 ；0ksenberg,J. R.等，1990 Nature 345 :344-346 ;將各參考文獻以引用方式并入本文。
在硬皮病中，涉及所述疾病的TCR的ー些特定可變區(qū)已得到表征。這些TCR包括V. β·-6、ν· β·-8、ν· β ·-14 和 Va-16、Va-3C、Va-7、Va-14、Va-15、Va-16、Va-28 和 Va-12。因此，用編碼這些蛋白質的至少ー種蛋白質的DNA構建體接種將引出靶向涉及硬皮病的T細胞的免疫反應。為了治療患有T細胞介導的自身免疫疾病的患者，尤其是患有所述TCR的可變區(qū)尚待表征的疾病的患者，可以進行滑膜活檢?？色@取存在T細胞的樣品并使用標準技術鑒定那些TCR的可變區(qū)?？梢允褂眠@種信息來制備遺傳疫苗。B細胞介導的自身免疫疾病包括狼瘡(SLE)、格雷夫斯氏病(Grave, s disease)、重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫血小板減少癥、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽管硬化和惡性貧血。這些疾病各自的特征為抗體結合內源性抗原并且引發(fā)與自身免疫疾病相關的炎癥級聯。對抗體可變區(qū)的接種將引出包括CTL的免疫反應以消除產生抗體的那些B細胞。為了治療患有B細胞介導的自身免疫疾病的患者，必須鑒定涉及自身免疫活動的抗體的可變區(qū)?？蛇M行活檢并且可獲取存在于炎癥部位的抗體樣品?？梢允褂脴藴始夹g鑒定那些抗體的可變區(qū)?？梢允褂眠@種信息制備遺傳疫苗。在SLE的情況下，認為DNA是ー種抗原。因此，在將要對SLE免疫的患者中，可以篩選其血清的抗DNA抗體并且可以制備包括編碼在所述血清中出現的此類抗DNA抗體的可變區(qū)的DNA構建體的疫苗。TCR和抗體的可變區(qū)的共同結構特征是眾所周知的。通?？砂凑毡娝苤姆椒▉碚业骄幋a特定TCR或抗體的DNA序列，這些方法描述于Kabat等1987 Sequence ofProteins of Immunological Interest U. Department of Health and Human services,Bethesda Md.中，將所述參考文件以引用方式并入本文。此外，克隆抗體的功能性可變區(qū)的一般方法可以在 Chaudhary, V. K.等，1990 Proc. Natl. Acad Sci. USA87 :1066 中找到，將所述參考文獻以引用方式并入本文。除了使用可表達形式的免疫調節(jié)蛋白編碼序列來改進遺傳疫苗之外，本發(fā)明還涉及改進的減毒活疫苗和使用重組載體遞送編碼抗原的外來基因的改進的疫苗。減毒活疫苗和使用重組載體遞送外來抗原的疫苗的實例描述于以下美國專利4，722，848、5，017，487、5，077，044、5，110，587、5，112，749、5，174，993、5，223，424、5，225，336、5，240，703,5,242，829,5,294，441,5,294，548,5, 310，668,5, 387，744,5, 389，368、5，424，065,5, 451，499,5, 453，364,5, 462，734,5, 470，734 和 5，482，713 中，將各專利以引用方式并入本文。提供的基因構建體包括編碼IL-R15CI或其功能片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地連接于可以在疫苗中起作用以影響表達的調控序列。將基因構建體合并到減毒活疫苗和重組疫苗中以產生根據本發(fā)明的改進的疫苗。本發(fā)明提供一種使個體免疫的改進的方法，所述方法包括將基因構建體作為疫苗組合物的部分對個體細胞遞送的步驟，所述疫苗組合物包括DNA疫苗、減毒活疫苗和重組疫苗?；驑嫿w包含編碼IL-15受體α或功能片段的核苷酸序列并且可操作地連接于可以在疫苗中起作用以影響表達的調控序列。所述改進的疫苗產生增強的細胞免疫反應。
實施例將小鼠用pIL-15和pIL_15Ra共同免疫以測定使用HIV-1DNA疫苗抗原產生的增強的免疫反應。數據顯示，雖然IL-15和IL-15Ra組合確實增強總體的細胞免疫反應，但意外的是，IL-15Ra質粒以IL-15非依賴方式增強免疫反應。重要的是，所誘導的記憶反應僅在用pIL-15以及pIL_15Ra共同接種的小鼠中得到維持，而并不在単獨用IL_15Ra接種的小鼠中維持。這些研究首次證明了単獨的IL-15Ra蛋白可作為具有有限的免疫擴展表現型的佐劑。材料和方法蛋白質印跡分析根據標準方案進行蛋白質印跡分析。在SDS-PAGE凝膠(Cambrex, Rockland, ME)上操作姆孔3 μ g的重組IL-15R α或VPR蛋白(Abgent),在硝化纖維素膜上進行印跡,并用R&D或KKl. 23抗人IL-15Ra抗體探測。使用抗小鼠IgG-HRP(Zymed)將信號擴增并用ECL(GEHealthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)檢測。DNA 質粒如先前描述制備表達HIV-Igag 和 HIV-lpol (Kim 等，1998)和人 IL-15 (Kutzler等，2005)的DNA疫苗構建體。將人IL-15R α的開放閱讀框架移動到pVAXl和pTRACER載體中(Invitrogen, Carlsbad, CA)。分別使用 EcoRI 和 BamHI 或 NheI 和 EcoRI (New EnglandBiolabs, Beverly, MA)進行限制性內切酶消化。通過序列分析檢驗陽性克隆。活體外翻譯試驗使用TNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation Reticulocyte Lysate系統(Promega，WI)和[35S]甲硫氨酸來產生標記的IL-15Rα蛋白產物。根據由制造商提供的說明書，將單獨的PVAX載體(陰性對照)或含有IL-15Ra和[35S]甲硫氨酸的pVAX載體加入反應混合物中。將反應在30°C下進行I小吋。在RIPA緩沖液中，使用5 μ g純化的單克隆抗IL-15Ra抗體(R&D Systems)或克隆KKl. 23將標記的蛋白質在4°C下旋轉免疫沉淀過夜。向各免疫沉淀反應中加入大約5mg蛋白質G-Sepharose珠(GE Healthcare)(50 μ L的100mg/mL儲備液)，并將樣品在4°C下旋轉孵育2小吋。將珠粒用含有高鹽和牛血清白蛋白的結合緩沖液洗滌三次，并最終混懸在2x樣品緩沖液中。通過煮沸5分鐘將免疫沉淀蛋白質復合物從瓊脂糖凝膠珠上洗脫，并在12% SDS-PAGE凝膠(Cambrex)上操作。將凝膠固定并用擴增溶液(GE Healthcare)處理,并且在凝膠干燥器(Bio-Rad,Hercules,CA)中干燥2小吋。將干燥的凝膠在-80°C下暴光于X-射線膠片并使用Kodak自動顯影劑(Kodak, Rochester, NY)顯影。間接免疫熒光試驗用于確認pIL-15Rci質粒表達的間接免疫熒光試驗是通過以下的先有技術描述(Ramanathan 等，2002)方案來進行。使在玻片腔室(BD Biosciences, Bedford, MA)中，在完全的 DMEM 加上 10% FBS (Hyclone, Logan, UT)和抗菌-抗霉(GIBC0, Invitrogen,Carlsbad, CA)中，以每腔室100，000個細胞的密度生長的HeLa細胞(ATCC，Rockville,MD)附著過夜。根據制造商的方案，使用FuGENE 6轉染試劑(Roche Diagnostics, Basel,Switzerland)將細胞用pIL_15R a-pTRACER或pVAX-1 (I μ g/孔)轉染。轉染之后二十四小時，用PBS洗滌細胞并在室溫下使用2% PFA/PBS在載玻片上固定I小吋。在37度下， 將載玻片用在我們實驗室制備的5ug克隆KKl. 23小鼠抗人IL-15Ra或IgGl同種型對照(R&D systems, Minneapolis, MN)孵育90分鐘。以I : 200添加抗小鼠IgG-若丹明共軛的ニ級抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)并將載玻片在室溫下孵育45分鐘。隨后,在室溫下DAPI (Molecular Probes, Invitrogen)染色10分鐘,將載玻片安放在Fluoromount G 培養(yǎng)基(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)上并使用用于突光顯微鏡檢查的 Phase 3 Image Pro Program (Media Cybernetics, Bethesda, MD)分析。質粒免疫和小鼠6 至 8 周大的雌性 BALB/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)、C57BL/6 (Taconic, Germantown, NY)或 IL-15 敲除(Taconic) (Kennedy 等，2000)小鼠進行脛骨前肌肉注射3次，每次相隔2周，并如先前描述(Khan等，2003 ；Laddy等，2008)，使用CELLECTRA 適配的恒流裝置(VGX Pharmaceuticals,The Woodlands,TX)進行電脈沖。對所有小鼠實驗來說，所述動物均用35ug pVAXl>5 μ g HIV-1抗原質粒(gag, pol)、10 μ gpIL-15和/或7. 5、10或15yg pIL_15Ra (η = 3-7只每組)免疫。各種基因質粒的共同施用涉及在以等滲檸檬酸鹽緩沖液(Kim等，1998 ;Kutzler等，2005)中的0.25%布比卡因-HCL(Sigma)注射之前，將指定的DNA質?；旌现?0 μ I的最終體積。所有動物均圈養(yǎng)在賓夕法尼亞大學的溫度受控、光照循環(huán)的設施中，并且按照美國國家衛(wèi)生研究所和賓夕法尼亞大學的指導對它們進行照料。小鼠處死、樣品采集和組織獲取的方法在免疫程序指定的時間點，使用止痛藥將動物鎮(zhèn)靜并采集血液，之后通過頸部脫位將動物處死。從各個小鼠獲取脾臟并匯集(每個實驗組)到含有RlO培養(yǎng)基(RPMI1640加10%胎牛血清、抗菌/抗霉和B-巰基こ醇)的15ml錐瓶中。在無菌組織培養(yǎng)罩中，使用stomacher裝置(Seward 80, Metrohm, Riverview, FL)將來自各個實驗組的匯集的脾臟/培養(yǎng)基混合物擠進單細胞混懸液中。使細胞/組織基質通過40-微米細胞過濾器并用RlO洗漆，造粒并在室溫下，在ACK裂解緩沖液(Lonza, Switzerland)中孵育5分鐘以使紅細胞裂解。隨后將脾細胞計數并用于以下描述的免疫試驗中。 IFN- Y ELISP0T 試驗
如先前描述(kutzler等，2005)進行IFN-yELISPOT以測定來自免疫小鼠的抗原特異性細胞因子分泌。簡單地說，用抗小鼠IFN-Y俘獲抗體接種ELISpot 96孔板并在4°C下孵育24小時(R&D Systems)。將來自免疫小鼠的2x105個脾細胞加入ELISpot板的各個孔中并在37°C、5% C02，在RlO(陰性對照)、伴刀豆球蛋白A(陽性對照)或特異性肽(HIV-Igag或pol)抗原(10yg/ml)存在下刺激過夜?？缭秸麄€相應蛋白質(11個氨基酸重疊)的 HIV-1 Consensus Clade B 亞型 HIV-1 gag 和 pol 15_mer 妝是從 AIDS Reagentand Reference Repository (Frederick, MD)獲得。對于⑶8缺失實驗來說，根據制造商的方案，通過使用抗⑶8a(Ly-2)抗體(Miltenyi Biotech, Germany)的陽性磁性分選,將CD8+T細胞從全部脾細胞中除去。刺激24小時之后，將板洗滌并在4°C下用生物素化的抗小鼠IFN-Y抗體(R&D Systems)孵育過夜。將板洗漆并在室溫下用鏈霉親和素堿性磷酸酶(R&D Systems)孵育2小吋。將板洗滌，添加5-溴-4-氯-3’吲哚基磷酸酯對甲苯胺鹽(BCIP)和氯化硝基四氮唑蘭(NBT) (the Chromogen Color Reagent,R&D Systems)。將板用蒸懼水沖洗，并在室溫下干燥。用自動化ELISpot讀數器(CTL Limited, Inc. Cleveland,OH)將斑點計數。測定原始數值并乘以系數五，以使數據表示為每百萬脾細胞的斑點形成細胞。在繪圖之前，將在各組的RlO孔中的背景值從肽刺激的孔的值中減去。 還通過使用Cytof ix/Cytoperm Kit和標準方案(BD Biosciences)的細胞內細胞因子染色來測定細胞內細胞因子染色HIV-I特異性T細胞反應。將來自免疫小鼠的脾細胞在具有 RlO 和 DMSO (陰性對照)的 lul/ml GolgiPlug (BD Biosciences)、10ng/ml PMA 和250ng/ml離子霉素(陽性對照)或HIV-1 consensus Clade B gag或pol I5Ier肽存在下刺激5小時。在表面染色之前，在37°C下用LIVE/DEAD可固定的紫羅蘭試劑盒(MolecularProbes, Invitrogen)將細胞染色10分鐘,并在4°C下經過15分鐘添加Fe封閉劑(BD)以封閉Fe受體。所有抗體均購自BD Biosciences并且以Iul/測試使用。在透化/固定之前，在4°C下將細胞用⑶4-Alexa700和⑶8-PerCP染色30分鐘。在4°C下，在細胞內染色的 45 分鐘中包含 CD3-PECy5 和 IFN- y PE_Cy7。使用 LSRII 流式細胞儀(BD Biosciences)獲得來自50，000活的CD3+淋巴細胞門控事件(gated event)的數據并且使用Flowjo軟件(Treestar, Inc. , Ashland, OR)分析。在繪圖之前,將來自陰性對照孔的反應從抗原刺激中減去。HIV-IGag結合抗體的分析如(Ogawa等，1989 ；Mestecky等,2004)所述，將ELISA用于測定小鼠血清中的 HIV-1 Gag-特異性抗體 IgG。將 EIA/RIA 板(Corning Costar, Cambridge, MA)用以IOOul 姆孔的最終體積稀釋在 PBS (Mediatech, Herndon, VA)中的 I μ g/ml 重組 HIV-1IIIBgag p24(Immunodiagnostics, Woburn, MA)來接種并在 4 °C 下孵育過夜。將板用 PBS/Tween (O. 05% Tween 20)洗滌并在室溫下用200 μ I封閉緩沖液/稀釋劑(PBS中3% BSA)對非特異性結合封閉2小吋。將板洗滌并分三次添加從免疫小鼠匯集的血清的稀釋液(100 μ I每孔)，稀釋度為I至10到I至1600，并且在室溫下孵育2小時。用辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L) (Zymed)檢測結合抗體并用底物ΤΜΒΗ202 (Sigma-Aldrich)顯影。用 2Ν H2S04 將顯色反應終止，在 EL312Bio_Kinetics 微板讀數器(Bio-Tek InstrumentsInc. , Winooski, VT)中讀取在450nm處的吸光度。結果
抗人IL_15Ra抗體的產生產生對人IL-15Ra的單克隆抗體，因為市售的抗體缺乏檢測IL_15Ra質粒(pIL_15Ra)在細胞上表達的能力。重組人IL_15Ra是如下產生的重組人IL_15Ra蛋白是由Abgent (San Diego, CA)產生。將人IL_15Ra的開放閱讀框架(是由Thomas Waldmann (NCI, NIH, Bethesda, MD)康慨贈送)克隆到高度表達的細菌載體pET21a(EMD Biosciences, Gibbstown, NJ)中。將感受態(tài)細胞轉化，在大腸桿菌中擴增，并使用Ni-NTA柱純化重組蛋白質。通過直接ELISA，使用抗人IL-15Ra抗體(R&DSystems, Minneapolis, MN)精確確認純化蛋白質。為了確認新產生的IL-15Ra蛋白的大小，在SDS-PAGE凝膠上操作純化蛋白質的稀釋度逐漸減小的稀釋液并用考馬斯藍染料染色(圖1A)。如圖IA所示，產生的蛋白質大約是30kDa，即預期的大小。測試此蛋白質結合市售抗體的能力，以作為其正確完整性的指標。圖IB展示ELISA試驗，由重組IL-15Ra或VPR蛋白(陰性對照)俘獲板。使用的VPR是通過與IL-15Ra蛋白類似的方法來產生。圖IB展示市售抗人IL-15Ra抗體可檢測產 生的重組蛋白質。為了產生對IL_15Ra的抗體，如圖IC并且如下將重組人IL-15Ra蛋白注射到BALB/c小鼠中將重組人IL_15Ra蛋白質注射到BALB/c小鼠(η = 4)中以產生單克隆抗體。每次注射(Sigma，St. Louis,MO)給于在完全弗氏佐劑(僅第一次免疫)或不完全的弗氏佐劑(隨后的免疫)中乳化的總共5yg蛋白。向各側腹皮下注射50 μ I井向腹膜注射100 μ I。在融合之前三天，對小鼠靜脈內給于35ug蛋白質的無菌PBS終點加強劑(final boost)。通過直接ELISA，使用重組IL-15Ra蛋白和抗小鼠IgG-HRP (Zymed，San Francisco, CA)測定血清中的抗體水平。將具有對IL-15Ra的抗體的I : 8，000效價的一只小鼠處死，將其脾臟除去用干與骨髓瘤細胞系融合。通過ELISA篩選1，500個雜交瘤上清液，擴增8個陽性克隆，并將ー個克隆通過硫酸銨柱純化，其為抗體KKl. 23。由Wistar Institute HybridomaFacility (Philadelphia, PA)的 Julia Conicello 負責產生并純化單克隆抗體。通過ELISA篩選大約1，500個雜交瘤上清液之后，如圖ID所示，一個雜交瘤KKl. 23顯示抗體的效價(> I至12，800)。隨后將此雜交瘤克隆、擴增并純化。如圖IE中的蛋白質印跡分析所示，純化的抗體KKl. 23對人IL-15Ra是特異性的。此外，KKl. 23似乎以比市售抗體更高的親合力與人IL-15Ra結合(圖1E)。pIL-15Ra表達生物活性蛋白質產生適用于接種研究的IL-15Ra表達載體。如圖2A所示，在CMV啟動子的控制下，將人IL_15Ra0RF克隆到pVAXl表達載體中。為了評價IL_15Ra質粒的適當的表達，進行活體外翻譯試驗。在圖2B&2C中展示S35放射性標記的蛋白質，以大致30. OkD遷移，而對照質粒PVAX與預期的一樣不產生任何可檢測的蛋白質產物。針對人IL-15Ra的商業(yè)化R&D(2B)或KKl. 23(2C)抗體用于使放射性標記的蛋白質免疫沉淀。為了確認質粒IL-15Ra的表達，使用來自上述實施例I的KKl. 23抗體進行免疫熒光試驗。將人IL-15Ra的ORF克隆到pTRACER表達載體中，所述載體也編碼綠色熒光蛋白質(GFP)報告基因。因此，發(fā)綠色熒光的細胞(圖2E-G)也表達pIL-15Ra。使用抗小鼠IgG-PE(Red)檢測KKl. 23抗人IL_15Ra。圖2D中展示未轉染的對照，而圖2E中展示同種型對照。數據說明pIL-15Ra質粒表達的能力以及抗人pIL-15Ra抗體檢測翻譯的蛋白質產物的能力。pIL_15Ra質粒編碼構型精確的和表面定位的蛋白質。組合pIL-15和pIL_15Ra作為佐劑為了研究pIL_15Ra與pIL_15相比增強免疫反應的能力，根據圖3A中展示的程序，對BALB/c小鼠進行脛骨前肌內免疫并伴隨進行體內電穿孔。用pVAX對照載體或具有 IOyg pIL-15、15yg pIL_15Ra 或 pIL-15 和 pIL_15Ra 兩者的 5yg 抗原構建體(HIV-lgag，HIV-lpol)，以40ul的最終體積將小鼠免疫。預先測定這些劑量以在初歩研究中得到最佳的反應(數據未展示)。如圖3B所示，如通過IFN-YELISpot的測量，用単獨的抗原構建體的免疫產生2，300個斑點形成細胞(SFC)/106脾細胞。pIL-15的添加增強反應至3，800個SFC的，而用pIL-15Ra和PIL_15共同免疫顯示超過單獨的抗原組的最顯著增カロ，產生5，900個SFC。這些結果支持了 IL-15/IL-15Ra免疫復合物的形成可擔當比單獨的IL-15更有效力的佐劑的觀點。 為了確定是否在體內真實地形成了這種免疫復合物，増加了另ー個免疫組，其中在不同的腿中注射PIL-15和pIL-15Ra (具有抗原)。在這種分開的遞送方法中，質粒遞送的IL-15和IL-15Ra不可能形成免疫復合物。發(fā)現在不同腿中的pIL_15和IL_15Ra的共同免疫引出與在同一腿中遞送相同組合所觀測的類似的IFN-Y水平(分別是4，562對4，072 SFC)。應注意，用抗原構建體和pIL-15R a的免疫組也增強抗原特異性IFN- Y分泌，達到大約3500個SFC(圖3B)。為了確認這些結果，我們用逐漸增加劑量的pIL_15R a質粒連同抗原構建體對ー個新的小鼠組進行免疫，以觀察pIL-15Ra是否會以劑量依賴方式誘導反應。如圖4所示,在測量的對pGag(視圖A)或pPol (視圖B)的反應中,pIL_15R α的包括確實以劑量依賴方式增強所誘導的IFN-γ的分泌。不考慮所使用的HIV-I抗原構建體，在使用的最高劑量下，用pIL_15Ra的共同免疫使細胞免疫反應增強I. 5至2倍。注意，即使在不存在IL-15，IL-15Ra似乎仍增強抗原特異性免疫反應。為了進一步確認pIL_15Ra的佐劑性質，研究了接種之后的⑶4+和⑶8+T細胞的效應子功能。在進行IFN-Y ELISpot試驗之前，從用先前提到(上文)的各種疫苗組合免疫的小鼠的脾細胞中除去⑶8+T細胞。如圖5A所示，從用pIL-15、pIL-15Ra或兩者的組合免疫的小鼠的脾細胞除去CD8+T細胞顯著地降低檢測到的IFN-Y分泌的量。與在全脾細胞中觀測的總反應(黒色條形圖)相比，在任何免疫的組中的CD4+T細胞貢獻(灰色條形圖)之間沒有差異。綜合來看，接種策略中的pIL-15Ra和pIL-15的組合比單獨遞送任何ー個構建體大大地增強免疫反應。這種累加效應主要作用于⑶8+T細胞，因為所述效應隨著此細胞群體的除去而損失。為了確定pIL_15Ra是否也會對體液免疫反應有作用，也通過ELISA測定了由各種接種策略引出的抗體反應。對來自免疫小鼠的血清進行試驗以測定針對HIV-1 Gag(p24)蛋白的IgG抗體的水平(圖5B)。雖然pIL-15和pIL-15Ra的組合對于引出細胞免疫性是最好的，但是與用PVAX(未檢測)、単獨的pGag或組合(I 800)免疫的小鼠相比，用単獨的pIL-15或pIL-15Ra免疫的小鼠具有HIV-I特異性抗體的最高效價(I 1600)。pIL-15Ra佐劑似乎不增強CD8+T細胞記憶如本文先前所述,將小鼠免疫三次；然而，并不在第三次免疫后一周處死這些動物，而是使它們靜養(yǎng)大約30周，以確保觀測的反應將主要歸因于記憶群體。如圖6A所示，一段顯著的靜養(yǎng)期之后的反應仍然十分強。用単獨的抗原構建體免疫的小鼠具有1700個SFC左右的反應。最高的反應明顯在用pIL-15免疫的小鼠組中，對于pIL-15和pIL-15/pIL-15Ra組合來所，都是約2800個SFC。在沒有pIL_15的情況下用pIL_15Ra共同免疫的小鼠中，不再觀測到佐劑影響(約1700個SFC)。也通過細胞內細胞因子染色和流式細胞術觀測到相同的趨勢(圖6B)，其中由CD8+T細胞產生的IFN-Y的水平在用pIL_15共同免疫的小鼠中最突出。觀測到在接種策略中添加pIL-15Ra對記憶反應幾乎不具有作用，而觀測到pIL-15具有大的作用。因此，支持了以下理論雖然pIL-15Ra在接種之后初期是強的佐劑，但是隨著時間的過去IL-15似乎是記憶CD8+T細胞的較佳誘導物。記憶抗體反應類似于在效應期期間觀測到的反應。如圖6C所示，用pIL-15免疫的小鼠在I : 1600的稀釋度下具有可檢測的對HIV-lGag(p24)的抗體，而包括pIL-15/pIL-15Ra的組合的所有其它的組，在I : 400稀釋度下就具有可檢測的對HIV-IGag(p24)的抗體。雖然顯示pIL-15在體液的產生以及細胞記憶反應中是有效的佐劑；但另一方面，PIL-15Rα似乎也在加快對抗原的急性免疫反應中發(fā)揮作用。無IL-15 的 pIL_15Ra 佐劑為了測試人IL_15Ra蛋白是否可通過與內源性鼠IL-15形成復合物或不依賴于IL-15來增強接種小鼠的免疫反應，在IL-15敲除的小鼠中進行接種研究。最初，作為對照，測試了翻譯的人IL-15Ra蛋白與小鼠IL-15的結合。如圖7A所示，用鼠IL-15孵育的S35放射性標記的人IL-15Ra蛋白能夠與抗小鼠IL-15 —起抗體免疫沉淀，暗示鼠IL-15與人IL-15Ra結合的能力。研究了在沒有鼠IL-15的情況下，pIL_15Ra的輔佐能力。因此，在IL-15敲除的小鼠中進行了相同的接種研究，所述小鼠缺乏內源性IL-15并且因此在NK和記憶⑶8+T細胞中具有缺陷(Kennedy等，2000)。圖7C展示，如通過IFN- y ELISpot的測定在所述敲除小鼠中，沒有內源性鼠IL-15的情況下，pIL-15Ra輔佐了免疫反應。此外，pIL_15和pIL-15Ra的組合未能進ー步增強最初在BALB/c小鼠中觀測到的由于單獨施用任何ー種佐劑的免疫反應。IL-15-/-小鼠是在來自Taconic的C57/BL6基礎上產生。因此，為了進行核實，我們在適當的背景對照小鼠中獲得如在BALB/c中觀測到的類似的反應，重復相同的試驗。圖7B展示來自用相同的程序的免疫的對照小鼠的結果并且顯示出與BALB/c免疫小鼠相同的趨勢。結論IL-15RQ構建體連同人IL-15和HIV-I抗原DNA構建體的共同免疫比單獨用抗原構建體的免疫產生大2. 5倍效カ的IFN- Y分泌水平(圖3B)。IFN- Y分泌可歸因于⑶8+T細胞，因為在接種到ELISpot之前除去這些細胞會導致少10倍的IFN-Y分泌。使用IL-15/IL-15RQ的組合遞送時，觀測到的效價的増加不可能是由于在轉染的細胞中形成了穩(wěn)定的復合物，因為向不同的腿(具有抗原)中注射這些pIL-15和pIL-15Ra也引出與在相同的腿中遞送時類似的免疫反應。因此，使用pIL-15/pIL-15Ra的共同遞送時觀測到的增強的反應更有可能是兩種獨立的佐劑的累加效應。如通過對血清中的IgG抗體的測定，這兩種佐劑的共同遞送似乎不會進一步增強體液免疫反應。也研究了組合的pIL-15/pIL_15Ra對免疫反應的長期作用。為了觀測記憶反應，在進行免疫分析之前，允許在第三次免疫之后經過30周。結果顯示，雖然這兩種佐劑的組合在免疫反應初期引出有效カ的CD8+T細胞反應，但是對記憶T細胞的作用主要僅在ー起使用PIL-15免疫的小鼠中觀測到。與単獨的抗原相比，增強的記憶免疫反應需要包括pIL-15。類似地，IL-15RQ最初引出的免疫反應等于或大于IL-15引起的免疫反應，但其對維持記憶反應沒有幫助。因此，雖然IL-15RCI擴展了反應爆發(fā)量(burst size)，但是在沒有記憶IL-15信號的情況下的釋放量不足以維持長期反應。在一次意外的觀測中，具有pIL_15Ra的抗原質粒的遞送也增強細胞免疫反應，并且等于由pIL-15引出的免疫反應。為確認，用逐漸增加量的pIL-15Ra進行免疫并且觀測到劑量依賴反應?？赡苁侨薎L-15Ra蛋白能夠與內源性鼠IL-15結合并且以類似方式將其轉呈，因為鼠IL-15與人IL-15約73%—致(Anderson等，1995a)。為了檢驗此假設，將缺乏任何內源性IL-15的IL-15敲除的小鼠免疫。與單獨的抗原相比，在用pIL-15Ra免疫的IL-15敲除的小鼠中觀測到大約2倍増加。由于難于大量地獲得在6-8周齡之間的IL-15-/-雌性小鼠，在這些實驗中排除了 pIL-15組。然而，不再觀測到pIL-15/pIL-15Ra的組合的增強效應。應注意，對照C57/BL6小鼠顯示出在BALB/c小鼠中看到的相同的趨勢 (雖然PVAX組的總斑點數較低和背景值更高)，甚至與C57/BL6小鼠相比，IL-15敲除的小鼠的反應總體更低。先前描述這些小鼠具有些許缺陷型宿主防御反應，包括不能保護免受牛痘攻毒(Kennedy等，2000)。不考慮總體較低的免疫反應，在沒有任何內源性IL-15的情況下，仍然觀測到pIL-15Ra的輔佐效應。雖然不希望受理論束縛，但從對結果全面補充考慮，認為IL-15Rci可擔當能夠引出不依賴于IL-15的反應的新穎佐劑。這種免疫反應增強似乎特別地集中在宿主T細胞反應的急性期而非記憶期期間的免疫擴展上。參考文獻AMARA, R. 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權利要求
1.一種組合物，其包含編碼免疫原的分離的核酸分子；和編碼IL-15RCI或其功能片段的分尚的核酸分子。
2.根據權利要求I所述的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原、癌癥相關的抗原或與涉及自身免疫疾病的細胞相關的抗原。
3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述免疫原是來自引起慢性感染的病原體的病原體抗原。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的組合物，其中所述編碼IL-15RCI的分離的核酸分子包含編碼IL-15Ra的核酸編碼序列，所述IL_15Ra具有如SEQ ID NO :1所述的序列。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其進ー步包含編碼IL-15或其功能片段的核酸序列。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的組合物，其中所述核酸分子是質粒。
7.—種可注射的藥物組合物，其包含根據權利要求1-6中任一項所述的組合物。
8.一種誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，其包括對所述個體施用根據權利要求1-7中任一項所述的組合物。
9.ー種重組疫苗，其包含編碼可操作地連接于調控元件的免疫原的核苷酸序列和編碼IL-15Ra或其功能片段的核苷酸序列。
10.根據權利要求9所述的重組疫苗，其中所述免疫原是病原體抗原、癌癥相關的抗原或與涉及自身免疫疾病的細胞相關的抗原。
11.根據權利要求10所述的重組疫苗，其中所述免疫原是來自引起慢性感染的病原體的病原體抗原。
12.根據權利要求9-11中任一項所述的重組疫苗，其中編碼IL-15Ra的所述分離的核酸分子包含編碼IL-15Ra的核酸編碼序列，所述IL-15Ra具有如SEQID NO 1所述的序列。
13.根據權利要求9-12中任一項所述的重組疫苗，其進ー步包含編碼IL-15或其功能片段的核酸序列。
14.一種誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，其包括對所述個體施用根據權利要求9-13中任一項所述的重組疫苗。
15.—種活減毒病原體,其包含編碼IL_15Ra或其功能片段的核苷酸序列。
16.根據權利要求15所述的活減毒病原體，其中所述病原體是引起慢性感染的病原體的減毒株。
17.根據權利要求15或16中任一項所述的活減毒病原體,其中編碼IL-15Ra的所述核酸編碼序列是SEQ ID NO =I0
18.根據權利要求15-17中任一項所述的活減毒病原體，其進ー步包含編碼IL-15或其功能片段的核酸序列。
19.一種誘導個體對免疫原的免疫反應的方法，其包括對所述個體施用根據權利要求15-18中任一項所述的活減毒病原體。
20.ー種核酸分子，其包含具有IL-15Ra免疫調節(jié)功能、IL-15結合功能、與IL-15受體復合物的其它亞單位結合的功能或其組合的SEQ ID NO :1或其片段。
全文摘要
公開了包含編碼免疫原的一種或多種分離的核酸分子連同編碼IL-15Rα或其功能片段的分離的核酸分子的組合物、重組疫苗和活減毒病原體。公開了使用此類組合物誘導個體對免疫原的免疫反應的方法。
文檔編號A61K39/00GK102821790SQ201080040593
公開日2012年12月12日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權日2009年9月14日
發(fā)明者D·B·韋納, K·A·克賴尼亞克, M·庫茲勒 申請人:賓夕法尼亞大學托管會