專利名稱：用于多價rna干擾的多核苷酸、組合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明大體上涉及精確構建的多核苷酸分子以及利用所述多核苷酸分子用于多價RNA干擾和治療疾病的方法。相關技術描述基因沉默或抑制基因表達的現(xiàn)象對于治療和診斷目的及對于研究基因功能本身來說具有重要的保證。該現(xiàn)象的實例包括反義技術和dsRNA形成的轉錄后基因沉默 (PTGS)，其以RNA干擾(RNAi)的形式變得普遍。用于基因沉默的反義策略近年來備受關注?；靖拍詈唵?，但原理上有效反義核酸(NA)堿基與靶RNA配對導致所靶定的RNA失活。由反義RNA或DNA識別靶RNA可以被認為是雜交反應。由于靶是通過序列互補性結合的，這意味著反義NA的合適選擇應當保證高特異性。所靶定RNA的失活可以通過不同途徑發(fā)生，取決于反義NA(已修飾或未修飾的 DNA或RNA，或其雜化物)的性質(zhì)和發(fā)生抑制的生物系統(tǒng)的特性?；赗NA i的基因阻抑是廣泛認可的方法，其中正義和反義RNA形成雙鏈 RNA (dsRNA)，如作為長RNA雙鏈(19- 個核苷酸雙鏈)，或作為短發(fā)卡dsRNA雙鏈(shRNA)， 其通過包括酶和/或蛋白復合物機制與基因調(diào)控有關。長RNA雙鏈和shRNA雙鏈是通過描述為Dicer的內(nèi)切核糖核酸酶加工成小干擾RNA (siRNA)的前體。所加工的siRNA或直接引入的siRNA被認為連接蛋白復合物RISC用于導向由RISC/siRNA復合物剪切的互補基因。然而，有效的反義和RNAi技術發(fā)展中持續(xù)存在許多問題。例如，DNA反義寡聚核苷酸顯示僅短期有效并且通常所需劑量是有毒的；同樣地，反義RNA的使用由于穩(wěn)定性問題也被證明無效。此外，已證明在RNAi中使用的siRNA由于任一鏈導向剪切潛在包括于內(nèi)源性調(diào)節(jié)途徑的復合物而導致重要的脫靶阻抑。已嘗試使用各種方法通過降低核酸酶的敏感性和利用對siRNA的化學修飾來提高反義穩(wěn)定性。這些包括修飾正常的磷酸二酯骨架， 如利用硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，摻入2’ -OMe-核苷酸，利用肽核酸(PNA)，以及利用3’端加帽，如3’ -氨丙基修飾或3’ -3’端鍵。然而，這些方法可能是昂貴的并且需要額外的步驟。此外，非天然存在的核苷酸的使用和修飾排除了體內(nèi)表達反義或siRNA序列的能力，從而需要合成它們并隨后給予。另外，siRNA雙鏈對單基因顯示主要效力而對第二基因脫靶。 該無意的作用是負面的并且不是可靠的RNAi多價。
因此，仍然還存在需要用于靶定、定向抑制體外和體內(nèi)，特別是高等脊椎動物細胞內(nèi)的基因功能的有效和持續(xù)的方法和組合物，包括能夠多價基因抑制的單分子復合物。發(fā)明簡述本發(fā)明提供新的組合物和方法，其包括精確構建的寡聚核苷酸，當核苷酸靶位點序列各自互不相同時，所述寡聚核苷酸在同時特異性調(diào)節(jié)一個或多個基因的基因表達中是有用的。在某些實施方案中，本發(fā)明包括分離的精確構建的三鏈多核苷酸復合物，其包含具有與靶基因或序列在多個位點互補的序列區(qū)或與多個基因在單個位點互補的序列的區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明包括分離的精確構建的多核苷酸，其包含具有與靶基因或序列在多個位點互補的序列區(qū)或與多個基因在單個位點互補的序列區(qū)；各自具有部分自身互補區(qū)。在具體實施方案中，所述寡聚核苷酸包含兩個或多個自身互補區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含RNA、DNA或肽核酸。某些實施方案涉及至少三個分開的多核苷酸的多核苷酸復合物，所述多核苷酸復合物包含(a)第一多核苷酸，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；(b)第二多核苷酸，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；以及(c)第三多核苷酸，其包含無效區(qū)或與第三靶特異性互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，其中所述第一、第二和第三多核苷酸的靶特異性區(qū)各自與不同的靶序列互補，其中所述第一多核苷酸的5’區(qū)與第三多核苷酸的3’區(qū)互補，其中所述第一多核苷酸的3’區(qū)與所述第二多核苷酸的5’區(qū)互補，以及其中所述第二多核苷酸的3’區(qū)與所述第三多核苷酸的5’區(qū)互補，并且其中所述三個分開的多核苷酸通過它們互補的3’區(qū)和5’區(qū)雜交以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的多核苷酸復合物。在某些實施方案中，所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含約15-30個核苷酸。 在某些實施方案中，所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含約17-25個核苷酸。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含約5-10個核苷酸對。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含約7-8個核苷酸對。在某些實施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的每個存在于相同的基因、 cDNA、mRNA或microRNA中。在某些實施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的至少兩個存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。在某些實施方案中，各多核苷酸的5’區(qū)和/或3’區(qū)全部或部分還與該多核苷酸的靶序列互補。在某些實施方案中，一個或多個自身互補區(qū)包含3’突出。某些實施方案涉及自身雜交多核苷酸分子，所述自身雜交多核苷酸分子包括(a) 第一核苷酸序列，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，(b)第二核苷酸序列，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，以及(c)第三核苷酸序列，其包含無效區(qū)或與第三靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，其中所述各第一、第二和第三核苷酸序列的靶特異性區(qū)與不同的靶序列互補，其中所述第一核苷酸序列的5’區(qū)與所述第三核苷酸序列的3’區(qū)互補，其中所述第一核苷酸序列的3’區(qū)與所述第二核苷酸序列的5’區(qū)互補，以及其中所述第二核苷酸序列的3’區(qū)與所述第三核苷酸序列的5’區(qū)互補，并且其中所述5’區(qū)各自與它們互補的3’區(qū)雜交以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的自身雜交多核苷酸分子。
在某些實施方案中，所述第一、第二或第三多核苷酸序列包含約15-60個核苷酸。 在某些實施方案中，所述靶特異性區(qū)包含約15-30個核苷酸。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含約IO-M個核苷酸。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含3’突出。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)形成莖-環(huán)結構。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含在靶特異性區(qū)之外的二核苷酸AG/UU近端盒。在某些實施方案中，一個或多個所述自身互補區(qū)包含在靶特異性區(qū)之外的四核苷酸遠端盒，其中所述遠端盒的第三個核苷酸不是G。還包括的是編碼自身雜交多核苷酸分子的載體，如本文所述。在某些實施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的每個存在于相同的基因、 cDNA、mRNA或microRNA中。在某些實施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的至少兩個存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。在某些實施方案中，自身互補區(qū)包含由雙環(huán)、四環(huán)或更大的環(huán)組成的莖-環(huán)結構。 在某些實施方案中，所述序列與包含至少17個核苷酸或17至30個核苷酸(包括其中所有整數(shù))的靶基因序列互補。在某些實施方案中，所述自身互補區(qū)(或雙鏈區(qū))包含至少5個核苷酸、至少6個核苷酸、至少M個核苷酸、或者12至M或60個核苷酸(包括其中所有整數(shù))。在某些實施方案中，莖-環(huán)結構的環(huán)區(qū)包含至少1個核苷酸。在某些實施方案中， 所述環(huán)區(qū)包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或至少8個核苷酸。在進一步的實施方案中，莖-環(huán)結構的環(huán)區(qū)由特定的四環(huán)序列NGNN或AAGU或 UUUU或UUGA或GUUA組成，其中這些序列是5’至3’。在進一步的實施方案中，本發(fā)明包括能夠表達本發(fā)明的多核苷酸的表達載體。在不同的實施方案中，所述表達載體是組成型或誘導型載體。本發(fā)明進一步包括包含生理上可接受的載體和本發(fā)明的多核苷酸的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于減少基因表達的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子引入細胞。在不同的實施方案中，所述細胞是植物、動物、原生動物、病毒、細胞或真菌。在一個實施方案中，所述細胞是哺乳動物。在一些實施方案中，將所述多核苷酸復合物或分子直接引入所述細胞，而在另一個實施方案中，將所述多核苷酸復合物或分子通過足以遞送分離的多核苷酸的方法細胞外引入所述細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括治療疾病的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子引入細胞，其中所靶定基因的過表達與疾病相關。在一個實施方案中， 所述疾病是癌癥。本發(fā)明進一步提供在患者中治療感染的方法，所述方法包括向患者引入本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子，其中所述分離的多核苷酸介導感染因子的進入、復制、整合、傳播或維持。在又一個相關的實施方案中，本發(fā)明提供用于鑒別基因功能的方法，所述方法包括向細胞引入本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子，其中所述多核苷酸復合物或分子抑制所述基因的表達，以及測定所述多核苷酸復合物或分子的引入對所述細胞特性的影響，從而確定所靶定基因的功能。在一個實施方案中，所述方法利用高通量篩選進行。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供設計包含用于調(diào)節(jié)靶基因表達的兩個或多個自身互補區(qū)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括(a)選擇長度為17至25個核苷酸并且與靶基因或多靶基因互補的第一 3個引導序列；(b)選擇長度為4至M個核苷酸的一個或多個另外的序列，其包含自身互補區(qū)并且與所述第一序列不完全互補；以及任選地，(c)定義(b)中的序列基序互補、不互補，或者復制與步驟(a)中所選擇的序列不互補的基因序列。在另一個實施方案中，所述突變的基因是由編碼突變體p53多肽的基因表達的基因。在另一個實施方案中，所述基因是病毒，并且可以包括一個或多個不同的病毒基因。在具體實施方案中，所述基因是HIV基因，如gag、p0l、enV或tat等等本文所述和本領域內(nèi)已知的基因。在另一個實施方案中，所述基因是ApoB。附圖簡要說明
圖1至圖6示出本發(fā)明的示例性多核苷酸結構。圖1給出三個分開的多核苷酸分子的多核苷酸復合物。(A)顯示包含與靶基因上的位點互補的序列區(qū)(陰影線)；(B)顯示包含與靶基因上的第二位點或不同基因上的位點互補的序列區(qū)(交叉-陰影線)；(C)顯示與靶基因上的第三位點或不同基因上的位點互補的序列區(qū)(填充為黑色)。數(shù)字1、2和3指示導向基因沉默的各寡聚核苷酸的3’端；(A) 負荷于方向1，⑶方向2及(C)方向3。各分子的3’區(qū)和5’區(qū)相互雜交以形成它們各自的自身互補區(qū)或雙鏈區(qū)，由連接條指示。各多核苷酸包含兩個核苷酸3’突出。圖2給出本發(fā)明具有三個單鏈區(qū)和三個自身互補區(qū)的單一自身雜交的多核苷酸， 其是用于加工成核心分子的前體。靶特異性區(qū)加黑。(D)顯示用四核苷酸的四環(huán)加帽的自身互補莖-環(huán)區(qū)(填充為白色)；(D)還顯示在莖-環(huán)結構之內(nèi)具有14/16個核苷酸剪切位點的莖-環(huán)區(qū)；剪切可以通過RNase III發(fā)生以去除莖環(huán)核苷酸(顯示為白色)；(E)顯示遠端盒，其中由5’至3’確定的第三個核苷酸不為G，因為認為G的存在會阻斷去除莖-環(huán)區(qū)所必需的RNase III剪切；(F)顯示二核苷酸AG/UU近端盒，其為RNaseIII識別和結合 RNase III的體內(nèi)決定因素(Nichols 2000) ； (G)顯示四環(huán)。圖2中給出的多核苷酸分子是加長的轉錄本RNA，在細胞內(nèi)由RNase III “預加工”。所得RNA結構與圖1中描述的結構相同。圖3描述具有四環(huán)形式的自身-形成的單鏈寡聚核苷酸。(H)顯示四環(huán)；(I)顯示當前導鏈摻入2個核苷酸突出時連接兩個核心鏈的三環(huán)。在該結構中，將四環(huán)用于模擬圖1給出結構中的突出的3’羥基/5’磷酸酯會怎樣并且比圖2給出的結構更直接起作用。 正如實施例2所證實，該短的四環(huán)形式直接導向沉默而無預加工。認為GUUA環(huán)扭曲環(huán)內(nèi)的核苷酸并暴露氫原子(參見如，Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 3, Fig. 6, page 1094)。該結構與PAZ或RISC相容。圖4描述了用于二價應用的自身-形成的單鏈寡聚核苷酸。(J)顯示連接兩個核心鏈的更大的環(huán)；(K)顯示作為競爭復合物形成的關鍵鏈，但是對靶基因“無效”，即對靶基因非特異。兩個靶特異性區(qū)有陰影線。該結構是與RNA轉錄本合作時用于“二價”應用的組合物。由于化學修飾是不可能的，所述結構決定了負荷和沉默活性不均勻。分子的初始 19個核苷酸是I3RIMARY鏈，(K)顯示失活的KEY鏈，以及SECONDARY鏈是分子的最后21個核苷酸。首要優(yōu)先負荷至RISC并且起作用是SECONDARY鏈通過暴露5’/3’端。其次優(yōu)先 I3RIMARY鏈，其在細胞中RNase III預加工之后暴露。無效的KEY鏈的3，端不起作用，因為大的環(huán)既未加工也不與負荷至RISC自身相容。圖5描述了本發(fā)明多核苷酸復合物具有修飾的RNA堿基。(L)、(M)和(N)示出Tm 可以通過使用修飾的RNA(如2’ -0-甲基RNA或2’ -氟RNA取代2’ -OH RNA)逐步增加的區(qū)(由虛線限定)，以優(yōu)選端1、2或3的退火和/或沉默順序。圖6描述了本發(fā)明寡聚核苷酸復合物的兩個實施方案。(0)示出該鏈沉默功能失活的平端DNA鏈；和(P)示出可以利用用于偶聯(lián)遞送化學物質(zhì)、配體、抗體或其他凈荷或靶分子的端。圖7給出與標準shRNA分子相比，由本發(fā)明的多價-siRNA分子阻抑GFP表達的結果(參見實施例1)。圖7A給出相對shRNA對照(設置為100%)，由MV克隆long 1(108%) 和MV克隆long 11 (119% )增強阻抑GFP。圖7B給出相對shRNA對照(設置為100% )， 由合成的MV-siRNA GFP 1 (127% )增強阻抑GFP表達，當合成的MV_siRNA復合物的一條鏈由DNA鏈(MF-siRNA GFP I DNA(116%))置換時其輕微降低。圖8給出用于GFP編碼序列(SEQ ID NO 8)的示例性靶定區(qū)(下劃線)。圖8A給出由實施例1中的表1和表2的MV-siRNA分子靶定的區(qū)。圖8B和圖8C 給出另外的示例性靶定區(qū)。圖9給出MV-siRNA分子對HIV復制的抑制作用，其中靶定gag和tat的二價 MV-siRNA對HIV復制的抑制作用比僅靶定gag的siRNA顯著更強。二價MV-siRNA顯示10 天時56. 89%的抑制，40天時60. 02 %的抑制，相比單獨靶定gag的siRNA，其顯示10天時 19. 77 %的抑制，40天時32. 43 %的抑制。圖10給出示例性HIV基因組核苷酸序列(SEQ ID NO :9)，其可以根據(jù)本發(fā)明的 MV-siRNA分子被靶定。該序列從圖IOA延伸至圖10D。圖11給出env基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :4)，源自圖10的HIV基因組序列。圖12提供另外的HIV序列。圖12A給出gag基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)， 圖12B給出tat基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)，二者都源自圖10的HIV基因組序列。圖13給出鼠科動物載脂蛋白B(ApoB)的編碼序列(SEQ ID N0:10)，其可以使用本文提供的某些MV-siRNA靶定。該序列從圖13A延伸至圖13E。圖14給出人載脂蛋白B(apoB)的mRNA序列(SEQ ID NO :1)，其可以使用本文提供的某些MV-siRNA靶定。該序列從圖14A延伸至圖14E。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于在多靶位點抑制基因表達或用于在一個或多個靶位點抑制多個基因表達的新的組合物和方法，其中所述位點在真核細胞體內(nèi)和體外并非相等的核苷酸序列。特別地，本發(fā)明提供多核苷酸復合物和多核苷酸分子，其包含具有與一個或多個靶基因區(qū)互補的序列的兩個、三個或多個區(qū)，其能夠靶定并減少靶基因表達。在不同的實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可以用于通過靶定靶基因內(nèi)或它表達的RNA的多位點而抑制單靶基因的表達?？蛇x擇地，它們可以用于通過靶定兩個或多個不同的基因內(nèi)或它們表達的 RNA的位點而靶定兩個或多個不同的基因。本發(fā)明提供優(yōu)于傳統(tǒng)SiRNA分子的重要優(yōu)勢。首先，與僅靶定靶基因內(nèi)一個區(qū)的RNAi因子相比，當本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子靶定單靶基因內(nèi)的兩個或多個區(qū)時，它們能夠?qū)崿F(xiàn)更強的抑制來自靶基因的基因表達。此外，利用單一多核苷酸復合物或分子，本發(fā)明靶定兩個或多個不同靶基因的多核苷酸復合物或分子可以用于抑制與疾病或障礙相關的多靶基因的表達。此外，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子無需存在于常規(guī)雙鏈RNAi因子中的另外的非靶定鏈，因此它們沒有由非靶定鏈引起的脫靶效應。因此，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子提供令人驚奇的優(yōu)于現(xiàn)有技術的多核苷酸抑制物(包括反義RNA和RNA干擾分子)的優(yōu)勢，包括針對一個或多個靶基因的增加的潛力和增強的效力。本發(fā)明還基于利用與靶基因的一個、兩個或三個不同核酸序列互補的僅一條、兩條或三條引導鏈，識別導向用于剪切的蛋白復合物的多核苷酸結構。雖然利用許多相同的內(nèi)源性機制，該多價功能致使比dsRNA顯著更廣泛和有力的抑制靶基因或靶基因組。本發(fā)明的某些實施方案還基于識別由3’突出和5’磷酸酯表示方向的多核苷酸結構致使不含正義鏈的復合物，有助于比基于dsRNA的siRNA更強的特異性。鑒于它們的有效性，可以將本發(fā)明的組合物遞送至細胞或受體，具有由與靶基因或多靶基因互補的單引導鏈特異性預測的伴隨保證。多價 siRNA本發(fā)明包括包含與一個或多個靶基因區(qū)互補的兩個或多個靶定區(qū)的多核苷酸復合物和分子。本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子可以被稱為多價siRNA (mv-siRNA)，因為它們包含與一個或多個靶基因區(qū)互補的至少兩個靶定區(qū)。因此，通過靶定單靶基因內(nèi)的兩個或多個區(qū)，或者通過靶定兩個或多個靶基因內(nèi)的一個或多個區(qū)，本發(fā)明的組合物和方法可以用于抑制或減少一個或多個靶基因的表達。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物包含三個或多個分開的寡聚核苷酸，各自具有5’端和3’端，具有包含靶定區(qū)的兩個或多個寡聚核苷酸，如本文所述寡聚核苷酸相互雜交以形成復合物。各鏈在本文被稱為“引導鏈”。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸分子是包含三條或多條引導鏈的單一多核苷酸，具有包含靶定區(qū)的兩條或多條引導鏈，其中多核苷酸通過自身互補區(qū)自身雜交以形成本文所述的結構。然后可以例如細胞內(nèi)加工所得到的結構，以去除連接各條引導鏈的環(huán)結構?？梢源嬖谟诓煌墓丫酆塑账嶂谢騿我欢嗪塑账醿?nèi)的各引導鏈包含與其他弓I導鏈互補的區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供多核苷酸復合物和分子，其包含至少三條引導鏈， 其中至少兩條包含與一個或多個靶基因內(nèi)的不同序列互補的區(qū)。在不同的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物包含各自包含一條或多條引導鏈的兩個、三個或多個分開的多核苷酸，其可以相互雜交以形成復合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸分子包含單一多核苷酸，其在單一多核苷酸的不同區(qū)內(nèi)包含三條或多條引導鏈。本發(fā)明的某些實施方案涉及具有至少三條引導鏈的多核苷酸復合物或分子，其中兩條或多條與一個或多個靶基因部分或全部互補；并且在相互互補(即與另一條引導鏈的區(qū)互補)的任一端處各自具有約4至約12個，約5至約10個，或優(yōu)選約7至約8個核苷酸， 允許形成多核苷酸復合物(參見如圖1)。例如，引導鏈的各端可以包含與多核苷酸復合物或分子的另一條引導鏈的一端處的核苷酸互補的核苷酸。某些實施方案可以包括包含4、5、 6或更多個(條)獨立的多核苷酸分子或引導鏈的多核苷酸復合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物包含至少三個分開的多核苷酸，其包括(1)第一多核苷酸，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；( 第二多核苷酸，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；以及C3)第三多核苷酸， 其包含無效區(qū)或與第三靶特異性互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，其中所述第一、第二和第三多核苷酸的靶特異性區(qū)各自與不同的靶序列互補，其中所述第一多核苷酸的5’區(qū)與所述第三多核苷酸的3’區(qū)互補，其中所述第一多核苷酸的3’區(qū)與所述第二多核苷酸的5’區(qū)互補，以及其中所述第二多核苷酸的3’區(qū)與所述第三多核苷酸的5’區(qū)互補，并且其中所述三個分開的多核苷酸通過它們互補的3’和5’區(qū)雜交，以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的多核苷酸復合物。如以上所述，在具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物包含至少三個分開的寡聚核苷酸，各自具有5’端和3’端。如圖1所示，第一寡聚核苷酸的5’端處的區(qū)與第三寡聚核苷酸的3’端處的區(qū)退火；第三寡聚核苷酸的5’端處的區(qū)與第二寡聚核苷酸的3’端處的區(qū)退火；以及第二寡聚核苷酸的5’端處的區(qū)與第一寡聚核苷酸的3’端處的區(qū)退火。 如果復合物中存在另外的寡聚核苷酸，那么它們以相似的方式與復合物的其他寡聚核苷酸退火。寡聚核苷酸末端處相互退火的區(qū)可以包括5’端和/或3’端處的終端核苷酸。雜交的3’端和5’端的區(qū)都包括寡聚核苷酸的終端核苷酸，所得到的雙鏈區(qū)是平端。在具體實施方案中，3’端處退火的區(qū)不包括終端和/或倒數(shù)第二個核苷酸，得到的雙鏈區(qū)具有一個或兩個核苷酸3’突出。在某些實施方案中，所述引導鏈存在于單一多核苷酸分子中，并且雜交以形成具有三個單鏈區(qū)和三個自身互補區(qū)(或雙鏈區(qū))的單一自身雜交多核苷酸，以及至少兩個靶特異性區(qū)(參見如圖2)。在相關實施方案中，單分子可以包含至少3、至少4、至少5或至少 6條引導鏈，并且分別形成具有至少3、至少4、至少5或至少6個自身互補區(qū)(或雙鏈區(qū)) 和至少2、至少3、至少4或至少5個靶特異性區(qū)的單一自身雜交多核苷酸。在具體實施方案中，該單一自身雜交多核苷酸是前體分子，其可以由細胞加工以去除環(huán)區(qū)和任選地許多近端雙鏈區(qū)，得到活性mv-siRNA分子(參見如圖2)。因而，在具體實施方案中，本發(fā)明包括自身雜交多核苷酸分子，所述自身雜交多核苷酸分子包含(1)第一核苷酸序列，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’ 區(qū)；( 第二核苷酸序列，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；以及(3) 第三核苷酸序列，其包含無效區(qū)或與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列的靶特異性區(qū)各自與不同的靶序列互補，其中所述第一核苷酸序列的5’區(qū)與所述第三核苷酸序列的3’區(qū)互補，其中所述第一核苷酸序列的3’區(qū)與所述第二核苷酸序列的5’區(qū)互補，以及其中所述第二核苷酸序列的3’區(qū)與所述第三核苷酸序列的5’區(qū)互補，并且其中所述5’區(qū)各自與它們互補的3’區(qū)雜交，以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的自身雜交多核苷酸分子。在具體實施方案中，本發(fā)明的單一自身雜交多核苷酸可以在多核苷酸與其自身退火時形成的單鏈環(huán)中包含一個或多個可剪切的核苷酸。一旦單一自身雜交多核苷酸與其自身退火，所述可剪切的核苷酸可以被剪切以得到包含三個或多個分開的寡聚核苷酸的多核苷酸復合物。根據(jù)本發(fā)明可以使用的可剪切的核苷酸的實例包括但不限于，可光剪切的核苷酸，如 pcSpacer(Glen Research Products, Sterling, VA, USA)，或亞磷酰胺核苷酸。如本文所使用，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包括分離的多核苷酸，其包含三個單鏈區(qū)，其中至少兩個與兩個或多個靶序列互補，各靶序列位于一個或多個靶基因內(nèi)，并且包含通過形成雙鏈區(qū)如莖-環(huán)結構而相互連接單鏈區(qū)的5’端或3’端的至少兩個或三個自身互補區(qū)。所述多核苷酸在本文中還可以被稱為寡聚核苷酸。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包含與靶基因互補的兩個或多個序列區(qū)。在具體實施方案中，這些區(qū)與相同的靶基因或基因互補，而在另一個實施方案中，它們與兩個或多個不同的靶基因或基因互補。因此，本發(fā)明包括一個或多個自身互補多核苷酸，其包含與一個或多個靶基因或基因互補的一系列序列。在具體實施方案中，這些序列由與靶基因序列不互補或不完全互補和與自身互補區(qū)不互補的序列區(qū)分開。在另一個實施方案中，所述多核苷酸包含與靶基因或基因互補的多個序列，所述多核苷酸包含在與靶基因互補的一個或多個序列區(qū)的5’ 端、3’端或二者處的自身互補區(qū)。在具體實施方案中，多核苷酸包含與一個或多個靶基因互補的兩個或多個序列區(qū)，具有位于與靶基因互補的各引導鏈的5’端和3’端處的自身互補區(qū)。在某些實施方案中，除了與它們相應的3’或5’區(qū)互補之外，這些3’區(qū)和5’區(qū)全部或部分可以與所述靶序列互補。術語“互補”是指根據(jù)標準堿基配對原則全部或部分相互互補的核苷酸序列。術語“部分互補”是指具有小于完全互補但仍具有足夠數(shù)量的互補核苷酸對來支持生理條件下核苷酸延伸內(nèi)的結合或雜交的序列。具體實施方案在具體實施方案中，與靶基因(即靶定區(qū))互補的引導鏈區(qū)與靶基因相比可以包含一個或多個核苷酸錯配。任選地，引導鏈中的錯配核苷酸可以用解鎖核酸 (UNA)或亞磷酰胺核酸(如rSpacer，Glen Research，Sterling，VA，USA)置換，以允許錯配的核苷酸與靶基因堿基配對，如沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對。如本文所使用，術語“自身互補”或“自身互補區(qū)”可以指本發(fā)明的多核苷酸分子的區(qū)，該區(qū)與相同分子的另一個區(qū)結合或雜交以形成A-T(U)和G-C雜交對，從而形成雙鏈區(qū)； 和/或可以指第一核苷酸分子的區(qū)，該區(qū)與第二或第三核苷酸分子的區(qū)結合以形成本發(fā)明的多核苷酸復合物(即RNAi多核苷酸復合物)，其中所述復合物能夠?qū)箖蓚€或多個靶位點的RNAi干擾活動。相互結合以形成自身互補區(qū)的兩個區(qū)可以是鄰近的，或者可以由其他核苷酸分開。此外，正如在RNAi多核苷酸復合物中，兩個區(qū)可以在分開的核苷酸分子上。在某些實施方案中，“自身互補區(qū)”包含與所定義的第二或第三核苷酸序列的“5’ 區(qū)”結合或雜交的所定義的第一核苷酸序列的“3’區(qū)”，其中所定義的第二或第三序列在相同分子內(nèi)，以形成自身雜交多核苷酸分子。在某些實施方案中，“自身互補區(qū)”包含與分開的多核苷酸分子的“5’區(qū)”結合或雜交的第一多核苷酸分子的“3’區(qū)”，以形成多核苷酸復合物。這些3’區(qū)和5’區(qū)一般定義為與它們各自的靶特異性區(qū)相關，在于5’區(qū)在靶特異性區(qū)的5’端處，而3’區(qū)在靶特異性區(qū)的3’端處。在某些實施方案中，這些3’區(qū)和5’區(qū)中的一個或兩個不僅與它們相應的3’區(qū)或5’區(qū)雜交以形成自身互補區(qū)，還可以被設計成包含它們各自靶序列的全部或部分互補，從而形成部分靶特異性區(qū)。在這些實施方案中，靶特異性區(qū)包含單鏈區(qū)和自身互補(即雙鏈)區(qū)。在某些實施方案中，這些“自身互補區(qū)”包含約5-12個核苷酸對，優(yōu)選5-10或7-8 個核苷酸對，包括它們之間的全部整數(shù)。同樣地，在某些實施方案中，各3’區(qū)或5’區(qū)包含約5-12個核苷酸，優(yōu)選5-10或7-8個核苷酸，包括它們之間的全部整數(shù)。
術語“不互補”表明在核苷酸的特定延伸中，與靶比對之內(nèi)沒有核苷酸來形成 A-T(U)或G-C雜交。術語“不完全-互補”表明在核苷酸延伸中，與靶比對的至少一個核苷酸對來形成A-T(U)或G-C雜交，但是互補核苷酸對的數(shù)量不足以在生理條件下的核苷酸延伸內(nèi)支持結合。術語“分離的”是指至少部分不含在物質(zhì)的自然狀態(tài)時正常伴隨該物質(zhì)的組分的物質(zhì)。分離意味著從原始來源或環(huán)境一定程度的分開。如本文所使用，分離的，例如與DNA 相關，是指基本上遠離另一編碼或非編碼序列的多核苷酸，并且DNA分子可以包含大部分不相關的編碼DNA，如大的染色體片段或其他功能性基因或多肽編碼區(qū)。當然，這是指作為原始分離的DNA分子，并不排除隨后由人工添加到區(qū)段的基因或編碼區(qū)。在各種實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子包含RNA、DNA或肽核酸或這些類型分子的任意或全部組合。此外，多核苷酸可以包含修飾的核酸或核酸衍生物或類似物。核酸修飾的一般實例包括但不限于生物素標記、熒光標記、將伯胺引入多核苷酸的氨基修飾劑、磷酸基團、脫氧尿苷、鹵化核苷、硫代磷酸、2’-0_甲基RNA類似物、手性RNA類似物、 擺動(wobble)基團、通用堿基和脫氧肌苷。多核苷酸或寡聚核苷酸的“亞單位”是指一個核苷酸(或核苷酸類似物)單位。術語可以涉及具有或不具有附著的亞單位間連接的核苷酸單位，盡管當涉及“帶電荷的亞單位”時，電荷一般存在于亞單位間連接內(nèi)(如磷酸或硫代磷酸酯鍵或陽離子鍵)。特定合成的MV-siRNA可以利用一個或多個不同類型的亞單位和/或亞單位間連接，主要改變它的穩(wěn)定性、Tm、RNase靈敏度或所期望的其他特征。例如，某些實施方案可以使用具有一個或多個2’ -0-甲基RNA亞單位的RNA亞單位。多核苷酸或寡聚核苷酸的環(huán)化亞單位可以基于核糖或其他戊糖，或在某些實施方案中，替代或修飾基團。修飾的寡聚核苷酸骨架的實例包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3’ -亞烴基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、磷酰胺酯(包括3’ -氨基磷酰胺酯和氨烷基磷酰胺酯)、磷酰二胺酯、硫羰磷酰胺酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和borano磷酸酯(boranophosphates)，所述borano磷酸酯具有正常3’ _5，連接，這些2’ -5，連接的類似物和那些具有反向極性的類似物，其中核苷單位的鄰近對之間通過3’ -5’與5’ -3’或 2’ -5’與5’ -2’相連接。還可預期的是肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、2’ -0-甲基寡聚核苷酸(2’ -OMe), 2'-甲氧基乙氧基寡聚核苷酸(MOE)等等本領域內(nèi)已知的寡聚核苷酸。嘌呤或嘧啶堿基配對部分一般是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。還包括的是諸如4-吡啶酮、2-吡啶酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6_三甲氧基苯(2,4, 6-trime 115thoxy benzene)、3_甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨苯基、5-烷基胞苷(如 5-甲基胞苷)、5_烷基尿苷(如胸腺嘧啶核糖核苷)、5_鹵素尿苷(如5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶，如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2_硫尿苷、4_硫尿苷、 懷丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、 4-乙酰胞苷(4-acetyltidine)、5_(羧羥甲基)尿苷、5’ -羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β -D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基尿苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、Ν6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基氨甲基尿苷、5-甲基羧甲基尿苷 (5-methylcarbonyhnethyluridine)、5_ 甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、β -D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧乙酸、2-硫胞苷、蘇氨酸衍生物及其它 (Burgin 等，1996，Biochemistry，；35，14090，Uhlman & Peyman，見上)。在這方面，用“修飾的堿基”意指除了腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘌呤(U)之外的核苷酸堿基，如上所述；該堿基可以用于反義分子中的任意位點。本領域技術人員將意識到取決于低聚物的應用或化學性質(zhì)，T和U可相互替換。例如，對于其他反義化學物質(zhì)如更 RNA-樣的2’ -0-甲基反義寡聚核苷酸，T堿基可以顯示為U。如上所述，本文提供的某些多核苷酸或寡聚核苷酸包括一個或多個肽核酸(PNA) 亞單位。肽核酸(PNA)是DNA類似物，其骨架與脫氧核糖骨架在結構上是同形的，由附著嘧啶或嘌呤堿基的N-(2-氨基乙基)甘氨酸單位組成。包含天然嘧啶和嘌呤堿基的 PNA與互補寡聚核苷酸按照沃森-克里克堿基配對原則雜交，并且在堿基對識別方面模擬 DNA (Egholm, Buchardt等，1993)。PNA的骨架由肽鍵而非磷酸二酯鍵形成，使得它們適合用于反義應用(參見以下結構)。完全由PNA組成的骨架不帶電荷，致使PNA/DNA或PNA/RNA 雙鏈顯示大于正常的熱穩(wěn)定。核酸酶或蛋白酶不識別PNA。使用本領域已知的技術可以產(chǎn)生PNA。PNA是DNA類似物，其中聚酰胺骨架取代傳統(tǒng)DNA磷酸核糖環(huán)。盡管基本結構變成天然結構，PNA能夠在螺旋形式中序列-特異性地結合DNA或RNA。PNA的特征包括與互補DNA或RNA的高結合親和力，由單堿基錯配引起的失穩(wěn)效應，對核酸酶和蛋白酶的抗性，與DNA或RNA雜交不依賴于鹽濃度，以及與同型嘌呤DNA 形成三鏈。Panagene 已開發(fā)其專有的Bts PNA單體(Bts ；苯并噻唑_2_磺?；?和專有的低聚反應工藝。利用^s PNA單體的PNA低聚反應由脫保護、配對和加帽的重復循環(huán)組成。Panagene 關于此技術的專利包括 US 6969766,US 7211668,US 702285UUS 7125994、 US 7145006和US 7179896。教導制備PNA化合物的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，539，082 ；5, 714，331 ；和5，719，262，各自在此引入作為參考。PNA化合物的進一步教導可以在 Nielsen 等，Science, 1991,254,1497 中找到。還包括的是“鎖核酸”亞單位(LNA)。本領域已知LNA的結構例如^fenge 1 等，Chemical Communications(1998) 455 ；Tetrahedron(1998)54, 3607,以及 Accounts of Chem. Research(1999)32,301) ；Obika 等，Tetrahedron Letters(1997)38，8735 ； (1998)39,5401，以及 Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16，9230。多核苷酸和寡聚核苷酸可以摻入一個或多個LNA ；在一些情況中，化合物可以完全由LNA組成。本領域內(nèi)已知用于合成獨立的LNA核苷亞單位并將它們摻入寡聚核苷酸的方法美國專利號 7, 572，582 ；7，569，575 ；7，084，125 ；7，060，809 ；7，053，207 ；7，034，133 ； 6，794，499 ；以及6，670，461。典型的亞單位間接頭包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；可選擇地，可以使用不含磷原子的接頭。一個實施方案包括含有LNA的化合物，其中各LNA亞單位由RNA或DNA亞單位(即脫氧核糖核苷酸)分開。進一步的示例性化合物可以由交互的 LNA和RNA或DNA亞單位組成，其中亞單位間接頭是硫代磷酸酯。某些多核苷酸或寡聚核苷酸可以包含具有堿基配對部分的基于嗎啉的亞單位，由不帶電荷或基本上不帶電荷的鍵連接。術語“嗎啉低聚物”或“ΡΜ0”(氨基磷酸酯嗎啉低聚物或二氨基磷酸酯嗎啉低聚物)是指由嗎啉亞單位結構組成的寡聚核苷酸類似物，其中 (i)所述結構由含磷原子的鍵連接在一起，長1至3個原子，優(yōu)選長2個原子，并且優(yōu)選不帶電荷或陽離子的，將一個亞單位的嗎啉氮原子連接到鄰近亞單位的5’環(huán)外碳原子，和(ii)各嗎啉環(huán)具有嘌呤或嘧啶或等價的堿基配對部分，由堿基特異性氫鍵有效結合多核苷酸中的堿基。只要它們不干擾結合或活性，對這種連接可以做出各種改變。例如，附著到磷原子的氧原子可以用硫(硫代磷二酰胺)取代。5’氧原子可以用氨基或低級烷基取代的氨基取代。連接到磷原子的懸掛氮原子可以未被取代，用(任選取代的)低級烷基單取代或雙取代。嘌呤或嘧啶堿基配對部分一般是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。嗎啉低聚物的合成、結構和結合特征在美國專利號5，698，685,5, 217，866,5, 142，047、 5，034，506,5, 166，315,5, 521，063 和 5，506，337，以及 PCT 申請?zhí)?PCT/US07/11435 (陽離子鍵)和US08/012804(改進的合成)中詳細描述，其在此全部引入作為參考。本發(fā)明的一方面，MV-siRNA包含至少一個配體限定改變的或非天然的核苷堿基。 包括的是凈荷分子和靶定分子。大量化合物可以用作改變的堿基。所改變堿基的結構在一定程度上是重要的，改變的堿基應當基本上不阻止寡聚核苷酸與它的靶如mRNA相結合。 在某些實施方案中，所改變的堿基是二氟甲苯基、硝基吡咯基、硝基咪唑基、硝基吲哚基、萘基(napthalenyl)、乙?；?anthrancenyl)、吡啶基、喹啉基、芘基，或本文所述的任何一種非天然核苷堿基的二價基。在某些實施方案中，所述非天然核苷堿基是二氟甲苯基 (difluorotolyl)、硝基吡咯基或硝基咪唑。在某些實施方案中，所述非天然核苷堿基是二氟甲苯基。本領域內(nèi)已知各種各樣的配體并且都適用于本發(fā)明。例如，配體可以是類固醇、膽汁酸、脂質(zhì)、葉酸、吡哆醛、B12、核黃素、生物素、芳香族化合物、多環(huán)化合物、冠醚、嵌入劑、 剪切分子、蛋白結合因子或碳水化合物。在某些實施方案中，配體是類固醇或芳香族化合物。在某些實施方案中，配體是膽甾醇。在另一個實施方案中，為了改進細胞靶定和吸收的目的，將多核苷酸或寡聚核苷酸限定至配體。例如，MV-siRNA因子可以限定至抗體或其抗原結合片段。作為另外的例子， MV-siRNA因子可以限定至特異性配體結合分子，如特異性結合特定細胞表面受體的多肽或多肽片段，或更普遍地增強細胞吸收的多肽或多肽片段，如富含精氨酸的肽。本文所使用的術語“類似物”是指保持與本文多核苷酸相同的結構和/或功能(如結合到靶)的分子、化合物或組合物。類似物的例子包括肽模擬物以及小的和大的有機或無機化合物。本文所使用的術語“衍生物”或“變體”是指通過一個或多個核酸缺失、添加、置換或側鏈修飾，與天然存在的多核苷酸(如靶基因序列)不同的多核苷酸。在某些實施方案中，變體具有與靶基因序列區(qū)至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %的序列同一性。因而，例如在某些實施方案中，本發(fā)明的寡聚核苷酸包含與靶基因序列的變體互補的區(qū)。本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包含與靶基因或多核苷酸序列(或其變體)的區(qū)各自互補的序列區(qū)或兩個或多個序列區(qū)，并且在具體實施方案中，與靶基因或多核苷酸序列(或其變體)的區(qū)各自完全互補。在具體實施方案中，靶基因是哺乳動物基因，如人基因，或感染哺乳動物的微生物如病毒的基因。在某些實施方案中，靶基因是治療的靶。例如，靶基因可以是其表達或過表達與人類疾病或障礙相關的基因。這可以是突變基因或野生型或正?；?。已鑒別了各種治療靶基因，并且這些中的任何一種可以由本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子靶定。治療靶基因包括但不限于，原癌基因、生長因子基因、與疾病如白血病相關的易位、炎癥蛋白基因、轉錄因子基因、生長因子受體基因、抗凋亡基因、白細胞介素、鈉離子通道基因、鉀離子通道基因，例如但不限于以下基因或編碼以下蛋白的基因載脂蛋白B(ApoB)、載脂蛋白B-100 (ApoB-100)、bcl家族成員包括bcl_2和bcl_x、 MLL-AF4、Huntington 基因、AML-MT68 融合基因、IKK-B, Ahal、PCSK9、Eg5、轉化生長因子 β (TGF β ), Nav 1.8、RhoA, HIF-I α、Nogo-L、Nogo-R、toll-樣受體 9 (TLR9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、SNCA, β-連接素、CCR5、c-myc、ρ53、白細胞介素-1、白細胞介素-2、 白細胞介素-12、白細胞介素_6、白細胞介素-17a(IL-17a)、白細胞介素_17f (IL-17f)、 Osteopontin (OPN)基因、銀屑病基因以及腫瘤壞死因子基因。在具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子包含引導鏈或靶特異性區(qū)靶定兩個或多個基因，如與特定疾病或障礙相關的兩個或多個基因。例如，它們可以包括與白細胞介素-1基因或mRNA和腫瘤壞死因子基因或mRNA互補的引導鏈；與白細胞介素_1基因或mRNA和白細胞介素-12基因或mRNA互補的引導鏈；或與白細胞介素_1基因或mRNA、 白細胞介素-12基因或mRNA以及腫瘤壞死因子基因或mRNA互補的引導連，用于治療風濕性關節(jié)炎。在一個實施方案種，它們包含與osteopontin基因或mRNA和TNF基因或mRNA 互補的引導鏈。治療靶基因的其他實例包括編碼病毒蛋白的基因和mRNA，如人免疫缺陷病毒 (HIV)蛋白、HTLV病毒蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白、埃博拉病毒蛋白、JC病毒蛋白、皰疹病毒蛋白、人多瘤病毒蛋白、流感病毒蛋白以及勞氏肉瘤病毒蛋白。在具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子包含與由特定病毒表達的兩個或多個基因或mRNA互補的引導鏈，如兩個或多個HIV蛋白基因或兩個或多個皰疹病毒蛋白基因。在另一個實施方案中， 它們包含具有與兩個或多個單純皰疹病毒基因或mRNA互補的引導鏈，如HSV-2的UU9基因或mRNA和Nectin-I基因或mRNA，以減少HSV-2表達、復制或活性。在一個實施方案中， 具有靶定兩個或多個HSV-2基因或mRNA的區(qū)的多核苷酸復合物或分子存在于局部遞送的制劑中。在具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包含靶定載脂蛋白B(ApoB) 基因或mRNA如人ApoB基因或mRNA或小鼠ApoB基因或mRNA的一條(個)、兩條(個)、三條(個)或更多引導鏈或靶特異性區(qū)。因此，在具體實施方案中，它們包括包含與SEQ ID NO 1中列出的人ApoB序列區(qū)互補的區(qū)的一個、兩個、三個或更多區(qū)。在另一個實施方案中， 它們包括包含與SEQ ID NO :10中列出的小鼠ApoB序列區(qū)互補的區(qū)的一個、兩個、三個或更多區(qū)。在具體實施方案中，它們包含具有所附實施例中列出的特定序列的兩個或更多引導序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包含靶定HIV基因的一條 (個)、兩條(個)、三條(個)或更多引導鏈或區(qū)。在具體實施方案中，它們靶定編碼選自以下的一種或多種蛋白的一個、兩個、三個或更多HIV基因或mRNA :HIV gag、HIV tat、HIV env、HIV gag-pol、HIV vif及HIV nef蛋白。因此，在具體實施方案中，它們包含與SEQ ID NO :2中列出的HIV gag序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)；與SEQ ID NO :3中列出的 HIV tat序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)；與SEQ ID NO :4中列出的HIV env序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)；與SEQ ID NO :5中列出的HIV gag-pol序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)；與SEQ ID NO :6中列出的HIV vif序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)；與SEQ ID NO :7中列出的HIV nef序列區(qū)互補的一個、兩個、三個或更多區(qū)。 在具體實施方案中，它們包含具有所附實施例中列出的特異HIV序列的兩個或更多弓丨導序列。在某些實施方案中，選擇與靶基因(或基因)互補的序列區(qū)是基于分析所選擇靶序列并測定二級結構、Tm、結合能以及相對穩(wěn)定性和細胞特異性?？梢赃x擇這樣的序列是基于它們相對不能形成二聚體、發(fā)卡或其它會減少多核苷酸的結構完整性或阻止特異性結合宿主細胞的靶基因的二級結構。靶基因或mRNA的優(yōu)選靶區(qū)可以包括位于或接近AUG翻譯起始密碼子的那些區(qū)，以及與基因或mRNA的5’區(qū)基本上互補的那些序列。例如利用OLIGO引物分析軟件v. 4和/ 或BLASTN 2. 0. 5 算法軟件(Altschul 等，Nucleic Acids Res. 1997，25 (17) :3389-402)或 Oligoengine工作站2. 0，可以進行這些二級結構分析和靶位點選擇考慮因素。在一個實施方案中，靶位點優(yōu)選不位于5’和3’未翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)或接近起始密碼子的區(qū)(大約75個堿基內(nèi))，因為結合調(diào)節(jié)區(qū)的蛋白可以干擾多核苷酸的結合。此外， 潛在的靶位點可以與合適的基因組數(shù)據(jù)庫比較，如BLASTN 2.0. 5，可在NCBI服務器(ymi ncbi. nlm)獲得，以及與其他消除的編碼序列具有顯著同源性的潛在靶序列。在另一個實施方案中，靶位點位于5’或3’未翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)。此外，多核苷酸的自身互補區(qū)可以由靶基因中存在的特定序列組成。靶基因可以是任何物種，包括例如植物、動物(如哺乳動物)、原生動物、病毒(如 HIV)、細菌或真菌。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含實施例1中的GFP序列、 實施例2中的HIV序列或?qū)嵤├?中的ApoB序列，或者與實施例1中的GFP序列、實施例 2中的HIV序列或?qū)嵤├?中的ApoB序列互補。如上所述，多核苷酸的靶基因序列和互補區(qū)可以相互完全互補，或者只要在生理條件下鏈相互雜交，它們可以不是完全互補。本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包含與一個或多個靶基因、以及一個或多個自身互補區(qū)和/或相互連接的環(huán)互補的至少一個、兩個或三個區(qū)。一般，與靶基因互補的區(qū)長度為15至17至M個核苷酸，包括這些范圍內(nèi)的整數(shù)值。該區(qū)可以是至少16個核苷酸的長度、至少17個核苷酸的長度、至少20個核苷酸的長度、至少M個核苷酸的長度、15至對個核苷酸的長度、16至M個核苷酸的長度、或17至M個核苷酸的長度，包含端點值，包括這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)值。自身互補區(qū)一般為2至M個核苷酸的長度、至少2個核苷酸的長度、至少16個核苷酸的長度、或至少20個核苷酸的長度，包括這些范圍內(nèi)的任何一個整數(shù)。因此，在一個實施方案中，自身互補區(qū)可以包含約1-26個核苷酸對。單鏈區(qū)可以為約3-15個核苷酸，包括中間的全部整數(shù)。無效區(qū)是指至少通過設計的任何靶基因的非特異性區(qū)。無效區(qū)或鏈可以用于代替靶特異性區(qū)，如在設計本發(fā)明的二價多核苷酸復合物或分子(參見如圖IV(K)) 中。在某些實施方案中，自身互補區(qū)足夠長以形成雙鏈結構。在某些實施方案中，3’ 區(qū)和5’區(qū)可以雜交以用于包含莖-環(huán)結構的自身互補區(qū)(即雙鏈區(qū))。因此，在一個實施方案中，自身互補區(qū)的一級序列包含相互互補的兩個延伸序列，所述序列由不互補或是不完全互補的另外的序列分開。雖然不是最佳，在某些實施方案中另外的序列可以是互補的。 另外的序列形成莖-環(huán)結構的環(huán)，因此必須足夠長以利于允許兩個互補的延伸相互結合必需的折疊。在具體實施方案中，環(huán)序列包含至少3個、至少4個、至少5個或至少6個堿基。 在一個實施方案中，環(huán)序列包含4個堿基。相互互補(在自身互補區(qū)內(nèi)；即莖區(qū))的兩個延伸序列具有足以在生理條件下相互特異性雜交的長度。在某些實施方案中，各延伸包含4 至12個核苷酸；在另一個實施方案中，各延伸包含至少4個、至少5個或至少6個、至少8 個或至少10個核苷酸，或這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)值。在具體實施方案中，自身互補區(qū)包含由至少4個核苷酸的環(huán)序列分開的至少4個互補核苷酸的兩個延伸。在某些實施方案中， 全部或部分自身互補區(qū)可以與多核苷酸區(qū)互補或不互補，所述多核苷酸區(qū)與靶基因或基因互補。在具體實施方案中，自身互補區(qū)具有適合于自身互補區(qū)結合如以形成莖-環(huán)結構的熱力學參數(shù)。在一個實施方案中，為保證能量組合物足以形成期望的結構如莖-環(huán)結構，自身互補區(qū)通過使用RNA經(jīng)自由能分析和比較剩余“非自身互補區(qū)”或環(huán)區(qū)內(nèi)所含能量進行動力學計算。通常，確定莖環(huán)結構的組合物時要考慮基因靶定區(qū)的不同核苷酸序列，以保證形成這樣的結構。自由能分析公式可以再次被改變以說明核苷酸類型或其使用的環(huán)境PH。本領域內(nèi)可利用許多不同的二級結構預測程序，并且每一種根據(jù)本發(fā)明可以使用。還可以公開獲得用于RNA和DNA堿基的熱力學參數(shù)與靶序列選擇算法組合，其中幾種是本領域內(nèi)可利用的。在一個實施方案中，多核苷酸復合物分子包含以下核苷酸或由以下核苷酸組成 (a)包含長度為17至對個核苷酸(包括其間的任何整數(shù)值)的三個寡聚核苷酸，其與任選地由(b)包含長度為16至M個核苷酸(包括其間的任何整數(shù)值)的自身互補序列或(c) 能夠形成環(huán)的2至12個核苷酸加側翼的至少一部分基因分子互補，并且能夠在生理條件下與其雜交。在一個實施方案中，各自身互補序列能夠形成莖-環(huán)結構，其中的一個位于第二引導鏈的5’端，其中的一個位于第二引導鏈的3’端。在某些實施方案中，自身互補區(qū)用作補充其自身酶剪切和/或與基因調(diào)控的催化過程相關蛋白的特定區(qū)相結合的結構。此外，所述環(huán)可以具有某些4-核苷酸(如四環(huán)NGNN、 AAGU、UUGA或GUUA)結構以促進由RNase如RNase III剪切自身互補區(qū)。此外，所述自身互補區(qū)可以由RNase III剪切11/13或14/16個核苷酸成剩下2個核苷酸3’端的雙鏈區(qū)。 在某些實施方案中，所述四環(huán)具有序列GNRA或GNYA，其中N表示任何一種核苷酸或核苷，R 表示嘌呤核苷酸或核苷；以及Y表示嘧啶核苷酸或核苷。在某些實施方案中，已如上所述被酶剪切的自身互補多核苷酸將裝載到RISC復合物的蛋白區(qū)。在某些實施方案中，包含大于4核苷酸的環(huán)的自身互補區(qū)可以防止由RNase 如RNase III剪切自身互補區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸與靶基因相結合并減少靶基因表達。靶基因可以是已知的基因靴，或可選擇地，靶基因可以是未知的，即可以使用隨機序列。在某些實施方案中，減少靶基因水平至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%。在本發(fā)明的一個實施方案中，靶基因表達(即基因表達)的抑制水平為至少90%、 至少95%、至少98%和至少99%或幾乎100%，因而細胞或生物體將有效具有相當于所謂基因“敲除”的表型。然而，在一些實施方案中，可以優(yōu)選實現(xiàn)僅部分抑制，使得表型相當于所謂基因“敲低”。敲低基因表達的這種方法可以在治療上使用或用于研究(如產(chǎn)生疾病狀態(tài)模型、檢測基因功能、評估因子是否作用于基因、驗證用于藥物發(fā)現(xiàn)的靶)。本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子可以用于靶定和減少或抑制基因(包含編碼序列和非編碼序列)、cDNA、mRNA或microRNA表達。在具體實施方案中，它們的引導鏈或靶定區(qū)與mRNA或microRNA相結合。本發(fā)明進一步提供本發(fā)明的多核苷酸的陣列，包括微陣列。微陣列是一般具有微米至毫米范圍尺寸的小型化裝置，用于進行化學和生化反應，并且特別適合用于本發(fā)明的實施方案。陣列可以利用基本上任何和全部已知技術憑借微電子和/或微加工構造，并且在半導體行業(yè)和/或生化行業(yè)中可利用，假如這樣的技術順從于并且與多核苷酸序列的沉積和/或篩選相容。本發(fā)明的微陣列特別期望用于多種多核苷酸的高通量分析。微陣列一般被構造成具有包含本發(fā)明的多核苷酸的離散區(qū)或斑點，各斑點優(yōu)選在陣列表面上定位尋址的位置處包含一個或多個多核苷酸。本發(fā)明的陣列可以通過本領域內(nèi)可利用的任何方法制備。例如，由Affymetrix開發(fā)的光導化學合成法(參見美國專利號5，445，934和5，856，174)可以用于在芯片表面通過結合固相光化學合成和光刻制造技術合成生物分子。由Incyte制藥開發(fā)的化學沉積法利用預先合成的cDNA探針定向沉積于芯片表面(參見如美國專利號 5，874，554)。在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸分子利用本領域內(nèi)普遍利用的技術化學合成，并且作為三鏈復合物退火。在相關的實施方案中，本發(fā)明多核苷酸復合物的三條或更多弓I導鏈可以獨立地化學合成并且退火來產(chǎn)生多核苷酸復合物。在另一個實施方案中，它在體外或體內(nèi)利用合適且普遍已知的技術如載體或質(zhì)粒構建體表達。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包括體外和體內(nèi)表達載體，所述表達載體包含由莖-環(huán)或環(huán)相互連接形成核苷酸序列的本發(fā)明的多核苷酸序列。本領域技術人員所熟知的方法可以用于構建表達載體，所述表達載體包含編碼多核苷酸的序列以及適當?shù)霓D錄和翻譯控制元件。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內(nèi)基因重組。這類技術描述于，例如 Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南),Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.，以及 Ausubel，F(xiàn). Μ.等(1989) Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學實驗技術)，John Wiley & Sons, New York, N. Y。載體或核酸構建系統(tǒng)可以包含單一載體或質(zhì)粒，兩個或多個載體或質(zhì)粒，其包含總DNA —起被引入至宿主細胞基因組或轉位子中。載體的選擇一般取決于載體與要將載體引入的宿主細胞的相容性。在本例子中，所述載體或核酸構建體優(yōu)選在哺乳動物細胞中功能可操作的載體或核酸構建體。所述載體還可以包括可以用于選擇或鑒別適當?shù)霓D化體或轉染體的選擇標志物如抗生素或藥物抗性基因或報告基因(如綠色熒光蛋白、熒光素酶)。示例性遞送系統(tǒng)可以包括病毒載體系統(tǒng)(即病毒介導的轉導)，包括但不限于逆轉錄病毒(如慢病毒)載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及皰疹病毒載體等等本領域內(nèi)已知的載體。如上所述，某些實施方案使用逆轉錄病毒載體，如慢病毒載體。術語“慢病毒”是指能夠感染分裂和非分裂細胞的復雜逆轉錄病毒屬。慢病毒的例子包括HIV(人類免疫缺陷病毒，包括HIV-I型和HIV-2型)jisna-maedi、山羊關節(jié)炎-腦炎病毒、馬傳染性貧血病毒、描免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒載體可以源自這些病毒中的任何一種或多種(參見如，Evans等，Hum Gene Ther. 10 1479-1489， 1999 ；Case 等，PNAS USA 96 :2988-2993,1999 ；Uchida 等，PNAS USA 95 :11939-11944, 1998 ；Miyoshi 等，Science 283 :682-686,1999 ；Sutton 等，J Virol 72 :5781-5788,1998 ； 以及Frecha等，Blood. 112 :4843_52，2008，各自整體在此引入作為參考)。在某些實施方案中，逆轉錄病毒載體包含來自慢病毒基因組如HIV基因組或SIV 基因組的某些最小序列。慢病毒的基因組一般有機化成5’長末端重復序列(LTR)區(qū)、gag 基因、pol 基因、env 基因、附屬基因($nnef、vif、vpr、vpu、tat、rev)禾口 3，LTR 區(qū)。將病毒LTR分成三個區(qū)，被稱為U3、R(重復)和U5。U3區(qū)包含增強子和啟動子元件⑴5區(qū)包含多聚腺苷酸化信號和分開U3區(qū)和U5區(qū)的R區(qū)。R區(qū)的轉錄序列出現(xiàn)在病毒RNA的5’和 3’ 端(參見如“RNA Viruses :A Practical Approach”(RNA 病毒實用方法)(Alan J. Cann 編，Oxford University Press,2000) ；0 Narayan, J. Gen. Virology. 70 :1617—1639，1989 ； Fields 等，F(xiàn)undamental Virology Raven Press, 1990 ；Miyoshi 等，J Virol. 72 :8150-7, 1998;以及美國專利號6，013，516，各自整體引入作為參考)。為了調(diào)節(jié)所期望的載體活性， 慢病毒載體可以包含任何一個或多個慢病毒基因組的這些元件，或者如為了減少慢病毒復制的病理效應或為了限制慢病毒載體單輪感染，它們可以包含缺失、插入、置換或突變的一個或多個這些元件，。一般，最小的逆轉錄病毒載體包含某些5’ LTR和3’ LTR序列、一個或多個關注的基因(待表達于靶細胞中)、一個或多個啟動子和用于包裝RNA的順式作用序列。可以包括本文所述和本領域內(nèi)已知的其他調(diào)節(jié)序列。病毒載體一般克隆到可以轉染至包裝細胞系如真核細胞(如^3-HEK)的質(zhì)粒，并且一般還包含對細菌中復制質(zhì)粒有用的序列。在某些實施方案中，所述病毒載體包含來自逆轉錄病毒如慢病毒的5’和/或 3’LTR的序列。LTR序列可以是來自任何物種的任何慢病毒的LTR序列。例如，它們可以是來自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。優(yōu)選的LTR序列是HIV LTR序列。在某些實施方案中，所述病毒載體包含來自慢病毒5’ LTR的R和U5序列和來自慢病毒的失活或“自身-失活”的3’ LTR0 “自身-失活的3’ LTR"'是包含防止LTR序列驅(qū)動下游基因表達的突變、置換或缺失的3’長末端重復序列(LTR)。來自3’ LTR的U3區(qū)拷貝用作在整合的前病毒中產(chǎn)生兩種LTR的模板。因而，當具有失活的缺失或突變的3’ LTR 作為前病毒的5’ LTR整合時，沒有來自5’ LTR的轉錄是可能的。這消除了病毒增強子/啟動子和任何內(nèi)源性增強子/啟動子之間的競爭。自身-失活3’LTR描述于，例如^ifferey 等，J Virol. 72 :9873-9880,1998 ；Miyoshi 等，J Virol. 72 :8150-8157,1998 ；以及 Iwakuma 等，Virology 261 120-132，1999，各自整體引入作為參考。自身失活3，LTR可以通過本領域內(nèi)任何已知的方法形成。在某些實施方案中，所述3’LTR的U3元件含有缺失其增強子序列，優(yōu)選TATA盒、Spl和/或NF-kB位點。自身失活3’ LTR的結果是，整合入宿主細胞基因組的前病毒將包含失活的5’ LTR0表達載體一般包括調(diào)節(jié)序列，其調(diào)節(jié)多核苷酸的表達。調(diào)節(jié)序列存在于表達載體中，包括所述載體的那些非翻譯區(qū)，如增強子、啟動子、5’和3’非翻譯區(qū)，其與宿主細胞蛋白相互作用以實現(xiàn)轉錄和翻譯。這樣的元件可以改變它們的強度和特異性。取決于所利用的載體系統(tǒng)和細胞，可以使用任何數(shù)量的轉錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子。此外，還可以使用組織特異性或細胞特異性啟動子。對于在哺乳動物細胞中表達，通常優(yōu)選來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。此外，通?？衫迷S多基于病毒的表達系統(tǒng)。例如，將腺病毒用作表達載體的情況中，可以將編碼關注多肽的序列連接到由晚期啟動子和三重前導序列組成的腺病毒轉錄/ 翻譯復合物。插入病毒基因組的非必需El或E3區(qū)可以用于獲得能夠在所感染的宿主細胞中表達多肽的活病毒(Logan，J.和 Shenk，T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81 :3655-3659)。 此外，轉錄增強子如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子，可以用于哺乳動物宿主細胞中增加表達。某些實施方案可以使用一個或多個RNA聚合酶II和III啟動子。RNA聚合酶 III啟動子的合適選擇可以在例如Paule和White，Nucleic Acids Research.，Vol 28， PP 1283-1四8，2000中發(fā)現(xiàn)，其整體引入作為參考。RNA聚合酶II和III啟動子還包括任何合成的或改造的DNA片段，所述DNA片段可以分別定向RNA聚合酶II和III轉錄其下游RNA編碼序列。進一步地，RNA聚合酶II或III (Pol II或III)啟動子或用作病毒載體部分的啟動子可以是誘導型。任何合適的誘導型Pol II或III啟動子可以與本發(fā)明的方法一起使用。示例性Pol II或III啟動子包括四環(huán)素響應性啟動子，提供于Ohkawa和 Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11，pp 577-585, 2000 ；禾口 Meissner 等，Nucleic Acids Research, Vol. 29，pp 1672-1682，2001，各自整體引入作為參考。可以使用的組成型啟動子的非限制性實例包括用于泛素的啟動子、CMV啟動子(參見如 Karasuyama 等，J. Exp. Med. 169 :13，1989)、β -肌動蛋白(參見如 Gunning 等，PNAS USA 84 :4831-4835,1987)以及 pgk 啟動子(參見如 Adra 等，Gene 60:65-74， 1987) ；Singer-Sam 等，Gene 32 :409_417，1984 ；以及 Dobson 等，Nucleic Acids Res. 10 沈35-2637，1982，各自整體引入作為參考)。組織特異性啟動子的非限制性實例包括Ick 啟動子(參見如 Garvin 等，Mol. Cell Biol. 8 :3058-3064,1988 ；和 Takadera 等，Mol. Cell Biol. 9 :2173-2180,1989)、myogenin 啟動子(Yee 等，Gene and Development 7 1277-1289. 1993)以及 thy 1 (參見如 Gundersen 等，Gene 113:207-214,1992)。啟動子的其他實例包括泛素-C啟動子、人μ重鏈啟動子或Ig重鏈啟動子(如 MH-bl2)以及人κ輕鏈啟動子或Ig輕鏈啟動子(如EEK-bl2)，其在B-淋巴細胞中起作用。MH-bl2啟動子含有人μ重鏈啟動子，其前面是由基質(zhì)結合區(qū)加側翼的iE μ增強子，而 EEK-bl2啟動子含有κ輕鏈啟動子，其前面是內(nèi)源性增強子(iE κ)、基質(zhì)結合區(qū)和3’增強子(3’Εκ)(參見如Luo等，Blood. 113 1422-1431，2009，在此引入作為參考)。因此，某些實施方案可以使用一個或多個這些啟動子或增強子元件。在某些實施方案中，本發(fā)明提供用于條件表達的多核苷酸。各種條件表達系統(tǒng)是本領域內(nèi)已知并且可利用于細胞和動物中使用，而且本發(fā)明預期使用任何這樣的條件表達系統(tǒng)來調(diào)節(jié)多核苷酸的表達或活性。在本發(fā)明的一個實施方案中，例如，利用REV-TET 系統(tǒng)實現(xiàn)誘導型表達。該系統(tǒng)的成分和利用系統(tǒng)來控制基因表達的方法在文獻中有據(jù)可查，并且表達四環(huán)素控制的反式激活因子(tTA)或反式tTA(rtTA)的載體可商購獲得(如 pTet-0ff,pTet-0n 和 ptTA-2/3/4 載體，Clontech，Palo Alto, CA)。這樣的系統(tǒng)描述于，例如美國專利號5650四8、6271348、5922927及相關專利，其整體在此引入作為參考。
在某些實施方案中，本文提供的病毒載體(如逆轉錄病毒、慢病毒)是具有一個或多個所選擇的病毒糖蛋白或包膜蛋白的“假型”，主要來靶定所選擇的細胞類型。假型通常是指將一個或多個異源病毒糖蛋白結合到細胞表面病毒顆粒，通常允許病毒顆粒感染所選擇的與其正常靶細胞不同的細胞?！爱愒础痹醋猿《据d體的RNA基因組來源的病毒之外的病毒。一般，病毒載體的糖蛋白編碼區(qū)如通過缺失已遺傳改變，以防止表達其自身糖蛋白。僅僅通過舉例的方式，來自HIV-來源的慢病毒載體的包膜糖蛋白gp41和/或gpl20 一般先于具有異源病毒糖蛋白的假型缺失。病毒載體的傳代可以使用本領域內(nèi)已知的任何合適的遺傳工程技術，包括但不限于限制性核酸內(nèi)切酶消化、連接、轉化、質(zhì)粒純化、PCR擴增和DNA測序的標準技術，例如，如 Sambrook等所描述(Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南)· Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1989)), Coffin 等(Retroviruses (逆轉錄病毒).Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1997))禾口"RNA Viruses :A Practical Approach (RNA ^1 ^ ' )，，(Alan J. Cann,H, Oxford University Press, (2000))。可以將本領域內(nèi)已知的任何各種方法用于產(chǎn)生合適的逆轉錄病毒顆粒，其基因組包含病毒載體的RNA拷貝。正如一種方法，基于病毒載體進入具有期望的靶細胞特異性的病毒顆粒，可以將病毒載體引入包裝病毒基因組RNA的包裝細胞系。包裝細胞系一般以反式提供將病毒基因組RNA包裝到病毒顆粒和感染靶細胞所必需的病毒蛋白，包括結構gag 蛋白，酶pol蛋白和包膜糖蛋白。在某些實施方案中，所述包裝細胞系可以穩(wěn)定地表達某些必需或期望的病毒蛋白 (如gag、pol)(參見如美國專利號6，218，181，在此引入作為參考)。在某些實施方案中， 所述包裝細胞系可以用編碼某些必需或期望的病毒蛋白(如gag、pol、糖蛋白)的質(zhì)粒瞬時感染，包括本文描述的風疹病毒糖蛋白序列。在一個示例性實施方案中，所述包裝細胞系穩(wěn)定地表達gag和pol序列，然后所述細胞系用編碼病毒載體的質(zhì)粒和編碼糖蛋白的質(zhì)粒轉染。引入期望的質(zhì)粒之后，將病毒顆粒收集并相應地處理，如通過超濾以完成病毒顆粒的濃縮貯存。示例性包裝細胞系包括293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK (ATCC CCL 34)、BHK (ATCC CCL-10)禾口 Cf2Th (ATCC CRL 1430)細胞系。在一個具體實施方案中，利用載體系統(tǒng)表達多核苷酸，所述載體系統(tǒng)包含pSUPER 載體骨架和相應于待表達的多核苷酸的另外的序列。已證明PSUPER載體系統(tǒng)對于表達 shRNA試劑和下調(diào)基因表達是有用的(Brummelkamp, TT等，Science 296 :550(2002)和 Brummelkamp，T. R 等，Cancer Cell，在線發(fā)表，2002 年 8 月 22 日)。PSUPER 載體可從 OligoEngine (Seattle, WA)商購獲得。調(diào)節(jié)基因表達的方法本發(fā)明的多核苷酸可以用于各種目的，全部大體上涉及它們抑制或減少一個或多個靶基因表達的能力。因此，本發(fā)明提供減少一個或多個靶基因表達的方法，所述方法包括將本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子引入包含所述一個或多個靶基因的細胞。在具體實施方案中，所述多核苷酸復合物或分子包含共同靶定一個或多個靶基因的一條或多條引導鏈。 在一個實施方案中，將本發(fā)明的多核苷酸引入含有由一條(個)、兩條(個)或三條(個) 引導鏈或靶定區(qū)靶定的靶基因或其同源物、其變體或其直系同源物的細胞。此外，本發(fā)明的多核苷酸可以用于間接地減少表達。例如，本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子可以用于減少驅(qū)動第二基因(即靶基因)表達的轉錄激活因子的表達，從而減少第二基因的表達。同樣地，多核苷酸可以用于間接地增加表達。例如，本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子可以用于減少抑制第二基因表達的轉錄阻遏因子的表達，從而增加第二基因的表達。在各種實施方案中，靶基因是源自待引入多核苷酸的細胞的基因、內(nèi)源性基因、外源性基因、轉基因或轉染細胞之后細胞中存在的病原體基因。取決于特定的靶基因和遞送至細胞的多核苷酸的量，本發(fā)明的方法可導致部分或全部抑制靶基因的表達。含有靶基因的細胞可以源自或包含于任何生物體(如植物、動物、原生動物、病毒、細菌或真菌)。如本文所使用，“靶基因”包括基因、mRNA和microRNA。抑制靶基因的表達可以利用本發(fā)明領域內(nèi)技術人員已知的技術，通過包括但不限于以下的方法驗證觀測或檢測由靶基因編碼的蛋白水平的缺失或可觀測的降低，表達自靶基因(如mRNAO)的基因產(chǎn)物水平的缺失或可觀測的降低，和/或與基因表達相關的表型?？梢詸z測以確定由引入本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子而引起的作用的細胞特征的實例包括細胞生長、凋亡、細胞周期特征、細胞分化和形態(tài)?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸復合物或分子直接引入細胞(即細胞內(nèi))或細胞外引入生物體如哺乳動物的空腔或胞間隙，進入生物體循環(huán)，所述引入包括經(jīng)口引入、通過將生物體浸泡于含有多核苷酸的溶液中引入，或通過足以遞送多核苷酸至細胞的一些其他方法引入。此外，可以將改造成表達多核苷酸的載體引入細胞，其中所述載體表達多核苷酸， 從而將它引入細胞。本領域內(nèi)普遍已知并且可利用的轉移表達載體至細胞的方法，包括如轉染、脂質(zhì)體轉染、劃痕荷載、電穿孔、顯微注射、感染、基因槍和反轉錄轉座。通常，本領域技術人員基于載體類型和細胞類型，以及本領域內(nèi)普遍可利用的教導易于確定將載體引入細胞的合適方法。感染因子可以通過本領域內(nèi)易于利用的各種方法引入，包括如鼻腔吸入。利用本發(fā)明的寡聚核苷酸抑制基因表達的方法可以聯(lián)合其他敲低和敲除方法，如基因靶定、反義RNA、核酶、雙鏈RNA(如shRNA和siRNA)以進一步減少靶基因的表達。在不同的實施方案中，本發(fā)明的靶細胞是原代細胞、細胞系、永生細胞或轉化細胞。靶細胞可以是體細胞或生殖細胞。所述靶細胞可以是非分裂的細胞，如神經(jīng)細胞，或它在合適的細胞培養(yǎng)條件中能夠體外增殖。靶細胞可以是正常細胞，或它們可以是疾病細胞， 包括含有已知的基因突變的那些細胞。本發(fā)明的真核靶細胞包括哺乳動物細胞如，例如人細胞、鼠科動物細胞、嚙齒動物細胞和靈長類動物細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的靶細胞是干細胞，其包括例如胚胎干細胞，如鼠科動物的胚胎干細胞?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸復合物、分子和方法用于治療任何各種疾病或障礙，包括但不限于炎癥性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、脫髓鞘疾病、消化系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、血液和淋巴系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、精神障礙、肌肉骨骼疾病、神經(jīng)疾病、神經(jīng)肌肉疾病、代謝性疾病、性傳播疾病、皮膚和結締組織病、泌尿系統(tǒng)疾病以及感染。在某些實施方案中，所述方法對動物實施，在具體實施方案中，對哺乳動物實施， 以及在某些實施方案中，對人實施。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括利用本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子用于治療或預防與基因失控、過表達或突變相關的疾病的方法。例如，可以將本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子引入癌細胞或腫瘤，從而抑制維持致癌/致瘤表型所需基因或相關基因的表達。為預防疾病或其他病理，可以選擇例如啟動或維持疾病/病理所需的靶基因。治療可以包括改善與疾病相關的任何癥狀或與病理相關的臨床指征。此外，將本發(fā)明的多核苷酸用于治療與基因突變相關的疾病或障礙。在一個實施方案中，將多核苷酸用于調(diào)控突變基因或等位基因的表達。在這樣的實施方案中，所述突變基因是多核苷酸復合物或分子的靶，其將包含與所述突變基因的區(qū)互補的區(qū)。該區(qū)可以包括突變，但不是必需的，因為也可以靶定基因的另一個區(qū)，導致減少突變基因或基因的表達。在某些實施方案中，該區(qū)包含突變，并且在相關實施方案中，所述多核苷酸復合物或分子特異性抑制突變基因或基因的表達，但不抑制野生型基因或基因的表達。這樣的多核苷酸在如其中一個等位基因突變但另一個未突變的情形中是特別有用的。然而，在另一個實施方案中，該序列不一定會包含突變，并且可以因此僅包含野生型序列。這樣的多核苷酸在如其中全部等位基因突變的情形中是特別有用的。本領域內(nèi)已知各種疾病和障礙與基因突變相關或由基因突變引起，并且本發(fā)明包括用多核苷酸治療任何這樣的疾病或障礙。在某些實施方案中，靶定病原體的基因用于抑制。例如，基因可以直接引起宿主免疫抑制或?qū)τ诓≡w復制、病原體傳播或維持感染是必需的。此外，靶基因可以是負責病原體進入其宿主、通過病原體或宿主的藥物代謝、病原體基因組的復制或整合、在宿主中感染的建立或擴散、或組裝下一代病原體的病原體基因或宿主基因。預防(即防止或降低感染風險)、以及降低與感染相關癥狀的頻率或嚴重性的方法包括于本發(fā)明中。例如，通過引入根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，可以靶定處于病原體感染風險中的細胞或已被感染的細胞，特別是人免疫缺陷病毒(HIV)感染，用于治療(靶定序列參見實施例1和實施例2)。因而，在一個實施方案中，將靶定一個或多個HIV蛋白的本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子用于治療或抑制HIV感染或獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。在其他具體實施方案中，將本發(fā)明用于治療或開發(fā)治療任何類型的癌癥?？梢岳帽疚拿枋龅姆椒ㄖ委煹哪[瘤的實例包括但不限于，神經(jīng)母細胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腦瘤、乳癌、白血病、淋巴瘤及其他。在一個實施方案中，將靶定載脂蛋白B(apoB)的本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子用于治療、減少或抑制動脈硬化癥或心臟病。ApoB是低密度脂蛋白(LDL)的主要載脂蛋白， 其負責運送膽固醇至組織。LDL顆粒上的ApoB擔當LDL受體的配體，并且高水平的ApoB可導致引起血管病(動脈硬化癥)的斑塊，導致心臟病。可以將多核苷酸復合物、分子和表達載體(包括病毒載體和病毒)引入體外或離體細胞，隨后放入動物以影響治療，或者可以將它們通過體內(nèi)給予直接引入患者。因而，在某些實施方案中，本發(fā)明提供基因治療方法?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物以許多方式中的任何一種給予患者，包括腸胃外、靜脈內(nèi)、全身、局部、經(jīng)口、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入或任何這樣的遞送方法。在一個實施方案中，所述組合物可以腸胃外給予，即關節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)。在具體的方案中，所述脂質(zhì)體組合物通過靜脈內(nèi)輸注給予或由彈丸注射腹膜內(nèi)給予。本發(fā)明的組合物可以制成適合于遞送至個體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物將通常進一步包含一種或多種緩沖液(如中性緩沖生理鹽水或磷酸鹽緩沖生理鹽水)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或右旋糖酐)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(如氫氧化鋁)、使得制劑與接受者血液等滲、低滲或輕微高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑。可選擇地，本發(fā)明的組合物可以制成冷凍干燥制劑。給予患者的寡聚核苷酸的量可以由醫(yī)師根據(jù)各種因素容易地確定，所述因素包括如，疾病和由所使用的載體表達的寡聚核苷酸水平(在給予載體的情況下)。所給予的每劑量的量一般選擇高于最小治療劑量但低于中毒劑量。每劑量的量的選擇將取決于許多因素，如患者的病史、其他療法的使用以及疾病的性質(zhì)。此外，所給予的量可以貫穿治療調(diào)整， 取決于患者對治療的響應和任何治療相關副作用的出現(xiàn)或嚴重性。測定基因功能的方法本發(fā)明進一步包括鑒別生物體中基因功能的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子來抑制先前未知功能的靶基因的活性。代替通過傳統(tǒng)基因篩選費時費力的分離突變體，通過使用本發(fā)明來測定未表征基因的功能基因組學設想以減少靶基因活性的量和/或改變靶基因活性的時機。本發(fā)明可以用于確定用于制藥學的潛在靶，理解與發(fā)育相關的正常和病理事件，確定負責出生后發(fā)育/變老的信號通路等。從基因組和表達基因來源加速獲取核苷酸序列信息，包括酵母、黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲基因組的全部序列，可以與本發(fā)明結合來測定生物體中的基因功能(如線蟲)。優(yōu)選不同生物體來使用特定密碼子，搜索相關基因產(chǎn)物的序列數(shù)據(jù)庫，關聯(lián)遺傳特征連鎖圖譜與核苷酸序列所源自的物理圖譜，以及人工智能方法可以用于限定來自在這樣的測序計劃中已獲取的核苷酸序列的假定開放閱讀框。在一個實施方案中，如為了測定基因的功能或生物學活性，基于獲自表達序列標簽(EST)的部分序列，將本發(fā)明的多核苷酸用于抑制基因表達。在生長、發(fā)育、代謝、抗病或其他生物學過程中的功能變化會指征EST的基因產(chǎn)物的正常作用?？梢詫⒍嗪塑账岱奖愕匾氚谢虻耐暾毎?生物體允許將本發(fā)明用于高通量篩選(HTQ。例如，可以將含有能夠抑制不同表達基因的多核苷酸的溶液按照有序排列放置于微量滴定板上定位的獨立孔內(nèi)，并且可以分析各孔內(nèi)的完整細胞/生物體用于由于抑制靶基因活性在行為或發(fā)育中的任何變化或改變?？梢詮幕蚧钚员灰种茣r其對完整細胞/生物體的影響來分析靶基因的功能。在一個實施方案中，將本發(fā)明的多核苷酸用于化學遺傳學篩選，即檢測化合物逆轉通過利用本發(fā)明的多核苷酸減少基因表達模擬的疾病的能力。若通過RFLP或QTL分析，生物體的特征被確定為與多態(tài)性遺傳連鎖，可以將本發(fā)明用于獲得關于遺傳多態(tài)性是否可以是直接造成所述特征的觀點。例如，可以擴增限定遺傳多態(tài)性的片段或鄰近這樣的遺傳多態(tài)性的序列以產(chǎn)生RNA，可以將多核苷酸引入生物體， 以及可以確定特征的改變是否與抑制相關聯(lián)。本發(fā)明在允許抑制必需基因中同樣是有用的。這樣的基因僅在發(fā)育的特定階段或細胞區(qū)室對于細胞或生物體活力來說可能是必需的。何時或何處對于活力不是必需時，可以通過抑制靶基因的活性產(chǎn)生條件突變的功能等價物。本發(fā)明允許在生物體發(fā)育的特定時間和特定區(qū)域添加多核苷酸，而不會向靶基因組引入永久突變。同樣地，本發(fā)明預期使用僅在期望時表達多核苷酸的誘導型或條件性載體。本發(fā)明還涉及驗證基因產(chǎn)物是否是用于藥物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的靶的方法。將靶定基因的多核苷酸引入細胞或生物體，所述靶定基因相應于降解的基因。將細胞或生物體保持于發(fā)生基因降解的條件下，導致減少基因的表達。測定減少基因的表達是否對細胞或生物體有影響。若減少基因的表達有影響，那么基因產(chǎn)物就是用于藥物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的靶。好細去本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子包括新穎獨特的功能序列組，以使得采用含有一個或多個雙鏈區(qū)(有時由莖-環(huán)或環(huán)結構鄰接)的二級結構的方式排列，賦予多核苷酸的優(yōu)勢。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包括設計本發(fā)明的多核苷酸復合物和分子的方法。 這樣的方法一般包括適當選擇多核苷酸復合物和分子的各種序列成分。術語“一級鏈”、“二級鏈”和“關鍵鏈”是指本發(fā)明的多核苷酸復合物或分子中存在的各種引導鏈。在一個實施方案中，多核苷酸復合物的基本設計如下設計基序(一級鏈)(UU) ( 二級鏈)(UU)(關鍵鏈)(UU)因此，在相關實施方案中，將多核苷酸設計如下II. ( 二級鏈)(UU) (UU)(關鍵鏈)(UU)( 一級鏈)III. ( 二級鏈)(UU)(環(huán)或莖-環(huán))(關鍵鏈)(UU)(環(huán)或莖-環(huán))(一級鏈)(UU)設置參數(shù)設置用于自身互補的seed size大約38-43%。對于19個核苷酸靶，范圍或7或 8個核苷酸優(yōu)選作為SEED_SUE。對于各基因，定義PRIMARY和SECONDARY靶基因。定義 PRIMARY 鏈從一個或多個靶基因序列開始。對于各基因，構造滿足G/C含量、特異性和不含 poly-A或poly-G標準的I3RIMARY靶序列17- 個核苷酸基序的列表。對于每一種，還得到 SECONDARY 禾口 KEY 鏈。f導至Ij SECONDARY 禾口 KEY f連d.對于各基因上的各靶序列，通過與SECONDARY基因各序列反向的SEED_SUE聚類比對堿基1。記錄精確比對的序列。SECONDARY基因上的靶序列是比對起點，減去基序的長度， 加上SEED_SUE來比對起點，加上SEED_SUE。SECONDARY鏈是反向互補的。為得到各KEY鏈，定義SEED_A作為通過I3RIMARY鏈的SEED_SUE的堿基1，定義 SEED_B作為基序長度減去SEED_SUE至SECONDARY鏈的基序長度處的堿基。設置MID_ SECTION作為長基序序列長度減去SEED_A*度加上SEED_B長度的重復的符號“丨”設置關鍵比對序列作為SEED_A、MID_SECTI0N、SEED_B。聚類比對用于關鍵區(qū)段的靶基因。記錄 KEY靶序列作為在關鍵靶基因上比對hit處的堿基至堿基比對hit加上基序長度。KEY鏈是反向互補的。構建任選的多核苷酸g.構造具有熔融溫度在靶的相等長度區(qū)占優(yōu)勢的G-24)個核苷酸的備選莖A&B。 莖鏈具有A-T、G-C相互互補。長度和組合物取決于選擇哪種內(nèi)切核糖核酸酶用于預加工莖-環(huán)結構。h.構造具有熔融溫度在靶的相等長度區(qū)占優(yōu)勢的G-24)個核苷酸的備選莖C&D。 莖鏈具有A-T、G-C相互互補，但是不與莖A&B互補。長度和組合物取決于選擇哪種內(nèi)切核糖核酸酶用于預加工莖-環(huán)結構。i.構造具有0-12)個富含A-T的核苷酸至環(huán)A&B的環(huán)備選物。長度和組合物取決于選擇哪種內(nèi)切核糖核酸酶用于預加工莖-環(huán)結構。建議所描述的四環(huán)用于由RNase III 或I^acl RNase III內(nèi)切核糖核酸酶加工更長的莖，如(圖A)所示。建議更大的環(huán)用于防止RNase III或I^acl加工并放在更短的莖上，如(圖C，圖D)所示。j.形成用于各基序備選物的鄰近序列。k.利用具有期望參數(shù)的軟件折疊備選序列。1.從輸出，定位具有單鏈靶區(qū)的結構，其任意一端或兩端具有期望的莖/環(huán)結構加側翼。在一個實施方案中，設計包含用于調(diào)節(jié)靶基因(即多核苷酸)表達的一個或多個自身互補區(qū)的多核苷酸序列的方法包括(a)選擇長度為17至30個核苷酸并且與靶基因互補的第一序列；以及(b)選擇長度為12至討個核苷酸的一個或多個另外的序列，其包含自身互補區(qū)并且不與第一序列互補。在某些實施方案中，這些方法包括確定或預測由步驟(b)所選擇的序列采用的二級結構，例如為了確定它們能夠采用莖-環(huán)結構。同樣地，這些方法可以包括驗證步驟，其中包括如在體內(nèi)或體外測試系統(tǒng)中，測試所設計的多核苷酸序列抑制靶基因表達的能力。本發(fā)明進一步預期基于本文所述的互補特征，應用計算機程序來選擇多核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供用于選擇多核苷酸序列的計算機軟件程序和包含所述軟件程序的計算機可讀媒介，以及含有一種本發(fā)明程序的計算機。在某些實施方案中，使用者提供具有關于序列、位點或靶基因名稱信息的計算機。 所述計算機使用此輸入本發(fā)明的程序來鑒別靶定的靶基因的一個或多個適當?shù)膮^(qū)，并且輸出或提供在本發(fā)明的多核苷酸中使用的互補序列。然后計算機程序使用該序列信息來選擇多核苷酸的一個或多個自身互補區(qū)的序列。一般，所述程序?qū)⑦x擇不與基因組序列互補的序列，所述基因組序列包括靶基因或與靶基因互補的多核苷酸的區(qū)。此外，所述程序?qū)⑦x擇相互之間不互補的自身互補區(qū)的序列。當期望時，程序還提供缺口區(qū)的序列。在選擇適當?shù)男蛄袝r，計算機程序向使用者輸出或提供該信息。本發(fā)明的程序可以進一步使用輸入關于含有靶基因的生物體的基因組序列，如公共或私營數(shù)據(jù)庫，以及預測特定序列的二級結構和/或雜交特性的其他程序，以保證多核苷酸采用正確的二級結構并且不與非靶基因雜交。本發(fā)明部分基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，如本文所述的多核苷酸非常有效的減少一個或多個基因的靶基因表達。多核苷酸提供優(yōu)于以前所述的反義RNA的重要優(yōu)勢，包括增加潛力和增強對多靶基因的效力。此外，本發(fā)明的多核苷酸提供優(yōu)于用于siRNA的傳統(tǒng)dsRNA 分子的額外優(yōu)勢，因為多核苷酸的使用基本上消除了與dsRNA分子相關的脫靶阻抑并且提供多價RNAi?？衫斫獾氖强梢詫⒈景l(fā)明的組合物和方法用于靶定各種不同的靶基因。術語“靶基因”可以指基因、mRNA或microRNA。因此，本文提供的靶序列可以描述為DNA序列或RNA 序列。本領域技術人員將理解的是，本發(fā)明的組合物可包括與本文提供的DNA或RNA序列互補的區(qū)。因而，無論提供DNA或RNA靶序列，可理解的是同樣可以分別靶定相應的RNA或 DNA靶序列。本發(fā)明的實施將使用本領域技術內(nèi)的細胞生物學、分子生物學、微生物學和重組 DNA的各種常規(guī)技術。這樣的技術已完整描述于文獻中。參見例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)，第二版，Sambrook, Fritsch 和 Maniatis 編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ； \)JsR DNA Cloning (DNA ), Volumes I and II (D. N. Glover 編· 1985)。本文引用的全部專利、專利申請和非專利文獻整體引入作為參考，正如每一個都獨立地引入作為參考?？梢詫⒁陨纤枋龅母鞣N實施方案組合以提供進一步的實施方案。在本說明書引用和/或列于申請記錄表的全部美國專利、美國專利申請出版物、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利出版物在此整體引入作為參考。實施方案方面可以變化，若必要的話使用各種專利、申請和出版物的概念以提供更進一步的實施方案。根據(jù)以上詳細說明可以對實施方案進行這些和其他改變?？偟膩碚f，以下權利要求中所使用的術語不應當解釋為限制要求說明書和權利要求中公開的具體實施方案，而應當解釋為包括全部可能的實施方案連同這樣的權利要求給予權利的等價物的完整范圍。因此，權利要求并不受公開內(nèi)容所限制。
實施例實施例1TRIV0ID 抗-GFP針對單個基因——綠色熒光蛋白(GFP)設計多價siRNA。測試針對GFP的多價合成的RNA MV-siRNA復合物來與單shRNA克隆相比，比較阻抑活性。此外，為測試失活合成的 MV-siRNA復合物的一條鏈的作用，一條鏈用DNA(Tl-19_C_dna)取代；如以下所示。該取代導致阻抑相對下降約30%。此外，測試本文所述的MV-siRNA自身互補克隆的“短”和“長” 形式，并與已公開的shRNA克隆相比，比較GFP表達的阻抑。以下表1給出合成的MV-siRNA的低聚物序列以及DNA取代鏈。圖8A示出GFP編碼序列的靶定區(qū)。表1合成的MV-siRNA的寡核苷酸
權利要求
1.至少三個分開的多核苷酸的多核苷酸復合物，所述多核苷酸復合物包括(a)第一多核苷酸，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；(b)第二多核苷酸，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；以及(c)第三多核苷酸，其包含無效區(qū)或與第三靶特異性互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)， 其中所述第一、第二和第三多核苷酸的靶特異性區(qū)各自與不同的靶序列互補，其中所述第一多核苷酸的5’區(qū)與所述第三多核苷酸的3’區(qū)互補，其中所述第一多核苷酸的3’區(qū)與所述第二多核苷酸的5’區(qū)互補，以及其中所述第二多核苷酸的3’區(qū)與所述第三多核苷酸的5’區(qū)互補，并且其中所述三個分開的多核苷酸通過它們互補的3’區(qū)和5’區(qū)雜交以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的多核苷酸復合物。
2.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含約15-30個核苷酸。
3.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含約17-25個核苷酸。
4.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含約5-10 個核苷酸對。
5.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含約7-8 個核苷酸對。
6.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述第一、第二和第三靶序列中的每個存在于相同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。
7.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述第一、第二和第三靶序列中的至少兩個存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。
8.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述每個多核苷酸的5’區(qū)和/或3’區(qū)的全部或部分還與該多核苷酸的靶序列互補。
9.如權利要求1所述的多核苷酸復合物，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含3’突出ο
10.自身雜交多核苷酸分子，其包括(a)第一核苷酸序列，其包含與第一靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；(b)第二核苷酸序列，其包含與第二靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)；以及(c)第三核苷酸序列，其包含無效區(qū)或與第三靶序列互補的靶特異性區(qū)、5’區(qū)和3’區(qū)， 其中所述第一、第二和第三核苷酸序列的靶特異性區(qū)各自與不同的靶序列互補， 其中所述第一核苷酸序列的5’區(qū)與所述第三核苷酸序列的3’區(qū)互補，其中所述第一核苷酸序列的3’區(qū)與所述第二核苷酸序列的5’區(qū)互補，以及其中所述第二核苷酸序列的 3’區(qū)與所述第三核苷酸序列的5’區(qū)互補，并且其中所述5’區(qū)各自與它們互補的3’區(qū)雜交以形成具有第一、第二和第三單鏈區(qū)以及第一、第二和第三自身互補區(qū)的自身雜交多核苷酸分子。
11.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列包含約15-60個核苷酸。
12.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述靶特異性區(qū)各自包含約15-30個核苷酸。
13.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含約IO-M個核苷酸。
14.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含3’突出。
15.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述一個或多個自身互補區(qū)形成莖-環(huán)結構。
16.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含位于所述靶特異性區(qū)之外的二核苷酸AG/UU近端盒。
17.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述一個或多個自身互補區(qū)包含位于所述靶特異性區(qū)之外的四核苷酸遠端盒，其中所述遠端盒的第三個核苷酸不是G。
18.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述第一、第二和第三靶序列中的每個存在于相同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。
19.如權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子，其中所述第一、第二和第三靶序列中的至少兩個存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。
20.編碼權利要求10所述的自身雜交多核苷酸分子的載體。
21.減少基因表達的方法，所述方法包括將權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸復合物、權利要求10至19中任一項所述的多核苷酸分子、或權利要求20所述的載體引入細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述方法在體外實施。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述方法在體內(nèi)實施。
24.如權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸復合物、如權利要求10至19中任一項所述的多核苷酸分子、如權利要求20所述的載體或如權利要求21至23中任一項所述的方法，其中兩個或多個所述第一、第二和/或第三靶特異性區(qū)中的每個與HIV基因的mRNA轉錄本的不同靶區(qū)互補。
25.如權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸復合物、如權利要求10至19中任一項所述的多核苷酸分子、如權利要求20所述的載體或如權利要求21至23中任一項所述的方法，其中兩個或多個所述第一、第二和/或第三靶特異性區(qū)中的每個與人載脂蛋白B(ApoB) 基因的mRNA轉錄本的不同靶區(qū)互補。
全文摘要
本發(fā)明包括具有兩個或多個靶特異性區(qū)的二價或多價核酸分子或核酸分子復合物，其中所述靶特異性區(qū)與單靶基因在多于一個不同的核苷酸位點互補，和/或其中所述靶區(qū)與多于一個靶基因或靶序列互補。還包括的是包含這樣的核酸分子的組合物，以及將所述組合物用于多價RNA干擾和治療各種疾病和感染的方法。
文檔編號A61P31/18GK102575252SQ201080034204
公開日2012年7月11日 申請日期2010年6月1日 優(yōu)先權日2009年6月1日
發(fā)明者托德·M·郝瑟爾 申請人:光環(huán)生物干擾療法公司