專利名稱：聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶的制作方法
聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有實(shí)質(zhì)性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白質(zhì)與聚乙二醇的綴合物，特別是其中所述聚乙二醇具有低于或等于約5000Da的分子量，特別涉及其中所述蛋白質(zhì)是來自歐文氏菌(Erwinia)的L-天冬酰胺酶的綴合物，以及其在治療中的用途。
背景技術(shù)：
具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被稱作L-天冬酰胺酶)已經(jīng)多年被成功地用于治療兒童中的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。ALL是最常見的兒童惡性腫瘤 (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。L-天冬酰胺酶還被用于治療何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓單核細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病，淋巴肉瘤，網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657-669)。L-天冬酰胺酶的抗腫瘤活性被相信是由于某些惡性細(xì)胞不能合成L-天冬酰胺或降低了合成L-天冬酰胺的能力(Kotzia and Labrou, J. Biotechnol. 127 (2007) 657-669)。這些惡性細(xì)胞依賴于L-天冬酰胺的細(xì)胞外供給。然而，L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺水解為天冬胺酸和氨，從而耗盡循環(huán)的L-天冬酰胺庫并殺死腫瘤細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞在沒有L-天冬酰胺時(shí)不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657—669)。來自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶是用于ALL治療的第一種酶藥物并且在美國(guó)已作為Elspar 上市，或者在歐洲作為Kidrolase 和L-天冬酰胺酶Medac 上市。也從其它的微生物中分離了 L-天冬酰胺酶，例如，來自菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi) 的L-天冬酰胺酶蛋白，被命名為克立他酶(crisantaspase)，其作為Erwinase 上市 (ffriston Jr. , J. C. (1985) “ L-asparaGlnase “ Meth.Enzymol. 113,608-618 ；Goward, C. R.等人· (1992) “ Rapid large scale preparation of recombinant Erwinia chrysanthemi L-asparaGlnase " , Bioseparation 2，335_341)。 另1」了: 自 ggl^i 氏菌菌種的L-天冬酰胺酶，包括例如菊歐文氏菌3937 (Genbank登錄號(hào)AAS67(^8)，菊歐文氏菌 NCPPB 1125 (Genbank 登錄號(hào) CAA31239)，胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora) (Genbank登錄號(hào)AAP92666)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種(Erwinia carotovora subsp. Astros印tica) (Genbank登錄號(hào)AAS67027)。這些菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶彼此間具有大約91% -98%的氨基酸序列同一性，而胡蘿卜軟腐歐文氏菌L-天冬酰胺酶與菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶具有大約75%-77%的氨基酸序列同一性(Kotzia and Labrou, J.Biotechnol. 127(2007)657-669)。細(xì)菌來源的L-天冬酰胺酶具有高免疫原和抗原潛力并且經(jīng)常引起不良反應(yīng)，所述不良反應(yīng)的范圍從輕度過敏反應(yīng)到敏化患者中的過敏性休克(Wang，B.等人.(2003) “ Evaluation of immunologic cross reaction of anti—asparaGlnaseantibodies in acute lymphoblastic leukemia (ALL and lymphoma patients), Leukemia 17,1583-1588)。大腸桿菌L-天冬酰胺酶是特別有免疫原性的，據(jù)報(bào)道在i. v.或i. m.施用之后，存在抗大腸桿菌L-天冬酰胺酶的抗天冬酰胺酶抗體在成年人中高達(dá)78% ；在兒童中為 70% (Wang, B.等人· (2003)Leukemia 17,1583-1588)。來自大腸桿菌和菊歐文氏菌的L-天冬酰胺酶在其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)方面不同并且分別具有不同的免疫原性特征譜(Klug Albertsen, B.等人.OOOl) ‘‘ Comparison of intramuscular therapy with Erwinia asparaGlnase and asparaGlnase Medac pharmacokinetics, pharmacodynamics, formation of antibodies and influence on thecoagulation system " Brit. J. Haematol. 115,983—990)。此夕卜，己顯示了在用來自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶處理后產(chǎn)生的抗體不與來自歐文氏菌的L-天冬酰胺酶交叉反應(yīng)(Wang，B.等人·，Leukemia 17^003) 1583-1588)。因此，來自(菊)歐文氏菌的L-天冬酰胺酶在對(duì)大腸桿菌L-天冬酰胺酶有反應(yīng)的患者中，被用作ALL的二線治療(Duval, Μ·等人· (2002) “ Comparison of Escherichia coli-asparaGlnase with Erwinia-asparaGlnase in the treatment of childhood lymphoid malignancies results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer, Childrenr s Leukemia Group phase 3 trial" Blood 15,2734-2739 ；Avramis and Panosyan, Clin.Pharmacokinet. (2005)44 :367-393)。在另一個(gè)為了減少與施用微生物的L-天冬酰胺酶相關(guān)的免疫原性的嘗試中，產(chǎn)生了經(jīng)甲氧基-聚乙二醇(mPEG)修飾的大腸桿菌L-天冬酰胺酶。此方法通常被稱作"聚乙二醇化"并已經(jīng)顯示出改變蛋白質(zhì)的免疫原性性質(zhì)(Abuchowski，A.等人.(1977)“ Alteration of Immunological Properties of Bovine Serum Albumin by Covalent Attachment of Polyethylene Glycol, “ J.Biol.Chem. 252(11),3578-3581) 這種所謂的mPEG-L-天冬酰胺酶，或培門冬酶(pegaspargase)作為OncaSpar (Enzon Inc.，USA)上市，并于1994年首先在美國(guó)被批準(zhǔn)作為ALL的二線治療，并從2006年起被批準(zhǔn)作為兒童和成人的all的一線療法。Oncaspar 具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和降低的免疫原性/抗原性。Oncaspar 是大腸桿菌L-天冬酰胺酶，使用5kDa的mPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG)對(duì)其在多個(gè)賴氨酸殘基處進(jìn)行了修飾(美國(guó)專利號(hào)4，179，337)。SS-PEG是第一代的PEG試劑，其含有對(duì)酶的水解敏感的、或者在微堿性PH值時(shí)不穩(wěn)定的酯鍵(美國(guó)專利號(hào)4，670，417 ；Makromol. Chem. 1986，187，1131-1144)。這些性質(zhì)降低了體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性并且可損害藥物安全性。此外，已顯示了所產(chǎn)生的抗大腸桿菌L-天冬酰胺酶的抗體將與Oncaspar 交叉反應(yīng)((Wang, B.等人· (2003) “ Evaluation of immunologic cross-reaction of anti-asparaGlnase antibodies in acute lymphoblastic leukemia(ALL and lymphoma patients), " Leukemia 17,1583-1588)。雖然這些抗體不是中和性的，但是這一發(fā)現(xiàn)清楚地表明了在體內(nèi)的交叉超敏性或交叉失活的高可能性。的確，在一個(gè)報(bào)導(dǎo)中，30% -41%的接受了培門冬酶的兒童具有過敏反應(yīng)(Wang, B.等人· (2003)Leukemia 17，1583-1588)。除了外在的過敏反應(yīng)之外，最近報(bào)導(dǎo)了 “沉默超敏性”的問題，其中患者產(chǎn)生抗天冬酰胺酶抗體，但不顯示出任何超敏反應(yīng)的臨床跡象(Wang，B.等人.Q003)Leukemia 17，1583-1588)。這種反應(yīng)可引起形成抗大腸桿菌L-天冬酰胺酶和培門冬酶的中和抗體；然而，這些患者不被轉(zhuǎn)向歐文氏菌L-天冬酰胺酶，因?yàn)闆]有外在的超敏跡象，因此，他們接受較短時(shí)期的有效治療(Holcenberg，J.，J. Pediatr. Hemato 1. Oncol. 26(2004)273-274)。菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶治療通常被用于對(duì)源自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶超敏的情形中。然而，觀察到了多至30% -50%接受歐文氏菌L-天冬酰胺酶的患者是抗體陽性的(Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。此夕卜，由于菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶比大腸桿菌L-天冬酰胺酶具有顯著更短的清除半衰期，其必須 ^S^^i&Mffl (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. (2005)44:367—393)。 $ Avramis等人的研究中，歐文氏菌天冬酰胺酶與差的藥代動(dòng)力學(xué)特征譜相關(guān)聯(lián)(Avramis等人.，J. Pediatr. Hemato 1. Oncol. 29 (2007) 239-247)。因此，相對(duì)于歐文氏菌 L-天冬酰胺酶，大腸桿菌L-天冬酰胺酶和培門冬酶是優(yōu)選的ALL的一線療法。許多生物制藥品成功地被聚乙二醇化并上市了許多年。為了將PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，PEG必須在其OH端被活化。基于將被聚乙二醇化的蛋白質(zhì)上可獲得的反應(yīng)基團(tuán)來選擇活化基團(tuán)。在蛋白質(zhì)的情形中，最重要的氨基酸是賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸， C-末端羧酸和N-末端氨基。鑒于蛋白質(zhì)中廣泛的反應(yīng)基團(tuán)，幾乎整個(gè)肽化學(xué)均被應(yīng)用于活化PEG部分。這種活化的PEG試劑的實(shí)例是活化的碳酸酯，例如，對(duì)硝基苯基碳酸酯、 琥珀酰亞胺碳酸酯；活性酯，例如，琥珀酰亞胺酯；對(duì)于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)開發(fā)了醛和馬來酰亞胺(Harris, Μ.，Adv. Drug Del. Rev. 54 (2002), 459-476)。用于 PEG 修飾的各種化學(xué)方法的可得性顯示出對(duì)于聚乙二醇化蛋白的每種新開發(fā)都將是個(gè)案研究。除了化學(xué)過程之外，附著于蛋白的PEG的分子量對(duì)于聚乙二醇化的蛋白的藥學(xué)性質(zhì)也有強(qiáng)大的影響。在多數(shù)情況中，預(yù)期PEG的分子量越高，藥學(xué)性質(zhì)的改進(jìn)越好(Sherman，Μ. R.，Adv. Drug Del. Rev. 60(2008),59-68 ；Holtsberg, F. W. , Journal of Controlled Release 80(2002)， 259-271)。例如，Holtsberg等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)PEG與精氨酸脫氨酶(分離自微生物來源的另一個(gè)氨基酸降解酶)綴合時(shí)，當(dāng)PEG附著物的大小從分子量為5000Da增加到20，OOODa時(shí)， 酶的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效功能增加了(Holtsberg，F(xiàn). W.，Journal ofControlled Release 80(2002) ,259-271)。然而，在許多情形中，與未修飾的的生物制藥品相比，聚乙二醇化的生物制藥品顯示出顯著減少的活性(Fishburn，C. S. (2008)Review" The Pharmacology of PEGylation Balancing PD with PK to Generate Novel Therapeutics" J. Pharm. Sci. , 1-17)。在來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的L-天冬酰胺酶的情形中，觀察到了聚乙二醇化使其體外活性降低至大約57% (Kuchumova,A. V.等人· (2007) “ Modification of Recombinant asparaGlnase from Erwinia carotovora with Polyethylene Glycol 5000" Biochemistry(Moscow) Supplement Series B biomedical Chemistry, 1，230-232)。來自胡蘿卜軟腐歐文氏菌的 L-天冬酰胺酶與菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶(克立他酶)僅具有大約75%的同源性。對(duì)于 Oncaspar ,也已知與未修飾的大腸桿菌L-天冬酰胺酶相比，其體外活性為大約50%。目前可得的L-天冬酰胺酶制備物不提供這樣的備選或互補(bǔ)療法-特別是治療ALL 的療法其特征在于高的催化活性和顯著改進(jìn)的藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性，以及降低的免疫原性。發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及具有實(shí)質(zhì)性的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白與聚乙二醇的綴合物，其中聚乙二醇具有的分子量小于或等于大約5000Da，特別涉及其中所述蛋白質(zhì)是來自歐文氏菌的L-天冬酰胺酶的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述綴合物包含來自歐文氏菌的 L-天冬酰胺酶和聚乙二醇(PEG)，所述L-天冬酰胺酶與SEQ ID NO :1的氨基酸具有至少 80%的同一性，其中PEG具有的分子量小于或等于大約5000Da。在一個(gè)實(shí)施方式中，L-天冬酰胺酶與SEQ ID N0:1的氨基酸具有至少大約80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95%，96%，97%，98%，99%或100%的同一性。在一些實(shí)施方式中，PEG具有的分子量為大約5000Da，4000Da，3000Da，2500Da或2000Da。在一個(gè)實(shí)施方式中，與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物的體外活性為至少60 %，65 %，70 %，75 %，76 %，77 %， 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 % , 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的L-天冬酰胺消耗活性為至少約10，20，30，40，50， 60，70，80，90或100倍更有效。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述綴合物將血漿L-天冬酰胺水平消耗至檢測(cè)不到的水平持續(xù)至少約12，24，48，96，108或120小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期。在具體的實(shí)施方式中，所述綴合物比以同等的蛋白劑量(例如以 yg/kg測(cè)量的)施用的培門冬酶(即PEG綴合的、來自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶)具有更長(zhǎng)的t1/2。在更具體的實(shí)施方式中，在于小鼠中i ν施用之后，在劑量約50yg/kg(基于蛋白質(zhì)含量)時(shí)，所述綴合物具有至少約58至約65小時(shí)的t1/2，并且在劑量約10 μ g/kg (基于蛋白質(zhì)含量)時(shí)，所述綴合物具有至少約34至約40小時(shí)的t1/2。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在大約10，000至大約15，000IU/m2 (約20_30mg蛋白/m2)的劑量范圍內(nèi)，所述綴合物具有至少約100至約200小時(shí)的t1/2。在一個(gè)實(shí)施方式中，與未和PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有更大的曲線下面積(AUC)。在具體的實(shí)施方式中，在相等的蛋白劑量，所述綴合物具有的平均AUC比培門冬酶大至少約3倍。在一個(gè)實(shí)施方式中，PEG與L-天冬酰胺酶的一個(gè)或多個(gè)氨基共價(jià)連接(其中" 氨基"包括賴氨酸殘基和/或N-末端)。在更具體的實(shí)施方式中，PEG通過酰胺鍵與一個(gè)或多個(gè)氨基共價(jià)連接。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，PEG共價(jià)連接于至少大約40%至大約 100%可用的氨基(例如，賴氨酸殘基和/或蛋白的N-末端)或者至少約40%至約90%的總氨基(例如，賴氨酸殘基和/或蛋白的N-末端)。在一個(gè)實(shí)施方式中，綴合物具有下式Asp-[NH-C0-(CH2)x-CO-NH-PEG]η其中Asp是L-天冬酰胺酶；NH是Asp的賴氨酸殘基和/或N-末端的一個(gè)或多個(gè) NH基團(tuán)；PEG是聚乙二醇部分；η是個(gè)數(shù)字，其代表Asp中至少約40%至約100%的可用的氨基(例如賴氨酸殘基和/或N-末端)，而χ是大約1至大約8、更特別地，大約2至大約 5的整數(shù)。在具體的實(shí)施方式中，PEG為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。另一方面，本發(fā)明涉及制造綴合物的方法，其包括在經(jīng)緩沖的溶液中使一定量的 PEG與一定量的L-天冬酰胺酶相結(jié)合足以使PEG共價(jià)連接至L-天冬酰胺酶的一段時(shí)間。另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的綴合物。另一方面，本發(fā)明涉及治療疾病的方法，所述疾病可由消耗患者中的L-天冬酰胺而治療，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病為癌癥。在具體的實(shí)施方式中，所述癌癥為ALL。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，以大約5U/kg體重至大約50U/kg體重的量施用所述綴合物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所施用的綴合物的劑量范圍為約10，000至約15，000 IU/m2 (大約20_30mg蛋白/m2)。在一些實(shí)施方式中， 所述施用可以是靜脈內(nèi)的或肌肉內(nèi)的并且可以是少于每周一次(例如，每月一次或隔周一次)，每周一次，每周2次，或每周3次。在其它的具體實(shí)施方式
中，所述綴合物作為單一療法被施用，且更特別地，不含天冬酰胺合成酶抑制劑。在其它的實(shí)施方式中，所述綴合物作為組合療法的一部分被施用(但是在一些實(shí)施方式中，所述組合療法不包括天冬酰胺合成酶抑制劑)。在具體的實(shí)施方式中，接受治療的患者對(duì)于大腸桿菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式或者對(duì)于歐文氏菌天冬酰胺酶具有既往的超敏性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，接受治療的患者具有疾病復(fù)發(fā)，特別是在用大腸桿菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式治療后的復(fù)發(fā)。


圖1 純化的重組菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在 SDS-PAGE上分析純化的重組的菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。用硝酸銀對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色。道1 分子量標(biāo)記物(116,66. 2，45，35，25，18. 4和14. 4kDa)，道2 純化的重組菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶(r-克立他酶)。圖2 :mPEG-r-克立他酶綴合物的SDS-PAGE分析。圖3 單一靜脈內(nèi)劑量的Erwinase (5U/kg，25U/kg，125U/kg和 250U/kg體重) 之后，血漿L-天冬酰胺的水平。圖4 在小鼠中單一的靜脈內(nèi)注射mPEG-r-克立他酶綴合物后，與Erwinase 相比的血漿L-天冬酰胺水平。數(shù)字〃 40%〃和〃 100%〃分別表示大約40%-55% (部分聚乙二醇化的)和大約100% (最大程度聚乙二醇化的)可用的氨基的聚乙二醇化的大概程度。圖5 在小鼠中單一的靜脈內(nèi)注射mPEG-r-克立他酶綴合物后，從L-天冬酰胺酶特征譜計(jì)算出的曲線下面積(AUC)(殘余酶活性)。圖6 在小鼠中單一靜脈內(nèi)劑量的下列之后的血漿L-天冬酰胺水平2kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg, 25U/kg 和 50U/kg 體重)(圖 6A)，5kDa_100 % mPEG-r-克立他酶(5U/kg, 25U/kg 和 50U/kg 體重)(圖 6B)或 2kDa_100 % mPEG-r-克立他酶(5U/ kg)，5kDa-100 % mPEG-r-克立他酶(5U/kg)和培門冬酶(OncaSpar ) (lU/kg)(圖 6C)。施用等量的蛋白(10yg/kg)在72小時(shí)中產(chǎn)生相似的L-天冬酰胺消耗，所述蛋白為 2kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，5kDa-100% mPEG-r-克立他酶(5U/kg)，或培門冬酶(Oncaspar , ιυ/kg)。圖7 :2kDa_100%聚乙二醇化的r_克立他酶與5kDa_100%聚乙二醇化的r_克立他酶相比的劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖7A顯示以5U/kg (基于蛋白質(zhì)含量為10 μ g/kg)，25U/kg 和50U/kg時(shí)，單一靜脈內(nèi)劑量的2kDa-100%聚乙二醇化r-克立他酶之后，血漿中的殘余酶活性。圖7B顯示以5U/kg(基于蛋白質(zhì)含量為1(^8/1^)，25~1^和5(^/1^時(shí)，單一靜脈內(nèi)劑量的5kDa-100%聚乙二醇化的r-克立他酶之后，血漿中的殘余酶活性。圖8 :2kDa-100 %聚乙二醇化的r_克立他酶相比于5kDa_100 %聚乙二醇化的r-克立他酶的劑量-效應(yīng)關(guān)系。單一靜脈內(nèi)劑量的2kDa-100%或5kDa_100% mPEG-綴合物后，在小鼠中測(cè)量的殘余酶活性的AUC?？偟膩碚f，當(dāng)在相同的劑量水平進(jìn)行比較時(shí)，對(duì)于 5kDa-100% mPEG-r-克立他酶測(cè)量的AUC高于對(duì)于2-kDa_100% mPEG-r-克立他酶所觀察到的。在5，25和50U/kg劑量時(shí)，分別觀察到了 31%,37%^P 14%的差別。圖9 小鼠中，mPEG-r-克立他酶綴合物相對(duì)于培門冬酶(Oncaspar )的藥代動(dòng)力學(xué)。圖9A代表單一靜脈內(nèi)劑量的2kDa-100% mPEG_r-克立他酶，5kDa_100% mPEG_r-克立他酶或培門冬酶(Oncaspar )之后，在小鼠中測(cè)量的殘余酶活性。圖9B代表單一靜脈內(nèi)劑量的2kDa-100 % mPEG-r-克立他酶，5kDa_100 % mPEG_r-克立他酶或培門冬酶 0)ncaspar )后，在小鼠中測(cè)量的殘余酶活性的auc。圖10 用mPEG-r-克立他酶綴合物或Erwinase 處理后，抗克立他酶特異性抗體的血清水平?？贵w針對(duì)的是克立他酶。數(shù)據(jù)表示為平均值士SD(N = 8)。圖11 用mPEG-r-克立他酶最大程度(100% )聚乙二醇化的綴合物處理后，抗綴合物特異性抗體的血清水平。圖IlA 結(jié)果表示為平均值士SD(n = 8)；圖IlB 結(jié)果表示為在抗綴合物ELISA中，具有> 0. 5的吸光度值的動(dòng)物的百分率。發(fā)明詳述—方面，本發(fā)明要解決的問題是提供具有下列的L-天冬酰胺酶制備物-高的體外生物活性；-穩(wěn)定的PEG-蛋白質(zhì)連接；-延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期；-顯著減少的免疫原性，如下列所證明的例如重復(fù)施用后減少或去除抗L-天冬酰胺酶制備物的抗體應(yīng)答；和-對(duì)于產(chǎn)生了對(duì)使用例如源自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶的一線療法的敏感性的患者，作為二線療法的用途。已知的L-天冬酰胺酶綴合物沒有解決這個(gè)問題，其具有與經(jīng)修飾的L-天冬酰胺酶制備物的顯著的交叉反應(yīng)性(Wang，B.等人· (2003)Leukemia 17，1583-1588，在此以其全部通過引用而并入)，或具有顯著降低的體外活性(Kuchumova，Α. V.等人.Q007) Biochemistry (Moscow) Supplement Series B !Biomedical Chemistry，1，230_232，在此以其全部通過引用而并入)。根據(jù)本發(fā)明，通過提供歐文氏菌L-天冬酰胺酶與親水性聚合物 (更具體地，分子量為5000Da或更少的聚乙二醇)的綴合物、制備此類綴合物的方法和所述綴合物的用途而解決了這一問題。本文中描述的是來自歐文氏菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，與未修飾的L-天冬酰胺酶蛋白以及來自大腸桿菌的培門冬酶制備物相比，其具有改進(jìn)的藥理學(xué)特性。本文中描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶綴合物(例如被分子量為5000Da的PEG聚乙二醇化的菊歐文氏菌L-天冬酰胺酶)作為治療劑，特別用于對(duì)用來自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，或者來自歐文氏菌的未修飾的L-天冬酰胺酶進(jìn)行的治療顯示出超敏(例如過敏反應(yīng)或沉默超敏性)的患者。本文中所描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶綴合物也可用作治療劑而用于具有疾病復(fù)發(fā)(例如ALL的復(fù)發(fā))且以前用另一種形式的天冬酰胺酶(例如用來自大腸桿菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶) 治療過的患者中。
如本文中所詳述的，與已知的L-天冬酰胺酶(例如培門冬酶)制備物相比，本發(fā)明的綴合物顯示出出人意料的優(yōu)越特性。例如，與來自大腸桿菌的未修飾的L-天冬酰胺酶相比，來自菊歐文氏菌的未修飾的L-天冬酰胺酶(克立他酶)具有顯著更低的半衰期 (Avramis and Panosyan, Clin. Pharmacokinet. Q005)44 :367_393，在此以其全部通過引用而并入)。以相等的蛋白質(zhì)劑量，本發(fā)明的聚乙二醇化的綴合物具有的半衰期大于來自大腸桿菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶。定義除非另外明確地定義，本文中所使用的術(shù)語將根據(jù)它們?cè)诒绢I(lǐng)域中的通常含義來理解。如本文中所使用的，術(shù)語"包括"指"包括但不限于"，并且以單數(shù)形式使用的術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，反之亦然，除非上下文另有指示。如本文中所使用的，術(shù)語“可通過消耗天冬酰胺而治療的疾病”是指這樣的病況或病癥，其中參與或促成所述病況或病癥的細(xì)胞缺乏合成L-天冬酰胺的能力或具有降低的合成L-天冬酰胺的能力。L-天冬酰胺的消耗或喪失可以是部分的或基本上完全的(例如， 達(dá)到使用本領(lǐng)域已知的方法和設(shè)備不可檢測(cè)到的水平)。如本文中所使用的，術(shù)語"治療有效量"是指產(chǎn)生所希望的治療效果所需要的蛋白(例如天冬酰胺酶或其綴合物)的量。L-天冬酰胺酶蛋白根據(jù)本發(fā)明的蛋白是具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的酶，即L-天冬酰胺酶。在本領(lǐng)域中已鑒別了許多L-天冬酰胺酶蛋白，其是通過已知的方法從微生物中分離的(見例如 Savitri and Azmi, Indian J. Biotechnol 2 Q003) 184-194，在此以其全部通過引用而并入)。最廣泛使用且商業(yè)上可得的L-天冬酰胺酶是源自大腸桿菌或菊歐文氏菌的，二者共享50%或更少的結(jié)構(gòu)同源性。在歐文氏菌的種中，源自菊歐文氏菌與胡蘿卜軟腐歐文氏菌的酶之間被報(bào)道通常有75% -77%的序列同一性，且在菊歐文氏菌的不同亞種之間發(fā)現(xiàn)有大約90%的序列同一性(Kotzia GA，Labrou E，Journal of Biotechnology (2007) 127 :657_669，在此以其全部通過引用而并入)。一些代表性的歐文氏菌L-天冬酰胺酶包括，例如表1中所提供的那些表 權(quán)利要求
1.綴合物，其包含來自歐文氏菌(Erwinia)的L-天冬酰胺酶和聚乙二醇(PEG)，所述 L-天冬酰胺酶與SEQ ID NO :1的氨基酸具有至少80%的同一性，其中PEG具有的分子量小于或等于約5000Da。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述L-天冬酰胺酶與SEQID N0:1的氨基酸具有至少 90%的同一性。
3.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述L-天冬酰胺酶與SEQID N0:1的氨基酸具有至少 99%的同一性。
4.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述L-天冬酰胺酶與SEQID NO 1的氨基酸相同。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG具有約5000Da的分子量。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG具有的分子量小于約5000Da。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG具有的分子量小于約4000Da。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG具有的分子量小于約3000Da。
9.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG具有的分子量小于約2500Da。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少60%。
11.權(quán)利要求10的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少70%。
12.權(quán)利要求11的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少78%。
13.權(quán)利要求10的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少80%。
14.權(quán)利要求10的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少87%。
15.權(quán)利要求10的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物具有的體外活性為至少90%。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比， 所述綴合物具有的L-天冬酰胺消耗活性至少約50倍更有效。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述綴合物消耗血漿L-天冬酰胺水平至檢測(cè)不到的水平持續(xù)至少48小時(shí)。
18.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述綴合物消耗血漿L-天冬酰胺水平至檢測(cè)不到的水平持續(xù)至少96小時(shí)。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比， 所述綴合物具有更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的綴合物，其中在相等的蛋白劑量下，所述綴合物具有比培門冬酶更長(zhǎng)的、/2。
21.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約50μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 58小時(shí)的t1/2。
22.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約50μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 60小時(shí)的t1/2。
23.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約50μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 63小時(shí)的t1/2。
24.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約50μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 65小時(shí)的t1/2。
25.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約10μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 34小時(shí)的t1/2。
26.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約10μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 36小時(shí)的t1/2。
27.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約10μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 38小時(shí)的t1/2。
28.權(quán)利要求20的綴合物，其中在約10μ g蛋白/kg的劑量下，所述綴合物具有至少約 40小時(shí)的t1/2。
29.權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)的綴合物，其中與未與PEG綴合時(shí)的L-天冬酰胺酶相比， 所述綴合物具有更大的AUC。
30.權(quán)利要求四的綴合物，其中在相等的蛋白劑量下，所述綴合物具有的平均AUC比培門冬酶大至少約3倍。
31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的綴合物，其中PEG共價(jià)連接于所述L-天冬酰胺酶的一個(gè)或多個(gè)氨基。
32.權(quán)利要求31的綴合物，其中PEG通過酰胺鍵共價(jià)連接于所述一個(gè)或多個(gè)氨基。
33.權(quán)利要求31或32的綴合物，其中PEG共價(jià)連接于至少約40%至約100%的可用氨基ο
34.權(quán)利要求31的綴合物，其中PEG共價(jià)連接于至少約40%至約90%的總氨基。
35.權(quán)利要求1至34之一的綴合物，其具有下式Asp-[NH-C0-(CH2)x-CO-NH-PEG]η其中Asp為L(zhǎng)-天冬酰胺酶，NH為Asp中賴氨酸殘基和/或N-末端的一個(gè)或多個(gè)NH基團(tuán)，PEG為聚乙二醇部分，η是代表Asp中至少40%至約100%的可用氨基(例如賴氨酸殘基和/或N-末端)的數(shù)字，且χ是1至8范圍內(nèi)的整數(shù)。
36.權(quán)利要求35的綴合物，其中χ是2至5范圍內(nèi)的整數(shù)。
37.權(quán)利要求35的綴合物，其中η是代表Asp中至少約40%的可用氨基的數(shù)字。
38.權(quán)利要求37的綴合物，其中η是代表Asp中約100%的可用氨基的數(shù)字。
39.權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述PEG為單甲氧基聚乙二醇。
40.用于制備權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的綴合物的方法，所述方法包括使一定量的所述 PEG與一定量的所述L-天冬酰胺酶在經(jīng)緩沖的溶液中結(jié)合足以使所述PEG共價(jià)連接至所述 L-天冬酰胺酶的一段時(shí)間。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述經(jīng)緩沖的溶液具有約7.0至約9. 0的pH值。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述經(jīng)緩沖的溶液具有約7.5至約8.5的pH值。
43.權(quán)利要求40的方法，所述L-天冬酰胺酶的量是約0.5mg/mL至約25mg/mL的蛋白濃度。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述L-天冬酰胺酶的量是約ang/mL至約20mg/mL的蛋白濃度。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述L-天冬酰胺酶的量是約:3mg/mL至約15mg/mL的蛋白濃度。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述PEG的量為聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩爾過量少于約20 1。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述PEG的量為聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩爾過量少于約10 1。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述PEG的量為聚合物比所述L-天冬酰胺酶中的氨基的摩爾過量少于約8 1。
49.權(quán)利要求40-48中任一項(xiàng)的方法，其中所述PEG為單甲氧基聚乙二醇。
50.治療患者中可通過L-天冬酰胺消耗而治療的疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的綴合物。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述可通過L-天冬酰胺消耗而治療的疾病是癌癥。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述癌癥選自急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述癌癥為ALL。
54.權(quán)利要求53的方法，其中以約5U/kg至約25U/kg的量施用所述綴合物。
55.權(quán)利要求M的方法，其中以約25U/kg的量施用所述綴合物。
56.權(quán)利要求53-55中任一項(xiàng)的方法，其中以下列劑量施用所述綴合物其消耗L-天冬酰胺至檢測(cè)不到的水平持續(xù)約3天至約10天。
57.權(quán)利要求53-56中任一項(xiàng)的方法，其中與未綴合的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物在所述患者中引起更低的免疫原性應(yīng)答。
58.權(quán)利要求53-57中任一項(xiàng)的方法，其中與未綴合的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物在單一劑量后具有更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期。
59.權(quán)利要求53-58中任一項(xiàng)的方法，其中與未綴合的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物在單一劑量后具有更大的AUC值。
60.權(quán)利要求50-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述綴合物被靜脈內(nèi)施用。
61.權(quán)利要求50-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述綴合物被肌肉內(nèi)施用。
62.權(quán)利要求50-61中任一項(xiàng)的方法，其中每周施用一次所述綴合物。
63.權(quán)利要求50-61中任一項(xiàng)的方法，其中每周施用兩次所述綴合物。
64.權(quán)利要求50-61中任一項(xiàng)的方法，其中少于每周一次施用所述綴合物。
65.權(quán)利要求50-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述綴合物作為單一療法被施用。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述綴合物不與天冬酰胺合成酶抑制劑一起施用。
67.權(quán)利要求50至66中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者對(duì)大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式有既往的超敏性。
68.權(quán)利要求50至66中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者對(duì)歐文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性。
69.權(quán)利要求67或68的方法，其中所述超敏性選自過敏反應(yīng)、過敏性休克和沉默超敏性。
70.權(quán)利要求50-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者有疾病復(fù)發(fā)。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述疾病復(fù)發(fā)在用大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的形式治療后發(fā)生。
72.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的綴合物。
73.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的綴合物，其用于治療。
74.權(quán)利要求73的綴合物，其用于治療可通過L-天冬酰胺消耗而治療的疾病。
75.權(quán)利要求74的綴合物，其中所述疾病為癌癥。
76.權(quán)利要求75的綴合物，其中所述癌癥為ALL。
77.權(quán)利要求76的綴合物，其中與未綴合的L-天冬酰胺酶相比，所述綴合物在所述患者中引起更低的免疫原性應(yīng)答。
78.權(quán)利要求73-77中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述藥物用于治療對(duì)大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式具有既往的超敏性的患者中的疾病。
79.權(quán)利要求73-77中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述藥物用于治療對(duì)歐文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性的患者中的疾病。
80.權(quán)利要求78或79的綴合物，其中所述超敏性選自過敏反應(yīng)、過敏性休克和沉默超敏性。
81.權(quán)利要求73-80中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述藥物用于治療具有疾病復(fù)發(fā)的患者中的疾病。
82.權(quán)利要求81的綴合物，其中所述疾病復(fù)發(fā)在用大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治療之后發(fā)生。
83.治療患者中可通過L-天冬酰胺消耗而治療的疾病的方法，所述方法包括選擇需要治療的患者以及向所述患者施用有效量的權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述患者對(duì)大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式有既往的超敏性，和/或其中所述患者對(duì)歐文氏菌L-天冬酰胺酶具有既往的超敏性，和/或所述患者具有疾病復(fù)發(fā)。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述超敏性選自過敏反應(yīng)、過敏性休克和沉默超敏性。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述疾病復(fù)發(fā)在用大腸桿菌L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治療之后發(fā)生。
86.權(quán)利要求83-85之一的方法，其中所述可通過L-天冬酰胺消耗治療的疾病為癌癥， 特別是選自急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。
87.權(quán)利要求83-86之一的方法，其中以約5U/kg至約25U/kg的量、優(yōu)選約25U/kg的量施用所述綴合物。
88.權(quán)利要求83-87中任一項(xiàng)的方法，其中以下列劑量施用所述綴合物其消耗L-天冬酰胺至檢測(cè)不到的水平持續(xù)約3天至約10天。
89.權(quán)利要求83-88中任一項(xiàng)的方法，其中靜脈內(nèi)地或肌肉內(nèi)地施用所述綴合物。
90.權(quán)利要求83至89中任一項(xiàng)的方法，其中每周一次施用所述綴合物。
91.權(quán)利要求83-89中任一項(xiàng)的方法，其中每周兩次施用所述綴合物。
92.權(quán)利要求83-89中任一項(xiàng)的方法，其中少于每周一次施用所述綴合物。
93.權(quán)利要求83-92中任一項(xiàng)的方法，其中所述綴合物作為單一療法被施用。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述綴合物不與天冬酰胺合成酶抑制劑一起施用。
全文摘要
公開了具有實(shí)質(zhì)上的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白與聚乙二醇的綴合物。特別地，聚乙二醇具有的分子量小于或等于約5000Da并且所述蛋白為來自歐文氏菌的L-天冬酰胺酶。本發(fā)明的綴合物顯示了優(yōu)越的特性，例如維持高水平的體外活性和出人意料的體內(nèi)半衰期的增加。還公開了生產(chǎn)所述綴合物的方法和所述綴合物在治療中的用途。特別地，公開了使用所述綴合物治療癌癥的方法，特別是急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。更特別地，公開了使用所述綴合物作為二線療法而用于下列患者的方法所述患者在用其它L-天冬酰胺酶制備物治療后產(chǎn)生了超敏性或具有疾病復(fù)發(fā)。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102573917SQ201080030392
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者T·阿布里巴 申請(qǐng)人:阿利茲第二藥物公司