專利名稱：細(xì)胞膜通透性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有細(xì)胞膜通透性的新的肽以及含有該肽和親水性生理活性物質(zhì)的藥物組合物。
背景技術(shù)：
細(xì)胞通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等親水性生理活性物質(zhì)為非通透性的細(xì)胞膜而與外界隔離開。沒(méi)有將這些親水性生理活性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的方法，這成為以細(xì)胞內(nèi)為作用部位的大量親水性生理活性物質(zhì)的臨床使用的障礙。報(bào)告了幾項(xiàng)將這樣的細(xì)胞非通透性的親水性生理活性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的技術(shù)。 最一般的方法是使用脂質(zhì)賦予親水性生理活性物質(zhì)以疏水性，從而可以提高細(xì)胞膜的通過(guò)性。另外，還報(bào)告了使用肽性的配基來(lái)提高通透性的技術(shù)。具有在不破壞細(xì)胞膜的狀態(tài)下從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的性質(zhì)的肽配基被稱為細(xì)胞膜通透性肽。作為著名的細(xì)胞膜通透性肽，有由精氨酸連接而成的寡聚精氨酸、來(lái)源于 HIV-I病毒的肽Tat (專利文獻(xiàn)1)、作為來(lái)源于果蠅的肽的穿膜肽(penetratin)(專利文獻(xiàn) 2)等。除此以外，還報(bào)告了以單純的堿性為特征的肽、以肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的兩親性為特征的肽、機(jī)制不明確的肽等各種肽。關(guān)于這些肽，除了其自身的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移性之外，如上所述以其自身為媒介將所連接的基因等親水性生理活性物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部的用途的研究正在盛行。但是，雖然作為研究用試劑有實(shí)際成績(jī)，但用于臨床應(yīng)用的較少，正在進(jìn)行各種摸索，在各種用途中探索能夠更高效地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的序列。在一部分細(xì)胞膜通透性肽中，報(bào)告了在與親水性生理活性物質(zhì)一起經(jīng)口或經(jīng)鼻施用的情況下，能夠促進(jìn)親水性生理活性物質(zhì)通過(guò)粘膜上皮細(xì)胞層，從而能夠使親水性生理活性物質(zhì)以高效率轉(zhuǎn)移到全身循環(huán)中的肽。認(rèn)為并不是所有的細(xì)胞膜通透性肽都具有促進(jìn)從粘膜通透的性質(zhì)，除了細(xì)胞膜通透性之外，該性質(zhì)還與細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)、從細(xì)胞的脫離等特性有關(guān)，只有滿足這些條件的一部分細(xì)胞膜通透性肽具有促進(jìn)親水性生理活性物質(zhì)的經(jīng)粘膜吸收的能力，但已被報(bào)告具有這樣的功能的肽的種類較少。另外，即使是已被報(bào)告具有粘膜通透促進(jìn)性的肽，現(xiàn)狀也是其實(shí)用化還存在大量課題，例如，即使對(duì)于僅以與特定的生理活性物質(zhì)結(jié)合而確認(rèn)了其效果的肽(專利文獻(xiàn)2、3)、或顯示了可能以不需要與藥物共價(jià)結(jié)合的形式使用的肽，為了獲得充分的效果，也需要大量的細(xì)胞膜通透性肽(專利文獻(xiàn)4)，等寸。親水性生理活性物質(zhì)近年來(lái)作為到目前為止占主流的低分子且疏水性的藥物以及藥物的候選化合物受到關(guān)注，顯示顯著的治療效果，但由于經(jīng)粘膜的難吸收性，現(xiàn)狀是其施用方法基本限于注射劑，從粘膜吸收親水性生理活性物質(zhì)的技術(shù)開發(fā)在親水性生理活性物質(zhì)的非注射劑化的用途中被強(qiáng)烈期待。特別是利用細(xì)胞膜通透肽的吸收促進(jìn)技術(shù)與到目前為止被廣泛研究的利用表面活性劑的吸收促進(jìn)技術(shù)相比，可期待對(duì)粘膜的刺激性低，如果發(fā)現(xiàn)能夠高效地促進(jìn)吸收的細(xì)胞膜通透肽，則可能成為有希望的技術(shù)。專利文獻(xiàn)1 特開平10-33186號(hào)公報(bào)
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專利文獻(xiàn)2 特表2002-530059號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :W02004/037859專利文獻(xiàn)4 特開平10-95738號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題是提供能夠使親水性生理活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的新的細(xì)胞膜通透性肽。用于解決課題的方法本發(fā)明者們探索具有細(xì)胞膜通透性的肽序列，發(fā)現(xiàn)了作為目標(biāo)的具有細(xì)胞膜通透性的新的肽序列。即，本發(fā)明具有如下構(gòu)成。(1)以下(A) ⑶的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽(A)包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽；(B)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽；(C)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽；(D)包含用㈧ (C)的任一項(xiàng)所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列，在用㈧ 的反向序列表示的氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，或者在用(A)的反向序列表示的氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽。(2)根據(jù)⑴所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述⑶的肽包含序列號(hào)2 4、9 10、13的任一者所示氨基酸序列。(3)根據(jù)⑴或⑵所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述(C)的肽包含序列號(hào)12、 15 30的任一者所示氨基酸序列。(4)根據(jù)⑴ (3)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述⑶的肽包含序列號(hào)5或14所示氨基酸序列。(5) 一種藥物組合物，其包含⑴ ⑷的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。(6) 一種用于經(jīng)口施用的藥物組合物，其包含(1) ⑷的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。(7) 一種用于經(jīng)鼻施用的藥物組合物，其包含(1) (4)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。(8)根據(jù)(5) (7)的任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，親水性生理活性物質(zhì)是肽、 蛋白質(zhì)或核酸。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，使親水性生理活性物質(zhì)能夠高效地向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而可以實(shí)現(xiàn)以細(xì)胞內(nèi)的分子為靶標(biāo)的新的藥物治療。另外，可以將到目前為止僅能通過(guò)注射來(lái)施用的親水性生理活性物質(zhì)通過(guò)經(jīng)口、經(jīng)鼻施用等而非注射劑化，從而可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便且對(duì)患者溫和的藥物治療。


圖1是顯示細(xì)胞膜通透性肽向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。圖2是顯示細(xì)胞膜通透性肽促進(jìn)胰島素向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。圖3是顯示細(xì)胞膜通透性肽促進(jìn)聚苯乙烯珠向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。圖4是通過(guò)血糖值來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖5是通過(guò)血漿中的胰島素濃度來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖6是通過(guò)生物利用率來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖7是通過(guò)血漿中的β -干擾素濃度來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的β -干擾素的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖8是通過(guò)血漿中的艾塞那肽-4濃度來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的艾塞那肽-4 的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖9是通過(guò)血糖值來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的腸道吸收性的圖。圖10是通過(guò)血漿中的胰島素濃度來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的腸道吸收性的圖。圖11是通過(guò)LDH泄漏來(lái)顯示細(xì)胞膜通透性肽的鼻腔障礙性的圖。圖12是顯示各細(xì)胞膜通透性肽促進(jìn)胰島素向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的激光共聚焦顯微鏡觀察像。各圖中的A(左上)顯示羅丹明標(biāo)記胰島素的存在位置、B(右上)顯示經(jīng)DiD’0il 染色的細(xì)胞膜、C (左下)顯示微分干涉像、A+B (右下)顯示將A的像與B的像重疊表示的像。圖13是顯示細(xì)胞膜通透性肽促進(jìn)胰島素向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。圖14是通過(guò)AUC來(lái)顯示利用細(xì)胞膜通透性肽的胰島素的經(jīng)鼻吸收性的圖。圖15是顯示細(xì)胞膜通透性肽向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。圖16是顯示細(xì)胞膜通透性肽促進(jìn)胰島素向HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明者新發(fā)現(xiàn)了包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽(以下也稱為序列號(hào)1的肽)或其變構(gòu)肽是細(xì)胞膜通透性肽，從而完成了本發(fā)明。以下，對(duì)于本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽的所謂細(xì)胞膜通透性，表示通過(guò)將細(xì)胞的外部與內(nèi)部隔開的脂質(zhì)膜的性質(zhì)。肽是否通過(guò)細(xì)胞膜通透性如下確認(rèn)，即，將在該肽上連接熒光物質(zhì)而得的肽添加到細(xì)胞中，用激光共聚焦顯微鏡等觀察，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)部是否能檢測(cè)到熒光物質(zhì)來(lái)確認(rèn)。另外，可以通過(guò)將攝入了連接有熒光物質(zhì)的該肽的細(xì)胞進(jìn)行破碎，對(duì)破碎液使用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而定量地確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移性。此外，在本說(shuō)明書中，在連接了熒光物質(zhì)(作為具體例是熒光素)的肽向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移量，與連接了熒光物質(zhì)的包含序列號(hào) 6所示氨基酸序列的非細(xì)胞膜通透性的肽的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移量相比，上升了 3倍以上的情況下， 判斷該肽是細(xì)胞膜通透性肽。
另外，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽具有賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性的特征。此外，在本說(shuō)明書中，在使經(jīng)熒光標(biāo)記的親水性生理活性物質(zhì)與肽連接或混合而與細(xì)胞接觸時(shí)的熒光標(biāo)記親水性生理活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移效率，與僅使熒光標(biāo)記親水性生理活性物質(zhì)與細(xì)胞接觸時(shí)的熒光標(biāo)記親水性生理活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移效率相比，高3倍以上的情況下，判斷該肽具有賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性的特征。而且，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽具有賦予親水性生理活性物質(zhì)以粘膜吸收性(優(yōu)選為腸道吸收性或鼻腔吸收性)的特征。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)于單獨(dú)難以經(jīng)過(guò)粘膜而被攝入生物體內(nèi)的親水性生理活性物質(zhì)來(lái)說(shuō)，如果使細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)連接或混合而得的產(chǎn)物與粘膜組織(優(yōu)選為腸道組織或鼻腔組織)接觸，則親水性生理活性物質(zhì)的經(jīng)粘膜吸收(優(yōu)選為腸道吸收性或鼻腔吸收性)被促進(jìn)。包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽是通過(guò)細(xì)胞膜通透性肽的篩選而發(fā)現(xiàn)的新的肽。對(duì)該肽所通過(guò)的細(xì)胞的種類不特別限制，可以是原核細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，但優(yōu)選為真核細(xì)胞，更優(yōu)選可以通過(guò)哺乳類細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)一步優(yōu)選可以通過(guò)哺乳類的粘膜細(xì)胞膜。另外，該肽不僅其本身是細(xì)胞膜通透性的，而且可以通過(guò)使該肽與親水性生理活性物質(zhì)共價(jià)結(jié)合來(lái)賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性，優(yōu)選是即使在該肽與親水性生理活性物質(zhì)分別獨(dú)立存在的組合物的狀態(tài)下也能夠賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性的肽。另外，對(duì)于包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列的變構(gòu)肽，在具有細(xì)胞膜通透性的范圍內(nèi)也是本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽。這里所謂堿性氨基酸，是指精氨酸、賴氨酸、組氨酸的任一氨基酸。替換、缺失、插入或添加的堿性氨基酸的數(shù)優(yōu)選為1 7個(gè)，更優(yōu)選為1 5個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為1 3個(gè)，特別優(yōu)選為1個(gè)。此外，在通過(guò)替換、缺失或插入而變異了的氨基酸序列中，優(yōu)選保存原來(lái)的氨基酸序列的3個(gè)以上氨基酸連續(xù)的排列，更優(yōu)選保存5個(gè)以上氨基酸連續(xù)的排列。另外， 在序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸被替換為其他堿性氨基酸的變構(gòu)肽的情況下，由于替換成具有同一特性的肽不易造成肽整體特性變化，因此是最能容許的改變。作為包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中缺失、替換或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽的優(yōu)選例，可列舉包含序列號(hào)2 4、9 10、13的任一者所示氨基酸序列的肽。另外，對(duì)于包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了不限于堿性氨基酸的1 5個(gè)、優(yōu)選為1 3個(gè)、更優(yōu)選為1或2個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè)氨基酸的氨基酸序列的變構(gòu)肽，在具有細(xì)胞膜通透性的范圍內(nèi)也是本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽。此外，在通過(guò)序列號(hào)1所示氨基酸的替換、缺失、插入或添加而獲得的變構(gòu)肽中，優(yōu)選保存原來(lái)的氨基酸序列的3個(gè)以上氨基酸連續(xù)的排列，更優(yōu)選保存5個(gè)以上氨基酸連續(xù)的排列。另外，在序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸被替換成其他堿性氨基酸、親水性氨基酸被替換成其他親水性氨基酸、疏水性氨基酸被替換成其他疏水性氨基酸等情況下，由于替換成具有同一特性的肽不易造成肽整體特性變化，因此最能容許。作為包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了不限于堿性氨基酸的1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽的優(yōu)選例，可列舉包含序列號(hào)12、15 30的任一者所示氨基酸序列的肽。
另外，對(duì)于包含用包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或包含用在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或者包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列的反向序列中替換、缺失、插入或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列的肽，或者包含用在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了不限于堿性氨基酸的1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或者包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列的反向序列中替換、缺失、插入或添加了不限于堿性氨基酸的1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列的肽，在具有細(xì)胞膜通透性的范圍內(nèi)也都是本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽。這里所謂包含反向序列的肽，表示構(gòu)成的氨基酸的排列相反，例如，當(dāng)從N末端向C末端的氨基酸序列的排列為精氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、賴氨酸時(shí)，其反向肽是指從N末端向C末端的氨基酸序列的排列為賴氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸的肽。作為本具體例，可列舉作為包含用包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列且具有細(xì)胞膜通透性的肽的、包含序列號(hào)5或14所示氨基酸序列的肽。構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽的氨基酸除了作為天然存在的氨基酸的構(gòu)型為L(zhǎng) 型的氨基酸之外，還可以使用將天然氨基酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行部分改變而得的衍生物等非天然氨基酸。例如，構(gòu)型為D型的氨基酸由于不易受到蛋白分解酶的分解而可以有效地使用，因此該肽的氨基酸序列中的一部分氨基酸可以是D型。另外，構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽的氨基酸無(wú)論是否在自然界存在，只要是具有羧基和氨基的分子即可，也可以是經(jīng)過(guò)羥基化、磷氧化、或糖基化等生物體內(nèi)常見的翻譯后修飾的氨基酸，優(yōu)選為包含哺乳類細(xì)胞內(nèi)通常存在的天然氨基酸及其光學(xué)異構(gòu)體的序列，例如，包含精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸 (Glu)、谷氨酰胺(Gin)、組氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、絲氨酸 (Ser)、蘇氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸 (Phe)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)等的氨基酸序列。本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行適宜修飾，具體可以是經(jīng)過(guò)糖鏈修飾或熒光標(biāo)記、聚乙二醇(PEG)化或N末端的乙酰化或C末端的酰胺化等化學(xué)修飾的衍生物。其中，在將本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽用于后述的藥物組合物的情況下，該肽優(yōu)選不被修飾。另外，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽可以是線狀的也可以是環(huán)狀的。本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽可以通過(guò)與其他公知的細(xì)胞膜通透性肽并用來(lái)利用。另外，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽在具有細(xì)胞膜通透性的范圍內(nèi)，可以通過(guò)后述的方法以該肽與其他肽或蛋白質(zhì)融合而成的融合肽或融合蛋白質(zhì)的狀態(tài)來(lái)利用。本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽可以通過(guò)一般的化學(xué)合成法來(lái)制造。制造的方法包括通常的利用液相法和固相法的肽合成法。所述肽合成法更詳細(xì)地說(shuō)包括基于氨基酸序列信息將各氨基酸1個(gè)1個(gè)依次結(jié)合而使鏈延伸的逐步延伸法；預(yù)先合成包含數(shù)個(gè)氨基酸的片段，接著使各片段進(jìn)行連接反應(yīng)的片段縮合法。本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽可以通過(guò)任一種方法來(lái)合成。上述肽合成中所采用的縮合法也可以按照公知的各種方法來(lái)進(jìn)行。作為其具體例，可例示例如，疊氮化物法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化還原法、DPPA (疊氮磷酸二苯酯)法、DCC+添加劑(1-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基-5-降冰片烯-2，
73- 二甲酰亞胺等),Woodward法等。可以用于各方法的溶劑也可以從公知用于這種肽縮合反應(yīng)的一般溶劑中適宜選擇。作為其例子，可列舉例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜 (DMSO)、六甲基磷酰胺、二Wl烷、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯等或它們的混合溶劑等。上述肽合成反應(yīng)時(shí)，不參與反應(yīng)的氨基酸、肽中的羧基一般可以通過(guò)酯化而形成例如甲酯、乙酯、叔丁酯等低級(jí)烷基酯、例如芐基酯、對(duì)甲氧基芐基酯、對(duì)硝基芐基酯等芳烷基酯等進(jìn)行保護(hù)。另外，側(cè)鏈具有官能基的氨基酸、例如Tyr的羥基可以用乙?；?、芐基、芐基氧基羰基、叔丁基等進(jìn)行保護(hù)，但不是必須進(jìn)行該保護(hù)。另外，例如Arg的胍基可以通過(guò)硝基、甲苯磺?；?-甲氧基苯磺?；?、亞甲基-2-磺酰基、芐基氧基羰基、異冰片基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基等適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基進(jìn)行保護(hù)。具有上述保護(hù)基的氨基酸、肽和最終得到的本發(fā)明的肽中的這些保護(hù)基的脫保護(hù)反應(yīng)也可以按照慣用方法、例如接觸還原法、和/ 或使用液氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等的方法來(lái)實(shí)施。此外，本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽可以使用基因工程學(xué)方法通過(guò)常規(guī)方法來(lái)制備。 這樣得到的本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽可以按照通常的方法，例如通過(guò)離子交換樹脂法、分配色譜法、凝膠色譜法、親和色譜法、高速液相色譜法(HPLC)、反流分布法等肽化學(xué)領(lǐng)域通用的方法適宜對(duì)其進(jìn)行純化。此外，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽可以以編碼該肽的核酸的狀態(tài)使用。具體例如，包含編碼融合有本發(fā)明的肽的融合蛋白質(zhì)的重組核酸并能表達(dá)該肽的質(zhì)粒載體、病毒載體、 噬菌粒、轉(zhuǎn)座子等，但不限于此。另外該重組核酸優(yōu)選用于例如，本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽或融合有本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽的融合蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)，向從體內(nèi)取出的生物體來(lái)源的細(xì)胞導(dǎo)入編碼本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽的表達(dá)載體，向體內(nèi)施用本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽，使體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽或融合蛋白質(zhì)等。特別優(yōu)選作為在生物體外生產(chǎn)本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽或融合有本發(fā)明的細(xì)胞膜通過(guò)性肽的融合蛋白質(zhì)的方法使用。此外，所述重組核酸是指人工制成的DNA或RNA。該重組核酸包含使腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶等核酸結(jié)合而合成的，切下生物所含的DNA或RNA的一部分并除去部分堿基、再通過(guò)與其他堿基結(jié)合等修飾而制成的，以及將它們復(fù)制而得的。另外，本發(fā)明涉及含有細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)的藥物組合物、或通過(guò)并用本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)來(lái)進(jìn)行的向生物體內(nèi)施用親水性生理活性物質(zhì)的施用方法。本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽不僅該肽本身是細(xì)胞膜通透性的，而且能夠賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性，因此通過(guò)在以親水性生理活性物質(zhì)為有效成分的藥物組合物中配合本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽，或者并用親水性生理活性物質(zhì)和本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽來(lái)進(jìn)行施用，可以將親水性生理活性物質(zhì)經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜輸送到生物體內(nèi)。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽不僅優(yōu)選能夠通過(guò)粘膜細(xì)胞膜，而且能夠賦予親水性生理活性物質(zhì)以經(jīng)粘膜吸收性(優(yōu)選為腸道吸收性或鼻腔吸收性)，因此可以將親水性生理活性物質(zhì)經(jīng)過(guò)粘膜輸送到生物體內(nèi)。親水性生理活性物質(zhì)的經(jīng)粘膜吸收是指施用至粘膜的親水性生理活性物質(zhì)通過(guò)粘膜層而轉(zhuǎn)移到血液中，其結(jié)果可以通過(guò)親水性生理活性物質(zhì)的血中濃度的上升或藥理活性的表達(dá)來(lái)確認(rèn)。親水性生理活性物質(zhì)的血中濃度可以通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定法等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法來(lái)測(cè)定。關(guān)于藥理活性，例如，在酶的情況下可以以其酶活性為指標(biāo)來(lái)測(cè)定，在作用于細(xì)胞受體的物質(zhì)的情況下，可以以改變靶標(biāo)細(xì)胞的功能或標(biāo)記物質(zhì)的產(chǎn)生量的能力等為指標(biāo)來(lái)測(cè)定。例如，在胰島素的藥理活性的情況下，可以以施用的動(dòng)物的血中葡萄糖濃度為指標(biāo)來(lái)測(cè)定。作為能夠賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性、優(yōu)選為經(jīng)粘膜吸收性的細(xì)胞膜通透性肽，只要是上述本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽即可，不特別限定，具體可列舉包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽或者下述變構(gòu)肽，所述變構(gòu)肽是使序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸的1 7個(gè)、優(yōu)選為1 5個(gè)、更優(yōu)選為1 2個(gè)替換、缺失、插入或添加而得的， 并且是具有細(xì)胞膜通透性的肽。特別是作為賦予親水性生理活性物質(zhì)以鼻腔吸收性、優(yōu)選用于經(jīng)鼻施用的藥物組合物的本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽，可列舉包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽或者下述變構(gòu)肽，所述變構(gòu)肽是使序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸的1或2 個(gè)替換、缺失、插入或添加而得的，并且是具有細(xì)胞膜通透性的肽。表1顯示賦予親水性生理活性物質(zhì)以鼻腔吸收性的本發(fā)明的細(xì)胞膜通透性肽的具體例，該肽是使序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸的1或2個(gè)替換、缺失、插入或添加而得的變構(gòu)肽，并且具有細(xì)胞膜通透性。此外，在變構(gòu)肽中序列號(hào)1所示氨基酸序列的堿性氨基酸被替換成其他堿性氨基酸的情況下，由于替換成具有同一特性的肽不易造成肽整體特性變化，因此最可容許。表 權(quán)利要求
1.以下(A) (D)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽(A)包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽；(B)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽；(C)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽；(D)包含用㈧ (C)的任一項(xiàng)所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列，在用㈧的反向序列表示的氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，或者在用(A)的反向序列表示的氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了 1 5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述⑶的肽包含序列號(hào)2 4、9 10、13的任一者所示氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述(C)的肽包含序列號(hào)12、 15 30的任一者所示氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽，其中，所述(D)的肽包含序列號(hào)5或14所示氨基酸序列。
5.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。
6.一種用于經(jīng)口施用的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。
7.一種用于經(jīng)鼻施用的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽和親水性生理活性物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7的任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，親水性生理活性物質(zhì)是肽、 蛋白質(zhì)或核酸。
全文摘要
以下(A)～(D)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞膜通透性肽賦予親水性生理活性物質(zhì)以細(xì)胞膜通透性、以及粘膜吸收性。(A)包含序列號(hào)1所示氨基酸序列的肽。(B)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿性氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽。(C)包含在序列號(hào)1所示氨基酸序列中替換、缺失、插入或添加了1～5個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽。(D)包含用(A)～(C)的任一項(xiàng)所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列等氨基酸序列，且具有細(xì)胞膜通透性的肽。
文檔編號(hào)A61K38/28GK102428096SQ20108002180
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者井田伸夫, 森下真莉子, 西尾玲士, 高山幸三 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社