一種通過改善細胞通透性生產(chǎn)l(+)-酒石酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)-酒石酸的方法，包括如下步驟：（1）發(fā)酵培養(yǎng)表達順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組細胞；（2）使用曲拉通系列表面活性劑作為通透劑對所述重組細胞進行通透化處理；（3）利用通透化處理過的重組細胞來生產(chǎn)L(+)-酒石酸。本發(fā)明通過對重組細胞進行表面活性劑處理，使細胞通透性增加，轉化時間縮短12倍以上；通過進一步的固定化處理，增加了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的使用穩(wěn)定性和細胞利用率，固定化細胞可穩(wěn)定循環(huán)利用10批以上。
【專利說明】一種通過改善細胞通透性生產(chǎn)L ( + )-酒石酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種生產(chǎn)L(+)-酒石酸的方法。
【背景技術】
[0002] L (+)-酒石酸廣泛存在于自然界中，特別是葡萄和羅望子果中，被稱為"天然酒石 酸"，是重要的食品添加劑、醫(yī)藥拆分劑、印染防染劑、照相顯影劑、金屬離子屏蔽劑等。微生 物轉化法是目前L(+)_酒石酸生產(chǎn)的主要方法，即以含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物， 轉化底物順式環(huán)氧琥珀酸為L(+)_酒石酸。
[0003] 現(xiàn)有技術已經(jīng)構建了表達順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組細胞，但是直接用重組細 胞生產(chǎn)L(+)_酒石酸主要存在以下2個問題 ： (1)重組細胞的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶雖高效表達，但由于順式環(huán)氧琥珀酸水解酶屬 于胞內酶，與底物接觸的機會受制于細胞膜的通透性，導致其催化性能低。
[0004] (2)重組細胞只能使用一次，利用率低下，成本高，污染大。
[0005] 表面活性劑，是指具有固定的親水親油基團，在溶液的表面能定向排列，并能使表 面張力顯著下降的物質。它是一大類有機化合物，它們的性質極具特色，應用極為靈活、廣 泛，有很大的實用價值和理論意義。
[0006] 固定化微生物細胞是20世紀60年代酶學領域崛起的新技術，利用化學或物理的 手段將游離細胞定位于限定的空間區(qū)域，以利于細胞內的一種酶或多種酶進行生物催化， 并保持細胞活性，可反復使用的一種技術。與傳統(tǒng)游離細胞相比，固定化細胞具有單位體 積的菌體密度高、菌體易回收等優(yōu)點。目前國內外還沒有關于先使用表面活性劑對重組細 胞進行通透化處理，進而利用處理后的重組細胞進行L(+)_酒石酸生產(chǎn)的報道，因此利用 表面活性劑改善細胞通透性，結合固定化技術提高細胞使用率，對L(+)_酒石酸的生產(chǎn)具 有重要意義。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種新的改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，以克服 現(xiàn)有技術的全部或部分缺陷。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是：本發(fā)明通過改善細胞通透性生產(chǎn) L (+)_酒石酸的方法包括如下步驟：（1)發(fā)酵培養(yǎng)表達順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組細胞； (2)使用曲拉通系列表面活性劑作為通透劑對所述重組細胞進行通透化處理；（3)利用通 透化處理過的重組細胞來生產(chǎn)L(+)_酒石酸。
[0009] 進一步地，本發(fā)明在利用通透化處理過的重組細胞生產(chǎn)L(+)_酒石酸之前，先將 該通透化處理過的重組細胞使用κ-卡拉膠固定化。
[0010] 進一步地，本發(fā)明將通透化處理過的重組細胞使用κ -卡拉膠固定化的方法如 下： 將通透化處理過的重組細胞懸液加入κ -卡拉膠溶液中混勻，冷卻凝固后用氯化鉀溶 液浸泡固定，其中，K -卡拉膠的終濃度為20-60g/l，通透化處理過的重組細胞的終濃度為 10-50g/l。
[0011] 進一步地，本發(fā)明所述κ -卡拉膠的終濃度為30-50g/l，通透化處理過的重組細 胞的終濃度為20-30g/l。
[0012] 進一步地，本發(fā)明在所述步驟（2)中，對所述重組細胞進行通透化處理的方法為： 將步驟（1)所培養(yǎng)的重組細胞用含有曲拉通系列表面活性劑的生理鹽水懸浮，所述表面活 性劑的作用濃度為0.01 - 50 g/L;然后靜置或慢速攪拌懸浮液10 min - 24 h。
[0013] 進一步地，本發(fā)明所述表面活性劑的作用濃度為0.1 - 10 g/L，靜置或慢速攪拌 懸浮液30 min - 5 h。
[0014] 進一步地，本發(fā)明所述表面活性劑為非離子表面活性劑。
[0015] 進一步地，本發(fā)明所述非離子表面活性劑為以下的任意一種：失水山梨醇脂肪酸 醋系列表面活性劑(司盤系列，商品名Span)、聚山梨醋系列表面活性劑（吐溫系列，商品名 Tween)、聚乙二醇對異辛基苯基醚系列表面活性劑（曲拉通系列，商品名Triton)、烷基酚聚 氧乙烯醚系列表面活性劑(商品名0P)、月桂醇聚氧乙烯醚系列表面活性劑(商品名ΑΕ0)。
[0016] 進一步地，本發(fā)明所述非離子表面活性劑優(yōu)選為聚乙二醇對異辛基苯基醚系列表 面活性劑。
[0017] 進一步地，本發(fā)明所述非離子表面活性劑為曲拉通X-100。
[0018] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明所取得的有益效果在于： 1.本發(fā)明利用經(jīng)表面活性劑處理的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶重組細胞生產(chǎn)L(+)_酒石 酸，與未經(jīng)表面活性劑處理的重組細胞相比，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶重組細胞的轉化時間 最高縮短了 12倍以上。
[0019] 2.本發(fā)明可進一步利用固定化技術提高該重組細胞的穩(wěn)定性和利用率，固定化重 組細胞使用10批后的底物轉化率還有82%，而重組細胞使用3批后的底物轉化率為0%?？?見，在利用重組細胞制備酒石酸時，使用固定化重組細胞的轉化批次遠高于使用非固定化 重組細胞的轉化批次。
[0020] 3.本發(fā)明填補了國內外關于利用表面活性劑和固定化重組細胞生產(chǎn)L(+)_酒石 酸的技術空白。
[0021] 生物材料樣品的保藏信息 保藏的生物材料樣品：紅球菌 USA-AN012 ΒΚ-980?〇?/ο^οα?·5 SP.USA-AN012 BK-98); 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱：CGMCC); 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所（郵編： 100101)； 保藏日期：2006年7月13日； 保藏登記號：CGMCC No. 1756 注：該紅球菌 USA-AN012 BK-98 sp. USA-AN012 BK-98)已在 2010 年 1月27日授權公告的專利號為ZL200710002155. 9的中國專利說明書中記載。
【具體實施方式】
[0022] 以下以具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。
[0023] 本發(fā)明所涉及的順式環(huán)氧琥珀酸鹽為順式環(huán)氧琥珀酸與各種陽離子形成的鹽，陽 離子包括但不僅限于銨離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子和鈣離子等。
[0024] 在本發(fā)明的以下實施例中，有關的檢測方法如下： (1)重組細胞轉化時間的檢測方法：0.1 g經(jīng)4 °C高速離心（5000Xg，10 min)收獲 的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反 應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，所需的 時間定義為重組細胞的轉化時間（單位用h表示)。
[0025] (2)固定化重組細胞轉化時間的檢測方法：取由0. 1 g經(jīng)4 °C高速離心 (5000Xg，10 min)收獲的重組細胞制備而成的固定化重組細胞（3*3*3 mm3凝膠方塊)，用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，所需的時間定義為固 定化重組細胞的轉化時間（單位用h表示)。
[0026] (3)酒石酸含量的檢測方法：取2. 5 ml 10 g/L的偏釩酸銨于25 ml的容量瓶中， 依次加入一定體積的酒石酸標準品溶液、1 ml 1 mol/L硫酸溶液，振搖顯色，并用蒸餾水定 容至刻度，測定顯色液在480 nm處的吸光度值，以酒石酸加入量對顯色液480 nm處的吸光 度值作線性回歸圖，即得標準曲線。依上述步驟，以一定體積的樣品溶液替代一定體積的酒 石酸標準品溶液，即可得樣品顯色液在480 nm處的吸光度值，根據(jù)前述標準曲線，即可計算 得到樣品溶液中酒石酸的含量。
[0027] (4)固定化重組細胞機械強度測定方法：將固定化重組細胞凝膠切制成10*10*10 mm3的立方體，置于天平上，用適當重量的砝碼對其正面逐漸均勻加壓直至壓扁不再彈回或 破裂時，用破裂時天平上的數(shù)值表征固定化重組細胞的平均機械強度，單位用g/cm 2表示。
[0028] (5)對映體過量值的測定方法：0. 1 g重組細胞或由0. 1 g重組細胞制備而成 的固定化重組細胞，用50 ml 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩 反應。用蒸餾水將反應液稀釋400倍后，用高壓液相色譜（Agilent 1200)檢測，并計算 L(+)-酒石酸的對映體過量值，其具體檢測條件為：手性柱Astec CLC(150X4. 6mm);進樣 量 20 μ 1 ;柱溫 30°C ;流動相 3mM CuS04(pH 3· 2);流速 lml/min ;檢測波長 254nm。
[0029] 實施例1 : 將紅球菌USA-AN012 BK-98接種至種子培養(yǎng)基（1%葡萄糖，0. 5%蛋白胨，0. 5%牛肉膏， 1%氯化鈉，PH7. 5)中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h。用EZ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒（購于 Bio Basic Inc.公司），按照產(chǎn)品說明書提取紅球菌USA-AN012 BK-98的基因組DNA。設計 兩條引物（即引物1和引物2)，引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，引物2的核苷酸 序列如SEQIDN0:2所示。以提取的紅球菌USA-AN012BK-98的基因組DNA為模板，利用 引物1和引物2，PCR擴增獲得紅球菌USA-AN012 BK-98順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的基因。其 PCR 反應體系為：雙蒸水 40 μΙ,ΙΟΧΡΟ? buffer 5 μ1，10 mmol/L dNTPs 1 μ1，1 μ? 的 10 mm〇l/L 引物 1，1 μ? 的 10 mmol/L 引物 2,紅球菌 USA-AN012 BK-98 基因組 DNA 1 μ?，Taq 酶1 μ?，共50 μ?的反應體系。其PCR程序為：94 °C預熱5 min后，94 °C 50 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30個循環(huán)，最后72 °C延伸10 min。將該PCR片段和pTrc99A載體(購于 Amersham Biosciences公司）分別用限制性內切酶Afco I和ife? HI于37°C酶切10 h。跑 瓊脂糖凝膠電泳，用Wizard PCR片段回收試劑盒（購于Promega公司）回收純化兩個目的 片段后，用T4 DNA連接酶于16°C連接4 h，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(購 于北京鼎國生物技術有限責任公司，其基因型為recAl，endAl，gyrA96，thi - 1，hsdR17， supE44，relAl，Δ (lac -proAB)/F' [1:四036，卩1'0六13+，1&。19，1&。2八]/[15])，涂布于含 5〇 Kg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上（1%蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1%氯化鈉，1. 5%瓊脂粉， PH7. 0)，通過菌落PCR (其PCR反應體系中的模板為?μ?菌液，其余PCR反應體系和程序與 上述相同)篩選陽性克隆，得到紅球菌USA-AN012 ΒΚ-98順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的基因工程 菌。
[0030] 將上述得到的紅球菌USA-AN012 ΒΚ-98順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的基因工程菌 接種至含SOyg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中（1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯 化鈉，PH7. 0)，當菌體濃度（0D6QQ)達到0. 4-0. 6時，加入終濃度為0. 2mM的異丙基硫 代-β-D-半乳糖苷，37°C振蕩培養(yǎng)12h。4°C，5000Xg離心lOmin收集菌體，獲得順式環(huán) 氧琥珀酸水解酶重組細胞。
[0031] 將0. 1 g上述重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8. 0)懸 浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成 酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時間為22. 4 h。
[0032] 實施例2 : 按實施例1的方法制備順式環(huán)氧琥珀酸水解酶重組細胞。取lg該重組細胞，用10 ml 含作用濃度為5 g/L表面活性劑TritonX-100的生理鹽水懸浮后，靜置或慢速攪拌懸浮液 30 min，取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥 珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順 式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時間為2. 1 h。
[0033] 實施例3 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組 細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān) 測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時， 重組細胞所需的轉化時間為11. 5 h。
[0034] 實施例4 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組 細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān) 測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時， 重組細胞所需的轉化時間為5.3 h。
[0035] 實施例5 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細 胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測 反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重 組細胞所需的轉化時間為2.5 h。
[0036] 實施例6 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細 胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測 反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重 組細胞所需的轉化時間為2.3 h。
[0037] 實施例7 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞 用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反 應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組 細胞所需的轉化時間為2.2 h。
[0038] 實施例8 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為3 h。
[0039] 實施例9 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞，其中表 面活性劑的作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細 胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測 反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重 組細胞所需的轉化時間為6.5 h。
[0040] 實施例10 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞 用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反 應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組 細胞所需的轉化時間為18.9 h。
[0041] 實施例11 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞 用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反 應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組 細胞所需的轉化時間為7.3 h。
[0042] 實施例12 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為4.6 h。
[0043] 實施例13 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為3.2 h。
[0044] 實施例14 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為3. 1 h。
[0045] 實施例15 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為3.2 h。
[0046] 實施例16 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為4.6 h。
[0047] 實施例17 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TritonX-45處理實施例1獲得的重組細胞，表面活 性劑的作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為13. 1 h。
[0048] 實施例I8 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為21.9 h。
[0049] 實施例19 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為17.6 h。
[0050] 實施例20 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為〇. 1 g/L，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為14. 5 h。
[0051] 實施例21: 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為〇. 5 g/L，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為11.6 h。
[0052] 實施例22 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為11 h。
[0053] 實施例23 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為8.6 h。
[0054] 實施例24 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為9. 2 h。
[0055] 實施例25 : 按實施例2的方法，用表面活性劑Span80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為16. 9 h。
[0056] 實施例26 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為20. 6 h。
[0057] 實施例27 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為19. 6 h。
[0058] 實施例28 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為17. 7 h。
[0059] 實施例29 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為16. 7 h。
[0060] 實施例3〇 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 化時間為16. 6 h。
[0061] 實施例31: 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為14. 6 h。
[0062] 實施例32 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為16. 6 h。
[0063] 實施例33 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen20處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為22. 6 h。
[0064] 實施例34 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為20. 5 h。
[0065] 實施例35 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為17.9 h。
[0066] 實施例36 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為16. 2 h。
[0067] 實施例37 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中 酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所 需的轉化時間為15. 5 h。
[0068] 實施例38 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為15. 3 h。
[0069] 實施例39 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為14. 1 h。
[0070] 實施例40 : 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為15. 5 h。
[0071] 實施例41: 按實施例2的方法，用表面活性劑TWeen80處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑 的作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為23. 7 h。
[0072] 實施例42 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為20. 7 h。
[0073] 實施例43 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為19. 9 h。
[0074] 實施例44 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為15. 5 h。
[0075] 實施例45 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為14. 5 h。
[0076] 實施例46 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃 度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸 的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉 化時間為14. 2 h。
[0077] 實施例47 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃 度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸 的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉 化時間為15 h。
[0078] 實施例48 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為16 h。
[0079] 實施例49 : 按實施例2的方法，用表面活性劑0P-10處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為21. 5 h。
[0080] 實施例5〇 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.01 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為21. 9 h。
[0081] 實施例51: 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.05 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為14. 4 h。
[0082] 實施例52 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為12. 3 h。
[0083] 實施例53 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為0.5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為10 h。
[0084] 實施例δ4 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為1 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃 度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸 的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉 化時間為7. 3 h。
[0085] 實施例55 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為5 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃 度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸 的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉 化時間為6. 7 h。
[0086] 實施例56 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為10 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為10. 4 h。
[0087] 實施例57 : 按實施例2的方法，用表面活性劑AE0-9處理實施例1獲得的重組細胞，表面活性劑的 作用濃度為50 g/L，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml 濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石 酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的 轉化時間為14. 6 h。
[0088] 實施例58 : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑TritonX-100處理實施例1獲得的重組細胞， 其中靜置或慢速攪拌懸浮液時間為10 min，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理 后的重組細胞用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩 反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達 90%時，重組細胞所需的轉化時間為2. 9 h。
[0089] 實施例59 : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理實施例1獲得的重組細胞，其中靜置或慢 速攪拌懸浮液時間為1 h，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為1.8 h。
[0090] 實施例60 : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理實施例1獲得的重組細胞，其中靜置或慢 速攪拌懸浮液時間為5 h，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用 50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液 中酒石酸的含量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞 所需的轉化時間為2. 1 h。
[0091] 實施例61: 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理重組細胞，其中靜置或慢速攪拌懸浮液 時間為10 h，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含 量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時 間為2. 1 h。
[0092] 實施例62 : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理重組細胞，其中靜置或慢速攪拌懸浮液 時間為15 h，其余條件不變。取0. 1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含 量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時 間為2. 3 h。
[0093] 實施例63 : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理重組細胞，其中靜置或慢速攪拌懸浮液 時間為20 h，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含 量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時 間為2. 4 h。
[0094] 實施例Μ : 按實施例2的方法，用同樣的表面活性劑處理重組細胞，其中靜置或慢速攪拌懸浮液 時間為24 h，其余條件不變。取0.1 g上述表面活性劑處理后的重組細胞用50 ml濃度為 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含 量。結果顯示，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，重組細胞所需的轉化時 間為2. 4 h。
[0095] 實施例65 : 將1 g實施例1獲得的重組細胞，用10 ml生理鹽水后，靜置或慢速攪拌懸浮液1 h， 然后加入到30 ml 54 g/LK-卡拉膠溶液中，于42 °C的條件下混合均勻，4 °C的條件下 冷卻，凝固后用0.3 mol/L氯化鉀溶液于4 °C的條件下固定10 h。取部分凝膠，將凝膠切 成3*3*3 mm3的小塊，依次分別用蒸餾水和生理鹽水洗滌，得到固定化重組細胞。上述制備 的固定化重組細胞中，κ-卡拉膠的終濃度為40 g/L，重組細胞的終濃度為25 g/L。取上 述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式 環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯 示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需 的轉化時間為21. 1 h，固定化重組細胞的機械強度為1561 g/cm2。
[0096] 實施例冊： 將1 g實施例1獲得的重組細胞，用10 ml含作用濃度為5 g/L TritonX-100的生理 鹽水懸浮后，靜置或慢速攪拌懸浮液1 h，然后加入到30 ml 54 g/LK-卡拉膠溶液中，于 42 °C的條件下混合均勻，4 °C的條件下冷卻，凝固后用0.3 mol/L氯化鉀溶液于4 °C的 條件下固定10 h。取部分凝膠，將凝膠切成3*3*3 mm3的小塊，依次分別用蒸餾水和生理鹽 水洗滌，得到固定化重組細胞。上述制備的固定化重組細胞中，κ-卡拉膠的終濃度為40 g/L,重組細胞的終濃度為25 g/L。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應， 監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉 化率達90%時，本實施例中的固定化重組細胞所需的轉化時間為1. 7 h，較實施例65中未 用表面活性劑處理的對照組的轉化時間縮短12倍，固定化重組細胞的機械強度為1564 g/ cm2。
[0097] 實施例67 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞的加入量為0. 4 g，重組細胞 的終濃度為10 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細 胞O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反 應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸 的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 5 h，固定化重組細胞的機械強度 為 1703 g/cm2。
[0098] 實施例68 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞加入量為0. 6 g，重組細胞的 終濃度為15 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應， 監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化 率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 2 h，固定化重組細胞的機械強度為1668 g/cm2。
[0099] 實施例69 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞加入量為0. 8 g，重組細胞的 終濃度為20 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 0. lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8. 0)懸浮后，30 °C下振蕩反應， 監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化 率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為1. 8 h，固定化重組細胞的機械強度為1609 g/cm2。
[0100] 實施例70 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞加入量為1. 2 g，重組細胞的 終濃度為30 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān) 測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化 率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為1. 8 h，固定化重組細胞的機械強度為1518 g/cm2。
[0101] 實施例71: 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞加入量為1. 6 g，重組細胞的 終濃度為40 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān) 測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化 率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 1 h，固定化重組細胞的機械強度為1485 g/cm2。
[0102] 實施例72 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中重組細胞加入量為2 g，重組細胞的終 濃度為50 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含固定化之前的重組細胞 O.lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮后，30 °C下振蕩反應，監(jiān) 測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥珀酸鈉生成酒石酸的轉化 率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 4 h，固定化重組細胞的機械強度為1427 g/cm2。
[0103] 實施例73 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中加入的30 ml κ -卡拉膠溶液的濃度為 26. 7 g/L，κ-卡拉膠的終濃度為20 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含 固定化之前的重組細胞〇. lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮 后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥 珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 5 h，固定化重 組細胞的機械強度為1048 g/cm2。
[0104] 實施例74 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中加入的30 ml κ -卡拉膠溶液的濃度為 40 g/L，κ-卡拉膠的終濃度為30 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含 固定化之前的重組細胞〇. lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮 后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥 珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 2 h，固定化重 組細胞的機械強度為1369 g/cm2。
[0105] 實施例75 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中加入的30 ml κ -卡拉膠溶液的濃度為 66. 7 g/L，κ-卡拉膠的終濃度為50 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含 固定化之前的重組細胞〇. lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮 后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥 珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 3 h，固定化重 組細胞的機械強度為1789 g/cm2。
[0106] 實施例76 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中加入的30 ml κ -卡拉膠溶液的濃度為 80 g/L，κ-卡拉膠的終濃度為60 g/L，其余條件不變。取上述固定化重組細胞(其中，含 固定化之前的重組細胞〇. lg)，用50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)懸浮 后，30 °C下振蕩反應，監(jiān)測反應液中酒石酸的含量。結果顯示，本實施例中，當順式環(huán)氧琥 珀酸鈉生成酒石酸的轉化率達90%時，固定化重組細胞所需的轉化時間為2. 5 h，固定化重 組細胞的機械強度為2037 g/cm2。
[0107] 實施例77 : 用〇. 1 g實施例1獲得的重組細胞于50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8. 0)中，30 °C恒溫條件下，慢速攪拌轉化22. 4 h，轉化率達90%，L(+)-酒石酸對映體過 量值為99. 9%。4 °C高速離心（5000Xg，10 min)回收重組細胞，將其重新投入50 ml 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)中，30 °C下振蕩反應，重組細胞轉化22.4 h后，轉化率 為25%，L(+)_酒石酸對映體過量值為99. 7%。繼續(xù)重復以上步驟(過濾回收重組細胞，于上 述條件下轉化22. 4 h)，在重組細胞重復使用了 3次后，轉化率基本為0%。
[0108] 實施例78 : 取〇. 1 g實施例1獲得的重組細胞，用1 ml含5 g/L TritonX-100的生理鹽水懸浮后， 靜置或慢速攪拌懸浮液1 h，加入50 ml濃度為1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)中，30 ° C恒溫條件下，慢速攪拌轉化1. 8 h，轉化率達90%，L (+)-酒石酸對映體過量值為99. 9%。 4 °C高速離心（5000Xg，10 min)回收細胞，將其重新投入50 ml 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀 酸鈉 （pH 8.0)中，30 °C下振蕩反應，重組細胞轉化1.8 h后，轉化率為24%，L(+)_酒石酸 對映體過量值為99. 7%。繼續(xù)重復以上步驟(過濾回收細胞，于上述條件下轉化1.8 h)，在 表面活性劑處理后的重組細胞重復使用了 3次后，轉化率基本為0%。以上結果顯示，本實施 例中用表面活性劑TritonX-100處理后的重組細胞的轉化時間較實施例77中未處理的對 照組縮短12倍以上，但無論是否用表面活性劑處理的重組細胞，都無法循環(huán)多次使用。
[0109] 實施例79 : 按實施例66的方法制備固定化重組細胞，其中，固定化之前重組細胞的用量為0. 1 g， 將固定化重組細胞加入到pH為8. 0、濃度為1 mol/L的50 ml順式環(huán)氧琥珀酸鈉中，30 °C 恒溫條件下，慢速攪拌轉化1. 7 h，轉化率達90%，L (+)-酒石酸對映體過量值為99. 9%。過濾 回收固定化重組細胞，將其重新投入50 ml 1 mol/L順式環(huán)氧琥珀酸鈉 （pH 8.0)中，30 °C 下振蕩反應，重組細胞轉化1. 7 h后，轉化率為90. 5%，L (+)-酒石酸對映體過量值為99. 8%。 繼續(xù)重復以上步驟(過濾回收固定化重組細胞，于上述條件下轉化1. 7 h) 8次后，即在固定 化重組細胞重復使用了 10次后，轉化率為82%，L (+)-酒石酸對映體過量值為99. 6%。本實 施例中，固定化重組細胞使用10批后的底物轉化率還有82% ;而在實施例77和78中，重組 細胞使用3批后的底物轉化率為0%。可見，在利用重組細胞制備酒石酸時，使用固定化重組 細胞的轉化批次遠高于使用非固定化重組細胞的轉化批次。
[0110] 以上實施例所用的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因工程菌，其中，pTrc99A為表達載 體，萬.cWi JM109為宿主細胞。本發(fā)明還可采用其它表達載體，例如pET15b、pET22b、 pET28a、pET39b、pPκ。EXHTb或pGEX-4T-2等；宿主細胞還可以使用凡co/iDH5α、凡co7i BL21(DE3)、凡coB TG1或萬.coB ToplO等。將構建的這些順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因 工程菌進行上述表面活性劑和固定化處理，與未做上述表面活性劑和固定化處理的重組細 胞相比，其轉化時間和批次轉化結果與以上實施例基本一致。
【權利要求】
1. 一種通過改善細胞通透性生產(chǎn)L (+)-酒石酸的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1)發(fā)酵培養(yǎng)表達順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組細胞；（2)使用曲拉通系列表面活性劑 作為通透劑對所述重組細胞進行通透化處理；（3)利用通透化處理過的重組細胞來生產(chǎn) L(+)_酒石酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特征在于： 在利用通透化處理過的重組細胞生產(chǎn)L (+)-酒石酸之前，先將該通透化處理過的重組細胞 使用κ-卡拉膠固定化。
3. 根據(jù)權利要求2所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特征在 于，將通透化處理過的重組細胞使用κ-卡拉膠固定化的方法如下： 將通透化處理過的重組細胞懸液加入κ -卡拉膠溶液中混勻，冷卻凝固后用氯化鉀溶 液浸泡固定，其中，κ -卡拉膠的終濃度為20-60g/l，通透化處理過的重組細胞的終濃度為 10-50g/l。
4. 根據(jù)權利要求3所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特征在 于：所述κ -卡拉膠的終濃度為30-50g/l，通透化處理過的重組細胞的終濃度為20-30g/l。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特 征在于，在所述步驟（2)中，對所述重組細胞進行通透化處理的方法為：將步驟（1)所培養(yǎng) 的重組細胞用含有曲拉通系列表面活性劑的生理鹽水懸浮，所述表面活性劑的作用濃度為 0. 01 - 50 g/L ;然后靜置或慢速攪拌懸浮液10 min - 24 h。
6. 根據(jù)權利要求5所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L (+)-酒石酸的方法，其特征在 于：所述表面活性劑的作用濃度為0.1 - 10 g/L，靜置或慢速攪拌懸浮液30 min - 5 h。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L (+)-酒石酸的方法，其特征 在于：所述表面活性劑為非離子表面活性劑。
8. 根據(jù)權利要求7所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特征在 于，所述非離子表面活性劑為失水山梨醇脂肪酸酯系列表面活性劑、聚山梨酯系列表面活 性劑、聚乙二醇對異辛基苯基醚系列表面活性劑、烷基酚聚氧乙烯醚系列表面活性劑或月 桂醇聚氧乙烯醚系列表面活性劑。
9. 根據(jù)權利要求8所述的通過改善細胞通透性生產(chǎn)L(+)_酒石酸的方法，其特征在 于：所述非離子表面活性劑為曲拉通X-100。
【文檔編號】C12R1/01GK104140984SQ201410379113
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月4日 優(yōu)先權日:2014年8月4日
【發(fā)明者】張建國, 潘海峰, 謝志鵬, 鮑文娜 申請人:杭州寶晶生物股份有限公司