專利名稱：艱難梭菌毒素的抗體的制作方法
艱難梭菌毒素的抗體本發(fā)明涉及羊抗體及其在預(yù)防或治療艱難梭菌(Clostridium difficile)感染 (⑶I)中的用途。艱難梭菌感染(⑶I)目前是世界范圍內(nèi)醫(yī)院的主要問題。該細菌引起醫(yī)院的抗生素相關(guān)疾病，這種疾病自身表現(xiàn)為從輕度自身限制性腹瀉至可能威脅生命的嚴重結(jié)腸炎的幾種形式。中老年患者大部分具有這些可能威脅生命的疾病的風險并且⑶I的發(fā)病率在過去10年內(nèi)急劇增加。在2007年，英國有50，000多例CDI，其中8，000多例伴隨著死亡。 ⑶I每年度花費英國國民衛(wèi)生服務(wù)(MB)超過5億英鎊。各種艱難梭菌菌株可以通過大量方法來分類。最常用的方法之一是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)核糖核酸分型(ribotyping)，其中使用PCR來擴增艱難梭菌的16S-23S rRNA基因間間隔區(qū)。來自這種方法的反應(yīng)產(chǎn)物提供了鑒定分離株細菌核糖核酸型的特征帶型。毒素分型(toxinotyping)是另一分型方法，其中使用源自編碼艱難梭菌毒素的DNA的限制模式來鑒定菌株的毒素型。在不同菌株的毒素基因之間觀察到的限制模式的差異還表示艱難梭菌毒素家族內(nèi)的序列變異。毒素B顯示了一些區(qū)域內(nèi)的序列變異。例如，毒素型0毒素 B的C末端60kDa區(qū)域與毒素型III的相同區(qū)域相比具有大約13%的序列差異。盡管這種序列差異相對較小，但它們對于分子的抗原特性可能極為重要并且可能對抗體結(jié)合具有深遠影響并因此對抗體的毒素中和特性具有深遠影響。艱難梭菌菌株產(chǎn)生多種毒力因子，其中值得注意的是幾種蛋白毒素毒素A、毒素 B以及在某些菌株中的二元毒素，該二元毒素與產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)
ι毒素類似。毒素A是大的蛋白細胞毒素/腸毒素，它在感染的病理中起作用并且可能影響腸定殖過程。已經(jīng)報道了毒素A陰性/毒素B陽性菌株的⑶I發(fā)作，這表明毒素B也能夠在疾病病理中起重要作用。毒素A和毒素B二者都是經(jīng)由包括下列的多步機制來實現(xiàn)它們的作用機制的結(jié)合細胞表面的受體，內(nèi)化，隨后易位并釋放效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進入細胞胞質(zhì)溶膠以及最終的胞內(nèi)作用。對于毒素A和毒素B 二者，這牽涉了 Iih0家族的小GTP酶的滅活。對于這種滅活，每種毒素催化葡萄糖部分(來自UDP-葡萄糖)轉(zhuǎn)移至Mio蛋白的氨基殘基。毒素A和毒素B 二者還都含有半胱氨酸蛋白酶形式的第二種酶活性，該第二種酶活性似乎在易位后效應(yīng)結(jié)構(gòu)域釋放到胞質(zhì)溶膠中起重要作用。艱難梭菌二元毒素通過牽涉將 ADP-核糖部分由NAD轉(zhuǎn)移至其靶蛋白的機制修飾細胞肌動蛋白而以不同的方式起作用。艱難梭菌感染的治療目前依賴于抗生素，其中甲硝唑和萬古霉素構(gòu)成了選擇的治療。然而，這些抗生素不是在所有情況下都有效，并且20-30%的患者會遭受疾病復(fù)發(fā)。最受關(guān)注的是在英國出現(xiàn)了毒力更強的菌株，該菌株在2002年首次在加拿大被鑒定。這些菌株屬于PCR核糖核酸型027，毒素型III，它們會引起具有比之前觀察到的CDI高3倍的直接歸因死亡率的⑶I。因此現(xiàn)在尤其急迫地需要新的治療，因為目前的抗生素功效似乎在降低。因此，本領(lǐng)域內(nèi)存在對能夠特別地解決艱難梭菌感染(⑶I)的新療法/治療的需要。這種需要被本發(fā)明解決了，本發(fā)明解決了上述問題的一個或多個。更詳細地，本發(fā)明的第一方面提供了用于預(yù)防或治療CDI的羊抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了包含用于預(yù)防或治療CDI的羊抗體的抗體組合物。在一個實施方案中，所述羊抗體是多克隆抗體。使用時，本發(fā)明的抗體結(jié)合艱難梭菌毒素或其片段，優(yōu)選中和毒素或其片段的生物活性。因此，本發(fā)明的抗體能夠預(yù)防或治療CDI并優(yōu)選還預(yù)防患者復(fù)發(fā)。本發(fā)明的抗體提供了相對于其他治療的明顯優(yōu)勢，因為它們能夠抑制艱難梭菌一種或多種毒素的生物活性，同時對患者具有低的免疫原性作用。此外，本發(fā)明的抗體可以高效價地產(chǎn)生。因此，羊抗體可以容易地獲得并且可以保護和/或患者免于艱難梭菌產(chǎn)生的病理作用而具有最小的副作用。本發(fā)明的抗體還可以用于開發(fā)針對CDI的被動免疫的疫
田ο本發(fā)明的首要目標是艱難梭菌毒素或其片段。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合和/或中和的合適的艱難梭菌毒素包括引起CDI或其癥狀或與CDI或其癥狀相關(guān)的任何艱難梭菌毒素。在又一實施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合和/或中和選自下列的至少一種類型的艱難梭菌毒素艱難梭菌毒素A或其片段、艱難梭菌毒素B或其片段、以及艱難梭菌二元毒素或其片段。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A(或其片段)的羊抗體。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B(或其片段)的羊抗體。在又一實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗體。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)和艱難梭菌毒素B(或其片段)的羊抗體。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A(或其片段)和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗體。在又一實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗體。本發(fā)明的抗體組合物還可以包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A(或其片段)、艱難梭菌毒素B (或其片段)和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的羊抗體。在一個實施方案中，抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段) 的第一抗體，以及選自結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)的抗體或結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的抗體的第二抗體。在此實施方案中，所述第二抗體可以結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)，并且所述組合物任選包括結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的第三抗體。在另一實施方案中，抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段) 的第一抗體，以及選自結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)的抗體或結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的抗體的第二抗體。在此實施方案中，所述第二抗體可以結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)，并且所述組合物任選包括結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的第三抗體。在另一實施方案中，抗體組合物包含結(jié)合和/或中和艱難梭菌二元毒素(或其片段)的第一抗體，以及選自結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)的抗體或結(jié)合和/ 或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)的抗體的第二抗體。在此實施方案中，所述第二抗體可以結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)，并且所述組合物任選包括結(jié)合和/或中和
4艱難梭菌毒素B(或其片段)的第三抗體。可選擇地，所述第二抗體可以結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)，并且所述組合物任選包括結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A (或其片段)的第三抗體。本發(fā)明的抗體可以(特異性地)結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素A(或其片段)或艱難梭菌毒素B (或其片段)或艱難梭菌二元毒素(或其片段)中的一種?？蛇x擇地，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合艱難梭菌毒素A(或其片段)或艱難梭菌毒素B (或其片段)或艱難梭菌二元毒素(或其片段)中的兩種或更多種。當抗體結(jié)合和/或中和兩種或更多種毒素類型時，所述抗體優(yōu)選結(jié)合和/或中和艱難梭菌毒素B (或其片段)加上艱難梭菌毒素A (或其片段)和/或艱難梭菌二元毒素(或其片段)中的一種或兩種。本發(fā)明的抗體與毒素的特定表位相互作用。例如，抗體可以結(jié)合艱難梭菌毒素 A的N末端結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸1-957之間)或中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸 958-1831之間)或C末端重復(fù)結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸1832-2710之間)中的表位。例如，抗體可以結(jié)合艱難梭菌毒素A的氨基酸1832-2710中的表位。類似地，抗體可以結(jié)合毒素B的N末端結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸1-955之間)或中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸 956-1831之間)或C末端重復(fù)結(jié)構(gòu)域(例如，在氨基酸1832-2366之間)中的表位。例如， 抗體可以結(jié)合毒素B的氨基酸1832-2366中的表位。在二元毒素的情況下，抗體可以結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域(片段A)或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殘基位于片段B的C末端部分 (大約殘基400-870)；和/或結(jié)合片段B的N末端半側(cè)(大約殘基1-400)，其參與片段A的結(jié)合和向細胞中的易位。在一個實施方案中，艱難梭菌毒素選自毒素型0至XV中的一種。優(yōu)選的毒素型 (加上示例的核糖核酸型和菌株)列在下面的表1中。所列的毒素型純粹是示例，并不旨在限制本發(fā)明。表1
毒素型示例的核糖核酸型示例的菌林參考文獻0001、 106VPIl 0463I003、 012、 102EX623II103AC008III027、 034、 075、 080R20291、QCD-32g58Rupnik 等人(1998) J. Clinical Microbiol. 36:2240-2247IV023、 034、 075、 08055767V066、 078SE881VI045、 063、 06651377VII06357267VIII017、 0471470IX01951680X0368864XI033IS58、Rl 1402XII056IS25Rupnik 等人(2001)XIII070R9367MicrobiologyXIV111R10870147:439-447XV122R9385 本發(fā)明的不同抗體可以結(jié)合和/或中和相同或不同菌株的艱難梭菌毒素。例如，抗體可以結(jié)合和/或中和下列的一種或多種艱難梭菌毒素A-毒素型0 ；艱難梭菌毒素 B-毒素型0 ；艱難梭菌毒素A-毒素型III ；艱難梭菌毒素B-毒素型III ；艱難梭菌毒素A-毒素型V ；和/或艱難梭菌毒素B-毒素型V。優(yōu)選地，采用結(jié)合和/或中和來自所有這些毒素型的毒素A和B的抗體的混合物。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合所述菌株的艱難梭菌毒素A和/ 或艱難梭菌毒素B的N末端結(jié)構(gòu)域、中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域、和/或C末端重復(fù)結(jié)構(gòu)域中的表位。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合和/或中和至少一種如下的艱難梭菌毒素所述艱難梭菌毒素包含與SEQ ID NO :1-6至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多相同的氨基酸序列或其片段。本發(fā)明還涵蓋用于預(yù)防或治療CDI的相應(yīng)方法，所述方法包括施用本發(fā)明的抗體組合物給患者?；颊呖梢员黄D難梭菌感染，或具有艱難梭菌的癥狀(例如，輕度自身限制性腹瀉、腹痛、發(fā)熱和食欲喪失乃至威脅生命的病癥，例如，假膜性結(jié)腸炎和細胞毒性巨結(jié)腸) 或具有艱難梭菌感染的誘因(例如，經(jīng)受著抗生素治療、經(jīng)歷過艱難梭菌并具有復(fù)發(fā)的風險、或接觸顯示出與艱難梭菌感染相關(guān)的臨床癥狀的第二個體)。本發(fā)明因此提供了預(yù)防或治療CDI的有效手段。在一個實施方案中，所述治療CDI的方法包括施用本發(fā)明的抗體組合物給感染艱難梭菌或經(jīng)受CDI癥狀的患者。這可以使用治療有效量的抗體來完成。這種施用可以通過重復(fù)施用本發(fā)明的抗體組合物一段延長的時間階段來實現(xiàn)。所述組合物的抗體組分可以相同或不同(根據(jù)它們的毒素型特異性和/或艱難梭菌毒素上的靶向的結(jié)合區(qū)域或表位)，并且施用可以是同時的或順序的，且可以任何次序?qū)崿F(xiàn)。在另一實施方案中，所述預(yù)防⑶I的方法包括施用本發(fā)明的抗體組合物給患者以提供針對CDI的被動免疫。這可以通過在CDI發(fā)病前或極早期使用預(yù)防有效量的抗體來完成。這種施用可以通過重復(fù)施用本發(fā)明的抗體組合物一段延長的時間階段來實現(xiàn)。所述組合物的抗體組分可以相同或不同(根據(jù)它們的毒素型特異性和/或艱難梭菌毒素上的靶向的結(jié)合區(qū)域或表位)，并且施用可以是同時的或順序的，且可以任何次序?qū)崿F(xiàn)?？贵w制備羊抗體是在綿羊中產(chǎn)生的抗體。因此，本發(fā)明包括產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體組合物的羊抗體的方法，所述方法一般包括(i)施用包含艱難梭菌毒素或其片段的免疫原給綿羊；(ii)容許有足夠的時間在所述綿羊中產(chǎn)生抗體；以及(iii)從所述綿羊中獲得所述抗體。如本文所用的，綿羊包括屬于盤羊?qū)?Ovis)的任何物種(例如，盤羊 (Ovis ammon) Λ Ovis orientalis aries、Ovis orientalis orientalis、維氏盤羊(Ovis orientalis vignei)、力口拿大盤羊(Ovis Canadensis)、戴氏盤羊(Ovis dalli)、雪羊(Ovis nivicola))0本發(fā)明還包括產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體組合物的羊抗體的方法，其中所述羊抗體是由綿羊響應(yīng)于包含艱難梭菌毒素或其片段(優(yōu)選地，具有與全長天然毒素抗原交叉反應(yīng)性和/或保留全長天然毒素的毒素或毒素樣活性的片段)的免疫原而引發(fā)的?？贵w可以由綿羊血清獲得。因此，該程序產(chǎn)生了含有能夠結(jié)合和中和艱難梭菌毒素的抗體的綿羊抗血清。在另一實施方案中，抗體是分離的和/或純化的。因此，本發(fā)明的另一方面包括從綿羊抗血清中純化抗體。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的免疫原是任選被純化的艱難梭菌毒素或其片段。合適的艱難梭菌毒素包括引起CDI或其癥狀、或與CDI或其癥狀相關(guān)的任何艱難梭菌毒素。在另一實施方案中，毒素選自下列毒素中的至少一種艱難梭菌毒素A或其片段、艱難梭菌毒素B或其片段、以及艱難梭菌二元毒素或其片段。艱難梭菌毒素還可以是選自如上文所定義的毒素型0至XV中的一種的毒素。純化的艱難梭菌毒素的產(chǎn)生在實施例中示例。在某些實施方案中，免疫原是艱難梭菌毒素變體。在另一實施方案中，免疫原包含與SEQ ID NO :1-6至少80^^85%,90%、 95%,98%,99%或更多相同的氨基酸序列或其片段。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的免疫原還可以是部分或完全滅活的，S卩，具有降低的毒性。修飾的實例包括化學處理(例如，用UDP-二醛、甲醛、戊二醛、過氧化物或氧處理)和重組方法(例如，毒素中的缺失或突變)。例如，免疫原可以是源自通過用甲醛處理的天然毒素的艱難梭菌類毒素或其片段?？蛇x擇地，重組類毒素可以通過用定點誘變選擇性滅活活性位點基序而產(chǎn)生。降低或消除毒素A和毒素B的毒素作用的定點誘變的實例是修飾毒素的N末端結(jié)構(gòu)域中的D)(D基序?？梢詫⑻於彼岷?或其他殘基突變?yōu)槔绫彼嵋越档投舅谹和毒素B中任一種的生物活性。例如，對于毒素A，可以突變下列氨基酸中的一種或多種Asp 269、Asp285、Asp 287、Asn383、Trp519、Tyr283、Arg272。例如,對于毒素 B， 可以突變下列氨基酸中的一種或多種Asp270、Asp^6、Asp 288,Asn384, Trp520、Tyr284, Arg2730抗原可以與佐劑一起配制。合適的佐劑可以包括廣泛用于人的鋁(磷酸鋁或氫氧化鋁)，以及其他佐劑，如皂苷及其純化組分Quil A、弗氏完全佐劑、RIBBI佐劑以及用于研究和獸醫(yī)應(yīng)用的其他佐劑。艱難梭菌毒素或類毒素可以單獨地或者同時或順序地組合用作免疫原，以產(chǎn)生對單個艱難梭菌毒素或組合特異的抗體。例如，兩種或更多種毒素或類毒素可以混合在一起并用作單個免疫原?？蛇x擇地，艱難梭菌毒素(例如，艱難梭菌毒素A)可單獨地用作第一綿羊或山羊的第一免疫原，并且另一艱難梭菌毒素(例如，艱難梭菌毒素B)可單獨地用于第二綿羊或山羊。可以組合由單獨免疫產(chǎn)生的抗體以產(chǎn)生針對艱難梭菌毒素的抗體組合物。該方法包括所有的免疫模式，包括皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)。本發(fā)明還包括種類繁多的免疫方案。在一個實施方案中，在第0天給綿羊或山羊施用毒素并且綿羊或山羊隨后按間隔接受毒素。應(yīng)了解所需的間隔范圍和劑量范圍取決于免疫原的精確性質(zhì)、施用途徑、制劑的性質(zhì)以及參與人員的判斷?？梢允褂糜糜趦?yōu)化的標準經(jīng)驗程序來調(diào)節(jié)這些劑量水平的變化。類似地，本發(fā)明并不旨在限于收集抗體的任何具體方案。優(yōu)選的收集時間是第56天之后的某天。特異性抗體，即結(jié)合免疫原的抗體的水平應(yīng)呈現(xiàn)為每升血清中至少 3g。可以在收集后按需要修飾本發(fā)明的抗體，以便在某些情況下它們在所施用的患者中具有較低的免疫原性。例如，如果患者是人，則可以通過本領(lǐng)域中熟知的方法使抗體脫種特性(despeciate)。關(guān)于可如何制備較低免疫原性的抗體的一個實例是制備(Fab)2片段。 本發(fā)明的抗體可以用于產(chǎn)生這種抗體片段，已針對該抗體片段開發(fā)了多種技術(shù)。例如，片段可以通過完整抗體的蛋白水解消化衍生。用于它們的產(chǎn)生的其他技術(shù)對于熟練的從業(yè)者來說是明顯的?？贵w遞送
在使用時，本發(fā)明采用藥物組合物，所述藥物組合物包含呈適于腸胃外、優(yōu)選靜脈內(nèi)施用的形式的本發(fā)明的抗體組合物。將純化的完整抗體或其片段配制為用于這種遞送。 例如，可以將濃度在5-50或15-50或25-50g/升的抗體或其片段配制在緩沖液中。合適的緩沖液組分的實例包括生理鹽，如檸檬酸鈉和/或檸檬酸。優(yōu)選的緩沖液含有100-200mM 或125-175mM或大約150 (例如，153)mM生理鹽，如氯化鈉。優(yōu)選的緩沖液將藥物組合物維持在接近患者的生理pH的pH下-例如，5. 5-6. 4的pH、或5. 6-6. 3的pH、或5. 7-6. 2的pH 或5. 8-6. 2的pH。本發(fā)明的含抗體組合物優(yōu)選不包括佐劑，因為不希望在患者中刺激針對所述抗體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的抗體可以被配制為用于但不限于肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)遞送。適于肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射的組合物包括無菌水溶液。若需要的話這種水溶液應(yīng)被適當緩沖，并且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。本發(fā)明的抗體組合物不是口服制劑，并且不采用這種施用模式。在此方面，口服遞送的關(guān)鍵問題是確保足夠的抗體到達需要其的結(jié)腸。 阻止抗體到達腸的因素包括消化性分泌物中存在的蛋白水解酶，其降解抗體分子；并且在一些情況下還包括CDI自身的作用，其也會引起麻痹性腸梗阻和阻止液體沿消化道向下移動的其他并發(fā)癥。適于注射的組合物可以為溶液、懸浮液或在使用前溶解或懸浮于合適的溶媒中的干粉形式。在制備時，抗體或其片段的溶液可以溶解在溶媒中，若需要通過添加氯化鈉使溶液等滲，并且在裝入合適的無菌瓶或安瓿中并密封之前通過使用無菌技術(shù)通過無菌濾器過濾而滅菌。有利地，可以將如下的添加劑溶解在溶媒中緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、或懸浮劑和/或局部麻醉劑。在使用前溶解或懸浮在合適的溶媒中的干粉可以通過在無菌區(qū)域中使用無菌技術(shù)將預(yù)滅菌的成分裝入無菌容器中來制備?？蛇x擇地，可以在無菌區(qū)域中使用無菌技術(shù)將成分溶解在合適的容器中。然后將產(chǎn)物冷凍干燥并無菌密封容器。用于施用本發(fā)明的抗體的劑量范圍是產(chǎn)生期望的治療作用的那些劑量范圍。應(yīng)了解所需的劑量范圍取決于抗體或組合物的精確性質(zhì)、施用途徑、制劑的性質(zhì)、患者的年齡、 患者病癥的性質(zhì)、程度或嚴重度、禁忌癥(若存在)、以及主治醫(yī)師的判斷。可以使用用于優(yōu)化的標準經(jīng)驗程序來調(diào)節(jié)這些劑量水平的變化。合適的日劑量在5_20mg/kg體重的范圍內(nèi)。單位劑量可以從低于IOOmg變化，但通常在每劑250-2000mg的區(qū)域內(nèi)，該劑量可以每天施用或頻率更低地施用(例如，隔天施用，持續(xù)多達1周)。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是在預(yù)防或治療CDI的治療方法中如下使用本發(fā)明的抗體將本發(fā)明的抗體彼此組合、或作為另一種常用于CDI治療的其他已確定的治療的輔助或與其結(jié)合。例如，本發(fā)明的抗體可以與合適的抗生素(例如，甲硝唑和/或萬古霉素)結(jié)合施用。組合治療可以按本領(lǐng)域的技術(shù)人員認為必要或方便的任何方式實施，并且為了本說明書的目的，不包括關(guān)于組合使用的化合物的次序、量、重復(fù)或相對量的限制。定義部分艱難梭菌(Clostridium difficile)是梭狀芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性菌物種。
艱難梭菌感染(CDI)意指影響人和動物并且導(dǎo)致如下的一系列癥狀的細菌感染 從輕度自身限制性腹瀉至威脅生命的病癥，如假膜性結(jié)腸炎和細胞毒性巨結(jié)腸。在這種疾病中，艱難梭菌取代了正常的腸道菌群并產(chǎn)生攻擊和損壞腸道上皮的細胞毒素。人⑶I的主要風險因子包括接受廣譜抗生素、超過65歲以及住院。艱難梭菌毒素A是大小為大約300kDa的蛋白細胞毒素/腸毒素家族。毒素A具有在N末端區(qū)域內(nèi)的酶活性，該酶活性起作用破壞哺乳動物細胞的細胞骨架而引起細胞死亡。在艱難梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素A變體，它們稱為‘毒素型’。毒素A的各毒素型在它們的一級序列中總體具有通常小于10%的變異。合適的毒素A序列的實例包括 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No :3。艱難梭菌毒素B是大小為大約270kDa的蛋白細胞毒素家族，其與毒素A類似但具有顯著更高的細胞毒性。像毒素A —樣，毒素B具有在N末端區(qū)域內(nèi)的酶活性，該酶活性起作用破壞哺乳動物細胞的細胞骨架而引起細胞死亡。在艱難梭菌菌株中存在大量天然存在的毒素B變體，它們稱為‘毒素型’。毒素B的各毒素型在它們的一級序列中總體具有通常小于15%的變異。合適的毒素A序列的實例包括SEQ ID No :2和SEQ ID No :4。二元毒素是由一些但并非全部的艱難梭菌菌株產(chǎn)生的二組分細胞毒素。二元毒素在作用上與肉毒桿菌(Clostridium botulinum) C2和產(chǎn)氣莢膜梭菌t毒素相似，與艱難梭菌二元毒素類似，這些毒素由大約IOOkDa的細胞結(jié)合片段和大約50kDa的酶活性‘效應(yīng)’片段組成。合適的二元毒素序列的實例包括SEQ ID No :5和SEQ ID No :6。如本文所用的術(shù)語“毒素”涵蓋所述毒素片段。片段可以為在參考毒素的10至 2700(例如，至少50、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000、1500、2000或2500)個氨基酸的任何數(shù)目的范圍內(nèi)，片段優(yōu)選包括所研究的基因產(chǎn)物的至少一個表位?！捌巍边€可以具有與其所來源的毒素共同的抗原交叉反應(yīng)性和/或基本上相同的體內(nèi)生物活性。例如，能夠結(jié)合片段的抗體還能夠結(jié)合該片段所來源的毒素?？蛇x擇地，片段可以共有誘導(dǎo)T 淋巴細胞的“記憶應(yīng)答”的共同能力，所述T淋巴細胞之前已暴露于艱難梭菌毒素的抗原組分。術(shù)語毒素的含義涵蓋其“變體”-例如，與艱難梭菌毒素具有至少80%或85%或 90%或95%或96%或97%或98%或99%氨基酸序列同源性的肽或肽片段。在另一實施方案中，“變體”可以是肽或肽片段的模擬物，該模擬物再現(xiàn)該肽或肽片段的至少一個表位。提及毒素涵蓋毒素“類毒素”，下面對其進行更詳細地討論。毒素型通常用于分類艱難梭菌菌株。毒素型基于表征所獲得的毒素基因的限制模式的方法。如上所述的，毒素A和B的毒素型代表這些蛋白毒素的一級氨基酸序列變體。艱難梭菌類毒素用于描述艱難梭菌毒素(毒素A、毒素B或二元毒素)或被部分或完全滅活的艱難梭菌毒素的混合物。如果通過體外細胞毒性測定或通過動物毒性測量，毒素具有比未處理的毒素更低的毒性(例如，低100^^99^^95%或90%的毒性)，則認為該毒素是滅活的。與感興趣的毒素結(jié)合的抗體是能夠以足夠的親和力與該毒素結(jié)合而使該抗體可用作治療劑的抗體。與感興趣的毒素結(jié)合的抗體是以至少10%的親和力(Ka)與艱難梭菌的毒素結(jié)合的抗體。 毒素中和意指阻斷艱難梭菌的一種或多種細胞毒素(毒素A和/或毒素B和/或二元毒素)的生物學作用的物質(zhì)(例如，抗體)的作用。細胞毒素的生物學作用被定義為其殺傷或削弱哺乳動物細胞、尤其是哺乳動物腸道上皮的細胞的功能的能力。物質(zhì)的毒素中和活性可以通過其阻止以培養(yǎng)物生長的哺乳動物細胞死亡的能力來測量。治療有效量是指在單獨或組合施用給患者以治療CDI或至少一種CDI的臨床癥狀時足以影響疾病或癥狀的這種治療的抗體的量。治療有效量可以依據(jù)例如抗體、感染、和/ 或感染癥狀、感染嚴重度、和/或感染癥狀、待治療患者的年齡、體重和/或健康、以及開藥醫(yī)師的判斷而變化。任何給定情況下的合適治療有效量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定或者能夠通過常規(guī)實驗確定。治療有效量還是其中抗體的有益效果超過其任何毒性或有害作用的量?！邦A(yù)防有效量”是在單獨或組合施用給患者時，抑制或延遲⑶I或⑶I的至少一種臨床癥狀的發(fā)作或復(fù)發(fā)的抗體的任何量。在一些實施方案中，預(yù)防有效量完全阻止艱難梭菌感染的發(fā)作或復(fù)發(fā)?！耙种啤卑l(fā)作意指降低感染發(fā)作的可能或完全阻止發(fā)作。綿羊意指屬于盤羊?qū)俚娜魏挝锓N(例如，盤羊、Ovis orientalis aries、Ovis orientalis orientalis、維氏盤羊、力口拿大盤羊、戴氏盤羊、雪羊)。山羊意指屬于山羊?qū)?Capra)的任何物種(例如，例如西班牙山羊(Capra pyrenaicais)、；!匕山 $ (Capra ibex) > ^ |JL| ^ (Capra nubiana)、M 汐H ill ^ (Capra sibirica)、西敏山羊(Capra walie)、高力口索山羊(Capra caucasica)、東山羊(Capra cylindricornis) Lil^ (Capra aegagrus)(Capra falconeri))。羊抗體是與在綿羊中產(chǎn)生的抗體具有至少100%、99%、95%、90%、80%、75%、 60%、50%、25%或10%氨基酸序列同一性的抗體。對于序列比較，通常一個序列作為參考序列，測試序列可以與其比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機中，若需要則隨后指定坐標，并指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法基于指定的程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。可以進行用于比較的最佳序列比對，例如通過Smith和Waterman的局部同源性比對算法[Adv. Appl. Math. 2 :484(1981)]；通過 Needleman & Wunsch 的算法[J. Μο -β ο . 48 :443 (1970) ] ； 通過 Pearson & Lipman的相似性方法檢索[Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)]；通過這些算法的計算機實現(xiàn)方式(GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA-威斯康辛大學生物技術(shù)中心(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)的遺傳學計算機組(Genetics Computer Group)的序列分析軟件包)；或通過視覺檢查[參見 Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù))，F(xiàn). Μ· Ausbel 等人，編，Current Protocols, Greene Publishing Associates,In.禾口 John Wiley & Sons, Inc.合資(1995 補充材料)Ausbubel]。適于確定百分比序列相似性的算法的實例是BLAST算法和BLAST2. 0算法[參見Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215 第403-410頁；和美國國立生物技術(shù)信息中心的 "http://www. ncbi. nlm. nih. gov/，，]。在優(yōu)選的同源性比較中，在長度為至少10個氨基酸，優(yōu)選至少20個氨基酸，更優(yōu)選至少30個氨基酸殘基的序列區(qū)域內(nèi)存在同一性?！翱贵w”以最廣含義使用，并且具體涵蓋多克隆抗體和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出
10期望的生物活性即可。具體地，抗體是包括至少一個或兩個重鏈(H)可變區(qū)(本文縮寫為 VHC)和至少一個或兩個輕鏈(L)可變區(qū)(本文縮寫為VLC)的蛋白。VHC區(qū)和VLC區(qū)可進一步細分為稱為“互補決定區(qū)”(“CDR”)的高變區(qū)，其散布于更保守的稱為“框架區(qū)”(FR) 的區(qū)域中?？蚣軈^(qū)和⑶R的范圍已被精確定義(參見，Kabat，E.A.，等人kquences of Proteins of Immunological Interest (免疫學關(guān)注的蛋白序列)，第5版，美國衛(wèi)生和公共服務(wù)部(U. S. D印artment of Health and Human Services)，NIH 公布第 91-3242 號，1991， 和 Chothia, C.等人，J. Mol. Biol. 196 :901_917，1987，它們通過引用并入本文)。優(yōu)選地，各VHC和VLC由從氨基末端到羧基末端以如下次序排列的三個CDR和四個 FR 組成FRI、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4?？贵w的VHC或VLC鏈可以進一步包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分。在一個實施方案中，抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過例如二硫鍵互相連接。重鏈恒定區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域CHI、CH2和CH3。 輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL構(gòu)成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原互相作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與包括下列的宿主組織或因子的結(jié)合免疫系統(tǒng)的多種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。術(shù)語“抗體”包括型IgA、IgG、 IgE、IgD、IgM(以及它們的亞型)的完整免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的輕鏈可以是κ 型或λ型。如本文所用的術(shù)語抗體還指結(jié)合艱難梭菌的毒素(例如，毒素B)的抗體的部分， 例如，其中一條或更多條免疫球蛋白鏈不是全長，但結(jié)合毒素的分子。涵蓋在術(shù)語抗體中的結(jié)合部分的實例包括(i)Fab片段，由VLC、VHC、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii) F(ab' )2片段，包括由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VHC和 CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fc片段；(iv)由抗體單臂的VLC和VHC結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v) dab 片段(Ward等人，Nature 341 :544-546,1989)，其由VHC結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)，其具有足夠的框架來結(jié)合例如可變區(qū)的抗原結(jié)合部分。輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分，例如，F(xiàn)v片段的兩個結(jié)構(gòu)域VLC和VHC可以使用重組方法通過合成的連接子連接，所述合成的連接子使得它們可以作為單個蛋白鏈制備，在該單個蛋白鏈中VLC和VHC區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(ScFv)；參見，例如，Bird 等人(1988)kience IAI-ATi-Al β ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. kL USA 85: 5879-588 。這種單鏈抗體也涵蓋在術(shù)語抗體內(nèi)。這些是使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得的，并且以與完整抗體相同的方式篩選這些部分的效用。下面是示例了本發(fā)明的方面和/或?qū)嵤┓桨傅母綀D的簡要說明。

圖1通過親和色譜對血清中毒素A的抗體進行的測量。將結(jié)合毒素A的抗體固定于瓊脂糖凝膠上，隨后將其洗脫。該圖顯示了血清加載量與洗脫的毒素A特異性抗體之間的線性關(guān)系。實驗細節(jié)在實施例9中提供。圖2通過親和色譜對血清中毒素A的抗體進行的測量。將結(jié)合毒素A的抗體固定于瓊脂糖凝膠上，隨后將其洗脫。該圖展示了用毒素A的類毒素免疫的綿羊中的特異性抗體。毒素A的抗體以大于;3mg/ml(3g/升)存在于綿羊血清中。實驗細節(jié)在實施例9中提{共。圖3通過用羊抗艱難梭菌毒素A和B混合物被動免疫進行的⑶I預(yù)防。用IOmg/劑(▼ )、ang/劑(■)的毒素A和B的羊抗體或用非特異性對照抗體(·)在指定的時間被動免疫(腹膜內(nèi))敘利亞倉鼠(10只的組)。動物在第-2天接受克林霉素，并且在第 0天用艱難梭菌孢子OX IO2菌落形成單位)攻擊。存活率、攻擊后的天數(shù)由曲線顯示。圖4通過用羊抗艱難梭菌毒素A或B被動免疫進行的CDI預(yù)防。用IOmg/劑的毒素A+B的羊抗體(▼ )、10mg/劑的單獨毒素A抗體(Δ ) UOmg/劑的單獨毒素B抗體 (〇)或用非特異性對照抗體(口)在指定的時間被動免疫(腹膜內(nèi))敘利亞倉鼠(10只的組)。動物在第-2天接受克林霉素，并且在第0天用艱難梭菌孢子O X IO2菌落形成單位)攻擊。存活率、攻擊后的天數(shù)由曲線顯示。圖5用羊抗艱難梭菌毒素A和B混合物被動免疫進行的對027核糖核酸型‘高毒力，艱難梭菌(菌株R20291，Stoke Mandeville)誘導(dǎo)的CDI的預(yù)防。用IOmg/劑的毒素A 和B羊抗體(▼)或用非特異性對照抗體(■)在指定的時間被動免疫(腹膜內(nèi))敘利亞倉鼠(10只的組)。動物在第-3天接受克林霉素，并且在第0天用艱難梭菌孢子(IXlO3 菌落形成單位)攻擊。在攻擊后不同天數(shù)的疾病狀態(tài)由曲線顯示。圖6用羊抗艱難梭菌毒素A和B混合物被動免疫進行的對078核糖核酸型‘高毒力’艱難梭菌(毒素型5)誘導(dǎo)的CDI的預(yù)防。用IOmg/劑的毒素A和B羊抗體(▼)或用非特異性對照抗體(·)在指定的時間被動免疫(腹膜內(nèi))敘利亞倉鼠(10只的組)。動物在第-2天接受克林霉素，并且在第0天用艱難梭菌孢子OX IO3菌落形成單位)攻擊。 在攻擊后不同天數(shù)的疾病狀態(tài)由曲線顯示。實施例概述實施例1毒素型0的艱難梭菌毒素A和B的純化實施例2其他毒素型的艱難梭菌毒素A和B的純化實施例3重組艱難梭菌毒素A和B的純化實施例4艱難梭菌二元毒素的純化實施例5艱難梭菌毒素A和B的類毒素的制備實施例6抗血清的制備實施例7毒素型0的毒素A和B的抗血清的制備實施例8使用體外細胞測定進行的抗血清對毒素的中和功效的評估實施例9使用免疫親和柱定量血清中艱難梭菌毒素的特異性抗體的量實施例10抗體混合物的制備實施例11羊抗體用于預(yù)防⑶I的體內(nèi)功效的評估實施例12羊抗血清用于治療⑶I的體內(nèi)功效的評估實施例13抗體制劑的臨床應(yīng)用實施例14通過用羊抗艱難梭菌毒素A和B抗體混合物被動免疫進行的⑶I預(yù)防實施例15通過用羊抗艱難梭菌毒素A或B抗體、或用羊抗艱難梭菌毒素A和B抗體混合物被動免疫進行的CDI預(yù)防實施例16用羊抗艱難梭菌毒素A和B混合物被動免疫進行的對027核糖核酸型 ‘高毒力，艱難梭菌(菌株R20291，Stoke Mandeville)誘導(dǎo)的CDI的預(yù)防實施例17用羊抗艱難梭菌毒素A和B混合物被動免疫進行的對078核糖核酸型 ‘高毒力’艱難梭菌分離株誘導(dǎo)的CDI的預(yù)防
SEQ ID NO 概述在下列SEQ ID NO的任一個中指示了起始Met氨基酸殘基或相應(yīng)的起始密碼子時，所述殘基/密碼子是任選的。1.艱難梭菌毒素A-毒素型0的蛋白序列2.艱難梭菌毒素B-毒素型0的蛋白序列3.艱難梭菌毒素A-毒素型III的蛋白序列4.艱難梭菌毒素B-毒素型III的蛋白序列5.艱難梭菌二元毒素片段A的蛋白序列6.艱難梭菌二元毒素片段B的蛋白序列
實施例實施例1毒素型0的艱難梭菌毒素A和B的純化產(chǎn)生毒素型0毒素A和B的艱難梭菌菌株(例如，VPI 10463)按照所描述的 (Roberts 和 ShoneQOOl) iToxicon 39 :325-333)生長在透析囊(dialysis sac)培養(yǎng)物中。 生長后，從透析囊收集細胞漿液，并然后以10000 X g離心30分鐘，并將所得上清液的pH調(diào)節(jié)為PH 7. 5，并使其關(guān)于硫酸銨為70%飽和。通過離心收集含有毒素的沉淀，然后重懸于 50mM bistris pH 6. 5緩沖液并使其在4°C對同一緩沖液透析。透析后，通過Q瓊脂糖色譜、 陰離子交換色譜和用NaCl梯度洗脫的含有毒素的蛋白峰來純化粗毒素A和B的溶液。將含有毒素A的峰對含有0. 5M NaCl的50mM Hepes pH 7. 4緩沖液透析并在Si螯合柱( 瓊脂糖)上純化。加載毒素并從柱上洗去污染蛋白后，用含有50mM Hepes pH 7. 4、20mM EDTA和 0. IM NaCl的緩沖液洗脫純化的毒素Α。將純化的毒素A對含有0. 15M NaCl的5OmM Hepes PH 7. 4緩沖液透析并儲存在4°C或冷凍直至使用。通過在高分辨的Mono Q陰離子交換樹脂柱上的色譜來進一步純化來自最初的Q瓊脂糖柱的含有毒素B的峰。在將毒素加載到在 50mM bistris pH 6. 5緩沖液中的柱之后，用NaCl梯度洗脫純化的毒素B并收集含有毒素的級分。將純化的毒素B對含有0. 15M NaCl的50mM Hepes pH 7. 4緩沖液透析并儲存在 4°C或冷凍直至使用。實施例2其他毒素型的艱難梭菌毒素A和B的純化代表任何已知毒素型的毒素A和B可按照實施例1中所描述的進行純化。產(chǎn)生各種毒素型的毒素A和B的已知艱難梭菌菌株在表1中給出，并且通過選擇純化所需的菌株， 可以純化所需毒素型的毒素A和B。可選擇地，可以按先前所描述的(Rupnik等人(1998) J. Clinical Microbiol. 36 :2240-2247 ；Rupnik 等人(2001)Microbiology 147 :439-447) 對艱難梭菌進行毒素分型直到獲得產(chǎn)生期望毒素型的毒素的艱難梭菌菌株。為產(chǎn)生毒素型III毒素A和B，將艱難梭菌菌株R20291(也稱為NCTC 13366)按所描述的(Roberts和Sione (2001) Toxicon 39 =325-333)生長在透析囊培養(yǎng)物中，并按實施例1中所描述的純化毒素。實施例3重組艱難梭菌毒素A和B的純化艱難梭菌毒素A和B的實例的氨基酸序列顯示在kq ID 1至4中。具有對于任何期望表達宿主(例如，大腸桿菌(E. coli)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))的密碼子偏倚的編碼這些肽的基因可以商業(yè)形式得到。使用標準的分子生物學方法(例如Sambrook等人 1989，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)從這些基因表達肽并通過疏水相互作用色譜、離子交換色譜和陶瓷羥基磷灰石色譜的組合純化所得的可溶性的表達多肽?？梢允褂脤Φ鞍准兓I(lǐng)域來說熟知的其他色譜技術(shù)，例如尺寸排阻色譜和 /或親和色譜。對于后者來說，可以與親和純化標簽(例如，組氨酸_6、str印標簽)一起表達重組片段，諸如在pET vector Expression System Manual (pET載體表達系統(tǒng)手冊)， 第 11 版，Merck KGaA 出版，Darmstadt，Germany 中所描述的。為了從序列未知的艱難梭菌毒素型產(chǎn)生重組毒素，必須首先提取DNA并通過標準分子生物學方法得到毒素序列。一旦得到序列，就可以如上從合成的基因表達重組毒素。實施例4艱難梭菌二元毒素的純化艱難梭菌二元毒素片段A和B的氨基酸序列分別顯示在kq ID 5和6中。具有對于任何期望表達宿主(例如，大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母)的密碼子偏倚的編碼這些肽的基因可以商業(yè)形式得到。使用標準的分子生物學方法(例如Sambrook等人1989，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)從這些基因表達肽并通過疏水相互作用色譜、離子交換色譜和陶瓷羥基磷灰石色譜的組合純化所得的可溶性的表達肽。可以使用對蛋白純化領(lǐng)域來說熟知的其他色譜技術(shù)，例如尺寸排阻色譜和/或親和色譜?？蛇x擇地，可以與親和純化標簽(例如，組氨酸-6、str印標簽)一起表達重組片段，諸如在pET vector Expression System Manual (pET 載體表達系統(tǒng)手冊)，第 11 版，Merck KGaA 出版， Darmstadt, Germany 中所描述的。如果以不溶性形式制備肽，則可以用商購獲得的表達載體如pET52b將它們與組氨酸-6純化標簽一起表達，并通過柱上復(fù)性技術(shù)復(fù)性，如Lia等人的綜述和其中所含的參考文獻(Lia M 等人(2004)Protein Expression & Purification 33,1-10)中所描述的， 它們通過引用并入本文。實施例5艱難梭菌毒素A和B的類毒素的制備將濃度為0. 2-2mg/ml的純化的艱難梭菌毒素對合適的緩沖液(例如，含有150mM NaCl的IOmM Hepes緩沖液pH 7. 4)透析，然后添加終濃度為0. 05%至0. 5%的甲醛并在 35°C下孵育1至25天。孵育后，通過透析移除甲醛。不同的肽之間用甲醛處理的條件可以變化，并且最終的條件可以基于預(yù)防功效評估結(jié)果來細調(diào)。實施例6抗血清的制備在制備抗血清期間要考慮大量因素以達成最佳的體液抗體應(yīng)答。這些因素包括動物品種佐劑選擇免疫位點的數(shù)目和位置免疫原的數(shù)量給藥的次數(shù)和給藥之間的間隔作為優(yōu)化這些參數(shù)的結(jié)果，常規(guī)的是獲得超過6g/L血清的特異性抗體水平。對于綿羊，將含有10至500 μ g的艱難梭菌抗原的2ml緩沖液與2. 6ml弗氏佐劑混合。完全形式的佐劑用于初免，不完全弗氏佐劑用于所有的后續(xù)加強。佐劑混合持續(xù)進
14行幾分鐘以確保穩(wěn)定的乳液。使用約4. 2ml的抗原/佐劑混合物來通過肌內(nèi)注射免疫每只綿羊并覆蓋了包括頸部和所有上肢的6個位點。每觀天重復(fù)一次這種免疫。在每次免疫后的14天取血液樣品。一旦達到了足夠的抗體水平，將更大體積(10ml/kg體重)移入無菌袋中。緩慢旋轉(zhuǎn)袋子以加速凝血，以4500Xg離心30分鐘并在無菌條件下取出血清并收集。從群體中移出顯示對期望的艱難梭菌抗原的低效價的任何動物。實施例7毒素型0的毒素A和B的抗血清的制備按照實施例1中所描述的制備來自毒素型0菌株(例如，VPI 10463)的毒素A和 B?？蛇x擇地，毒素A或B可以按照^ng等人所述的重組方法(Yang G，Zhou B，Wang J, He X, Sun X, Nie W, Tzipori S, Feng H(2008)Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌中的重組艱難梭菌毒素A和B的表達).BMC Microbiol. 8 192)制備?？梢园凑諏嵤├?中所描述的方法對純化的毒素制備類毒素。對于用類毒素A或B免疫綿羊，將含有10至500 μ g的艱難梭菌類毒素A或B的 2ml緩沖液與2. 6ml弗氏佐劑混合。完全形式的佐劑用于初免，不完全弗氏佐劑用于所有的后續(xù)加強。佐劑混合持續(xù)進行幾分鐘以確保穩(wěn)定的乳液?；旌虾螅褂么蠹s4. 2ml的抗原/ 佐劑混合物來通過肌內(nèi)注射免疫每只綿羊并覆蓋了包括頸部和所有上肢的6個位點。每觀天重復(fù)一次這種免疫并且在每次免疫后14天收集血清樣品。一旦達到了足夠的抗體水平， 將更大的生產(chǎn)樣品(10ml/kg體重)移入無菌袋中。緩慢旋轉(zhuǎn)袋子以加速凝血，以4500Xg 離心30分鐘并在無菌條件下取出血清并收集。將顯示對毒素A或B的低效價的任何動物從群體中略去。實施例8使用體外細胞測定進行的抗血清對毒素的中和功效的評估抗艱難梭菌毒素抗血清的毒素中和活性通過使用Vera細胞的細胞毒性測定來測量。將固定量的純化的艱難梭菌毒素A或毒素B與多種稀釋度的抗體混合，在37°C下孵育 1小時，然后應(yīng)用于生長在M孔組織培養(yǎng)板上的Vero細胞。毒素A和B均具有導(dǎo)致Vero 細胞在M-72小時的期間內(nèi)特征性變圓的細胞毒活性。在存在中和抗體的條件下，這種活性被抑制并且抗體制劑的中和強度可以通過中和指定量的毒素A或B的作用所需的稀釋度來評估。展示艱難梭菌毒素A的羊抗體的中和活性的數(shù)據(jù)顯示在表2中。在此實驗中，將多種稀釋度的羊抗體與終濃度為50ng/ml的毒素A混合并在37°C下孵育1小時，然后應(yīng)用于上述Vero細胞并在37°C下孵育，在M-72小時期間監(jiān)測。計算保護細胞抵抗毒素A的細胞毒作用的抗體稀釋度。表2顯示免疫14周的綿羊具有16000的中和效價(即，1/16000 稀釋度的血清保護細胞免于毒素A的細胞毒作用)。表2-針對甲醛處理的毒素A產(chǎn)生的羊抗體的中和效價
接種次數(shù)免疫時間(周)抗體中和效價T00<1010<10262000310400041416000 1在細胞中和測定中中和50ng/ml毒素A所需的血清的稀釋度
表3-針對甲醛處理的毒素B產(chǎn)牛的羊杭體的中和效價這㈣數(shù)據(jù)(下面)顯示如通過Vera細胞的細胞毒性測定測量的，類毒素B抗原的較高的免疫劑量導(dǎo)致更好的羊毒素-中和免疫應(yīng)答。所采用的測定在緊靠上面的實施例8中描述。
權(quán)利要求
1.一種抗體組合物，所述抗體組合物包含羊抗體，用于預(yù)防或治療艱難梭菌 (C. difficile)感染，其中所述抗體結(jié)合艱難梭菌毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其中所述抗體是多克隆抗體。
3.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的抗體組合物，其中所述抗體結(jié)合選自由下列組成的組的至少一種艱難梭菌毒素艱難梭菌毒素A、艱難梭菌毒素B和艱難梭菌二元毒素。
4.根據(jù)任一權(quán)利要求3所述的抗體組合物，其中所述抗體結(jié)合艱難梭菌毒素A并且結(jié)合艱難梭菌毒素B。
5.根據(jù)任一權(quán)利要求3所述的抗體組合物，其中所述抗體結(jié)合艱難梭菌毒素A并且結(jié)合艱難梭菌二元毒素。
6.根據(jù)任一權(quán)利要求3所述的抗體組合物，其中所述抗體結(jié)合艱難梭菌毒素B并且結(jié)合艱難梭菌二元毒素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體組合物，其中所述艱難梭菌毒素是選自以下的組的毒素A 毒素型0、毒素型III和毒素型V。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3、權(quán)利要求4或權(quán)利要求6中任一項所述的抗體組合物，其中所述艱難梭菌毒素是選自以下的組的毒素B 毒素型0、毒素型III和毒素型V。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的抗體組合物，以及選自藥學上可接受的載體、賦形劑和/或用于腸胃外施用的鹽的至少一種組分。
10.一種用于預(yù)防或治療艱難梭菌感染的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求1至8 所述的抗體組合物或根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物。
11.一種產(chǎn)生用于根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的抗體組合物或用于根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物的羊抗體的方法，其中所述羊抗體是由綿羊響應(yīng)于包含艱難梭菌毒素或其片段的免疫原而引發(fā)的。
12.—種產(chǎn)生用于根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的抗體組合物或用于根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物的羊抗體的方法，所述方法包括(i)施用包含艱難梭菌毒素或其片段的免疫原給綿羊；(ii)容許有足夠的時間在所述綿羊中產(chǎn)生抗體；以及(iii)從所述綿羊獲得所述抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的方法，其中所述免疫原是艱難梭菌類毒素。
全文摘要
本申請?zhí)峁┯糜陬A(yù)防或治療艱難梭菌(C.difficile)感染的包含羊抗體的抗體組合物，其中所述抗體結(jié)合艱難梭菌毒素。
文檔編號A61K39/40GK102365097SQ201080008673
公開日2012年2月29日 申請日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者克利福德·肖恩, 約翰·蘭登 申請人:衛(wèi)生防護機構(gòu), 麥克羅弗姆有限公司