毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠特異性地且以高靈敏度檢測(cè)毒素產(chǎn)生性艱難梭菌（C.difficile）的寡核苷酸、以及使用該寡核苷酸的毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的檢測(cè)方法。1）包括由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。2）包括由序列號(hào)4所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
【專利說明】毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)毒素產(chǎn)生性艱難梭菌(Clostridium difficile)的寡核苷酸和使用該寡核苷酸的毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]艱難梭菌(C.difficile)是產(chǎn)生對(duì)于人為病原性的菌體外毒素的芽胞形成革蘭氏陽性桿菌。由該菌引起的C.difficile相關(guān)性腹瀉癥(CDAD)近年來成為很大的問題(非專利文獻(xiàn)I)。即，抗生素或抗癌劑等的過度使用使正常的腸內(nèi)細(xì)菌菌群受到損害，結(jié)果使增殖的C.difficile產(chǎn)生毒素TcdA和TcdB，發(fā)生腹瀉等癥狀。已知C.difficile出現(xiàn)在感染的人的糞便中，經(jīng)由器物或手等到達(dá)人的口或粘膜而感染。
[0003]C.difficile 的病原性主要是由屬于 Large Clostridial Toxin (LCTs)家族的
2種毒素TcdA和TcdB造成的，C.difficile的各菌株根據(jù)它們的毒素產(chǎn)生性的不同，大致分為TcdA產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A+B+)、TcdA非產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A-B+)以及毒素非產(chǎn)生型(Α-B-)。另外，C.difficile的毒素產(chǎn)生體系據(jù)認(rèn)為由tcdA和tcdB、以及編碼它們的調(diào)節(jié)因子的tcdC, tcdR, tcdE構(gòu)成的病原性座位形成,有報(bào)告當(dāng)對(duì)毒素的產(chǎn)生進(jìn)行負(fù)調(diào)控的tcdC缺陷時(shí)，毒素TcdA和TcdB產(chǎn)生亢進(jìn)。
[0004]因此，僅選擇性地檢測(cè)毒素產(chǎn)生性C.difficile (A+B+和A_B+)，在CDAD等的C.difficile 感染癥(Clostridium difficile infection:CDI)在臨床診斷上很重要。
[0005]以往，對(duì)于毒素產(chǎn)生性C.difficile的檢測(cè)，報(bào)告了幾條以毒素基因tcdA和tcdB為靶標(biāo)的引物，能夠使用這些引物從糞便提取DNA中檢測(cè)該基因(非專利文獻(xiàn)2 — 4、專利文獻(xiàn)I)。
[0006]然而，由于C.difficile在健康人腸道的菌數(shù)水平低，所以為了使用PCR檢測(cè)糞便中的毒素產(chǎn)生株，需要構(gòu)建具有更高的特異性和檢測(cè)靈敏度這兩者的檢測(cè)體系，在該點(diǎn)上，可以說還不充分。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開2003 - 164282號(hào)公報(bào)
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)1:Rupnik, M.，M.H.Wilcox, and D.N.Gerding., Nat RevMicrobiol.20097:526-36
[0012]非專利文獻(xiàn)2:Belanger, S.D.，M.Boissinot, N.Clairoux, F.J.Picard, andM.G.Bergeron., J Clin Microbiol.200341:730-4
[0013]非專利文獻(xiàn)3:Houser, B.A., A.L.Hattel, and B.M.Jayara0., Foodborne PathogDis.20107:719-26.[0014]非專利文獻(xiàn)4:Sloan, L.M., B.J.Duresko, D.R.Gustafson, and J.E.Rosenblatt., JClin Microbiol.200846:1996-2001
【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明所要解決的課題
[0016]本發(fā)明涉及提供能夠特異性地且以高靈敏度檢測(cè)毒素產(chǎn)生性C.difficile的寡核苷酸、以及使用該寡核苷酸的毒素產(chǎn)生性C.difficile的檢測(cè)方法。
[0017]用于解決課題的方法
[0018]本發(fā)明的發(fā)明人等鑒于上述課題，發(fā)現(xiàn)通過將20個(gè)菌株的tcdA基因序列、22個(gè)菌株的tcdB基因序列、以及作為索氏梭菌(Clostridium sordelii)的毒素基因tcsL、作為諾氏梭菌(Clostridium novyi)的毒素基因tcnA和作為產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的毒素基因tcpL的堿基序列一起比對(duì),設(shè)計(jì)得到特定的寡核苷酸,使用該寡核苷酸擴(kuò)增tcdA基因和tcdB基因并測(cè)定，由此，能夠特異性地且以優(yōu)異的靈敏度檢測(cè)毒素產(chǎn)生性的C.difficile。
[0019]本發(fā)明涉及以下的I)~10)。
[0020]I)包括由序列號(hào)I所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
[0021]2)由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針。
[0022]3)上述2)的寡核苷酸探針,其中,在寡核苷酸的5’末端結(jié)合有突光物質(zhì),在3’末端結(jié)合有粹滅物質(zhì)。
[0023]4)具備上述I)的引物對(duì)和上述3)的寡核苷酸探針的實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組。
[0024]5)包括由序列號(hào)4所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。 [0025]6)由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針。
[0026]7)上述6)寡核苷酸探針,其中,在寡核苷酸的5’末端結(jié)合有突光物質(zhì),在3’末端結(jié)合有猝滅物質(zhì)。
[0027]8)具備上述5)的引物對(duì)和上述7)的寡核苷酸探針的實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組。
[0028]9) 一種毒素產(chǎn)生性C.difficile的檢測(cè)方法，其包括:以從人糞便提取的DNA為模板，使用上述4)或8)的寡核苷酸組分別進(jìn)行PCR的工序；和通過測(cè)定熒光來測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。
[0029]10) 一種人糞便中的C.difficile中毒素產(chǎn)生性C.difficile和/或非毒素產(chǎn)生性C.difficile的存在比率的計(jì)算方法，其包括:以從人糞便提取的DNA為模板，使用上述4)和/或8)的寡核苷酸組、以及以下表示的(a)的引物對(duì)或具備(a)的引物對(duì)和(b)的寡核苷酸探針的實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組，分別進(jìn)行PCR的工序；和通過測(cè)定熒光來測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。
[0030](a)包括由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
[0031](b)由序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針，其中，在該寡核苷酸的5’末端結(jié)合有熒光物質(zhì)，在3’末端結(jié)合有猝滅物質(zhì)。[0032]發(fā)明的效果
[0033]根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸和毒素產(chǎn)生性C.difficile的檢測(cè)方法，能夠特異性地且以高靈敏度檢測(cè)糞便中的毒素產(chǎn)生性C.difficile。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠簡易且準(zhǔn)確地進(jìn)行毒素產(chǎn)生性C.difficile感染癥的診斷，而且能夠容易地調(diào)查健康成人的糞便中的毒素產(chǎn)生性C.difficile株的檢出頻率。另外，通過同時(shí)測(cè)定C.difficile的總菌數(shù)，就能夠?qū)τ诩S便中的C.difficile算出毒素產(chǎn)生性C.difficile或非毒素產(chǎn)生性C.difficile的存在比率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1 在 TaqMan PCR 法中對(duì)于靶標(biāo)菌的反應(yīng)性(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
[0035]圖2在TaqMan PCR法中對(duì)糞便中的靶標(biāo)菌的檢測(cè)靈敏度(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
【具體實(shí)施方式】
[0036]本發(fā)明的引物對(duì)包括:(I)用于擴(kuò)增tcdA基因的引物對(duì)和(2)用于擴(kuò)增tcdB基因的引物對(duì)。
[0037](I)用于擴(kuò)增tcdA基因的引物對(duì)包括作為由序列號(hào)I所示的堿基序列(5’-CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT-3’ CtcdA-F))構(gòu)成的寡核苷酸的第一引物、和作為由序列號(hào)2所示的堿基序列(5’ -AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGC-3’ CtcdA-R))構(gòu)成的寡核苷酸的第二引物。第一引物能夠在PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為正向引物使用，第二引物能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為與第一引物組合的反向引物使用。
[0038]C.difficile的各菌株被大致分為TcdA產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A+B+)、TcdA非產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A-B+)和毒素非產(chǎn)生型(A-B-)，但已知tcdA毒素基因的有無和TcdA毒素產(chǎn)生的有無不一定一致。在使用現(xiàn)有公知的用于擴(kuò)增tcdA基因的引物時(shí)，大多情況下不僅檢測(cè)到A+B+型株，而且也檢測(cè)到A-B+型`株，在該方法中，無法僅檢測(cè)到TcdA毒素產(chǎn)生菌(參照實(shí)施例2 (3))。對(duì)此，在使用本發(fā)明的包括第一和第二引物的引物對(duì)的情況下，如表3所示，僅A+B+型株中的tcdA被擴(kuò)增，A-B+型株中的tcdA沒有擴(kuò)增。即，在使用本發(fā)明的用于擴(kuò)增tcdA基因的引物對(duì)時(shí)，能夠可靠地僅檢測(cè)到TcdA毒素產(chǎn)生性C.difficile、即A+B+型株(參照實(shí)施例2 (2)和(3))。
[0039](2)用于擴(kuò)增tcdB基因的引物對(duì)包括作為由序列號(hào)4所示的堿基序列(5’ -TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3’ CtcdB-F))構(gòu)成的引物的第三引物、和作為由序列號(hào)5所示的堿基序列(5’ -CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3’(tcdB-R))構(gòu)成的引物的第四引物。第三引物能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為正向引物使用，第四引物能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為與第三引物組合的反向引物使用。
[0040]通過使用該引物對(duì)，能夠可靠地?cái)U(kuò)增tcdB基因，能夠可靠地檢測(cè)TcdB毒素產(chǎn)生性C.difficile、即 A+B+ 型株和 A-B+ 型株(表 3)。
[0041]本發(fā)明的寡核苷酸探針包括:(1)與tcdA基因特異性地雜交的探針、和(2)與tcdB基因特異性地雜交的探針。
[0042](I)與tcdA基因特異性地雜交的探針為由序列號(hào)3所示的堿基序列(5’ 一TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG 一 3’(tcdA-Ρ))構(gòu)成的寡核苷酸(第一探針)，與由包括上述第一和第二引物的引物對(duì)的擴(kuò)增范圍特異性地結(jié)合。另外，(2)與tcdB基因特異性地雜交的探針為由序列號(hào)6所示的堿基序列(5’ - TTTKCCAGTAAAATCAATTGC TTC — 3’ CtcdB-P))構(gòu)成的寡核苷酸(第二探針)，與由包括上述第三和第四引物的引物對(duì)的擴(kuò)增范圍特異性地結(jié)合。
[0043]這樣的寡核苷酸探針通過將5’末端側(cè)用FAM(羧基突光素,carboxyfluorescein)、TET (四氯羧基突光素，tetrachlorocarboxyfIuorescein)等突光物質(zhì)修飾,將3’末端用TAMRA (羧基四甲基羅丹明，carboxytetramethylrhodamine)、BHQ-l (黑洞粹滅劑-1,blackhole quencher-1)等粹滅物質(zhì)修飾,例如能夠作為用于進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的修飾寡核苷酸(所謂的Taqman探針)使用。
[0044]即，經(jīng)修飾的第一探針與由上述第一引物和第二引物構(gòu)成的引物對(duì)一起，能夠作為用于利用實(shí)時(shí)PCR通過擴(kuò)增、測(cè)定tcdA基因的寡核苷酸組使用，經(jīng)修飾的第二探針與由上述第三引物和第四引物構(gòu)成的引物對(duì)一起，能夠作為用于利用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增、測(cè)定tcdB基因的寡核苷酸組使用。
[0045]本發(fā)明的寡核苷酸，除了由上述序列號(hào)I~6所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸以外，還包括由與該各堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸。即，包括:由與序列號(hào)I和序列號(hào)2所示的堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)、由與序列號(hào)3所示的堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、由與序列號(hào)4和序列號(hào)5所示的堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)、由與序列號(hào)6所示的堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針。
[0046]另外，由在序列號(hào)I~6所示的堿基序列或與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列中缺失、取代、添加或插入I或 2個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的、且分別與由序列號(hào)I~6所示的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸具有作為引物或探針相同的功能的寡核苷酸，也同樣作為本發(fā)明的寡核苷酸。
[0047]本發(fā)明的寡核苷酸能夠通過公知的化學(xué)合成法容易地制造。
[0048]本發(fā)明的上述各引物對(duì)優(yōu)選與上述各寡核苷酸探針一起使用，以從人糞便提取的DNA作為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)定該擴(kuò)增產(chǎn)物，由此能夠分別檢測(cè)TcdA毒素產(chǎn)生性C.difficile 和 TcdB 毒素產(chǎn)生性 C.difficile。
[0049]其中，該檢測(cè)中包括C.difficile的有無的判定和C.difficile的定量。此外，定量包括菌數(shù)的定量。
[0050]通過使用本發(fā)明的上述各引物對(duì)、優(yōu)選與上述各寡核苷酸探針一起使用，能夠測(cè)定糞便中的TcdA毒素產(chǎn)生性C.difficile和TcdB毒素產(chǎn)生性C.difficile的菌數(shù)，通過將它們與C.difficile特異性的引物或探針組合,一同測(cè)定C.difficile的總菌數(shù),能夠算出糞便中(腸內(nèi))的C.difficile的詳細(xì)情況、即毒素產(chǎn)生性C.difficile (A+B+型的菌數(shù)、A-B+型的菌數(shù)、或A+B+型和A-B+型的菌數(shù)的總和)、或非毒素產(chǎn)生性C.difficile(A-B-型的菌數(shù))相對(duì)于C.difficile的總菌數(shù)(A+B+型、A-B+型和A-B-型的菌數(shù)的總和)的存在比率。
[0051 ] 作為該對(duì)于C.dif f ici Ie特異性的引物、探針，可以列舉以下所示的(a)的引物對(duì)或具有(a)的引物對(duì)和(b)的寡核苷酸探針的實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組。
[0052](a)包括由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
[0053](b)由序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針，其中，在該寡核苷酸的5’末端結(jié)合有熒光物質(zhì)，在3’末端結(jié)合有猝滅物質(zhì)。
[0054]這里，(a)的引物對(duì)包括:作為由序列號(hào)7所示的堿基序列(5’ 一GCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGT 一 3’(CD16SrRNA-F))構(gòu)成的寡核苷酸的第五引物、和作為由序列號(hào) 8 所示的堿基序列(5，- GTACTGGCTCACCTTTGATATTYAAGAG 一 3’(CD16SrRNA_R))構(gòu)成的寡核苷酸的第六引物。第五引物能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為正向引物使用，第六引物能夠在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為與第五引物組合的反向引物使用。
[0055](b)的寡核苷酸探針為由序列號(hào)9所示的堿基序列(5’ -TGCCTCTCAAATATATTATCCCGTATTAG — 3’ (CD16SrRNA-P))構(gòu)成的寡核苷酸(第三探針)，與由上述第五和第六引物構(gòu)成的引物對(duì)的擴(kuò)增范圍特異性地結(jié)合。該寡核苷酸探針通過用FAM、TET等熒光物質(zhì)修飾5’末端側(cè)、用TAMRA、BHQ-1等猝滅物質(zhì)修飾3’末端，能夠作為例如用于進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的修飾寡核苷酸(所謂Taqman探針)使用。
[0056]此外，由在序列號(hào)7~9所示的堿基序列或與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列中缺失、取代、添加或插入I或2個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的、且分別與由序列號(hào)7~9所示的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸具有作為引物或探針相同的功能的寡核苷酸，同樣作為上述(a)和(b)寡核苷酸。
[0057]作為調(diào)查微生物的存在或存在量等的被檢體，可以列舉例如:結(jié)膜拭子液、牙石、牙垢、喀痰、咽拭子液、唾液、鼻涕、肺胞清洗液、胸水、胃液、胃清洗液、尿、宮頸管粘液、陰道分泌物、皮膚病灶、糞便、血液、腹水、組織、脊髓液、關(guān)節(jié)液、患處拭子液等來自機(jī)體的試樣、食品、醫(yī)藥品、化妝品、食品-醫(yī)藥品-化妝品的中間處理物、微生物培養(yǎng)液、植物、土壤、活性污泥、廢水這樣的存在含有微`生物可能性的對(duì)象。作為來自被檢體的試樣，只要是能夠反映被檢體的微生物的存在或存在量的試樣就沒有特別限定，可以列舉例如:包含被檢體所含的核苷酸的混合物或包含DNA的混合物，但從用于PCR法的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選包含被檢體所含的DNA的混合物。
[0058]從人糞便中提取DNA能夠利用與以往的制備基因組DNA時(shí)同樣的手法進(jìn)行，例如，能夠從被檢體的全部或一部分中，根據(jù)需要利用提取、分離、純化方法進(jìn)行前處理，之后利用適當(dāng)公知的方法獲得。根據(jù)需要，也可以利用過濾、離心分離、色譜等公知的方法進(jìn)行前處理，然后使用例如“在玻璃珠等的存在下進(jìn)行攪拌的物理破碎法”、“CTAB法”、“苯酚氯仿法(PC法)”、“磁珠法”、“硅膠柱法”等通用方法或者組合這些方法的手法進(jìn)行提取而獲得，另外也可以使用市售的試劑盒進(jìn)行。
[0059]為了得到PCR高檢測(cè)靈敏度，希望獲得高濃度的DNA，而另一方面，來自糞便的核酸提取液中混雜有妨礙PCR的物質(zhì)，因此，希望獲得盡可能地去除了這些妨礙物質(zhì)的高純度的DNA。為了該目的，特別優(yōu)選使用能夠提取高濃度且高純度的DNA的FastDNA SPIN Kitfor Feces (MP Biomedicals)。
[0060]作為核酸擴(kuò)增法，沒有特別限定，可以舉出利用PCR法的原理的公知的方法?？梢粤信e例如:PCR 法、LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，Loop-mediated isothermal AMPlification)法、ICAN (等溫嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增，Isothermal and Chimeric primer-1nitiatedAmplification of Nucleic acids)法、RCA (滾環(huán)擴(kuò)增，Rolling Circle Amplification)法、LCR (連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Ligase Chain Reaction)法、SDA (鏈置換擴(kuò)增，StrandDisplacement Amplification)法等。
[0061]另外，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中，可以使用能夠特異性地識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的公知的手段。例如，能夠使放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記物與在擴(kuò)增反應(yīng)的過程中攝取的dNTP作用，檢測(cè)該標(biāo)記物。作為觀察攝取了被標(biāo)記的dNTP的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，只要是用于檢測(cè)上述標(biāo)記物的本【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法則可以為任意方法。例如，在作為標(biāo)記物使用放射性同位素的情況下，能夠利用例如液體閃爍計(jì)數(shù)器、Y —計(jì)數(shù)器等測(cè)定放射活性。另外，在作為標(biāo)記物使用熒光的情況下，能夠使用熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀等檢測(cè)該熒光。
[0062]在本發(fā)明中，作為核酸擴(kuò)增法，從迅速性和定量性的方面出發(fā)，優(yōu)選使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)解析PCR擴(kuò)增量的實(shí)時(shí)PCR。另外，作為實(shí)時(shí)PCR，可以列舉在本【技術(shù)領(lǐng)域】通常使用的方法，例如TaqMan探針法、嵌入劑法和環(huán)狀探針法等，而在本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用TaqMan探針法。
[0063]TaqMan探針法為在PCR反應(yīng)體系中加入5’末端用熒光物質(zhì)(FAM等)修飾、3’末端用猝滅物質(zhì)(TAMRA等)修飾后的寡核苷酸(TaqMan探針)的方法。
[0064]在本發(fā)明中，如上所述，被修飾的第一探針和第二探針能夠作為TaqMan探針使用，它在PCR反應(yīng)的退火步驟中與模板DNA特異性地雜交，但由于探針上存在猝滅物質(zhì)，所以即使照射激發(fā)光也會(huì)抑制熒光的發(fā)生。在延伸反應(yīng)步驟時(shí)，通過Taq DNA聚合酶具有的5’ 一3’核酸外切酶活性，與模板雜交的TaqMan探針被分解，則熒光物質(zhì)從探針游離，猝滅物質(zhì)的抑制被解除而發(fā)出熒光。
[0065]PCR的條件沒有特別限定，只要將每個(gè)PCR裝置設(shè)定為最佳條件即可，可以列舉例如以下的條件。
`[0066]I)雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的熱變性:通常以93~95°C左右、通常加熱10秒鐘~I分鐘左右。
[0067]2)退火:通常以50~60°C左右、通常加熱10秒鐘~I分鐘左右。
[0068]3) DNA延伸反應(yīng):通常以70~74°C左右、通常加熱30秒鐘~5分鐘左右。
[0069]其中，退火和DNA延伸反應(yīng)可以不分開而同時(shí)進(jìn)行。
[0070]通常通過進(jìn)行上述I)~3)的反應(yīng)30~50個(gè)循環(huán)左右，能夠?qū)⒛康膖cdA基因和tcdB基因擴(kuò)增到能夠檢測(cè)的程度。
[0071]另外，從靈敏度的觀點(diǎn)出發(fā)，上述Taqman探針在反應(yīng)液中的濃度優(yōu)選為100~1000nM 左右。
[0072]另外，在利用在PCR反應(yīng)體系中加入通過與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光的試劑(熒光嵌入劑)的嵌入劑法的情況，作為熒光嵌入劑，例如在SYBR Green1.SYBR GreenIKSYBRGold、噁唑黃、噻唑橙、溴化乙錠、PICO GREEN等公知的試劑的存在下進(jìn)行PCR，測(cè)定伴隨靶標(biāo)序列的擴(kuò)增而增加的熒光強(qiáng)度即可。
[0073]實(shí)時(shí)PCR能夠使用將熱循環(huán)儀和分光熒光光度計(jì)一體化的實(shí)時(shí)PCR專用裝置例如ABI PRISM7900HT sequence detection system (Applied Biosystems)進(jìn)行。
[0074]DNA量的測(cè)定能夠通過以下方法進(jìn)行。首先，將濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液階段性稀釋得到的溶液進(jìn)行PCR，以該初始的DNA量為橫軸，將以其為模板的PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到一定量時(shí)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle ;Ct值)繪制在縱軸上,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于未知濃度的試樣也在同樣的條件下進(jìn)行反應(yīng)，求出Ct值，根據(jù)該值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試樣中目的DNA量。
[0075]另外，菌數(shù)的定量能夠通過算出與供于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用的DNA量相當(dāng)?shù)木鷶?shù)值，以與DNA量的測(cè)定同樣的程序進(jìn)行。首先，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的制備中使用的菌株的純培養(yǎng)菌液中的菌數(shù)，從這些已知菌數(shù)實(shí)施DNA的提取，能夠得到與提取后的DNA溶液(標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液)所含的DNA量相當(dāng)?shù)木鷶?shù)值。因此，由于能夠算出與供于PCR的初始的DNA量相當(dāng)?shù)木鷶?shù)值，所以通過制作將橫軸換算成菌數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠同樣地算出未知濃度的試樣中所含的目的微生物的菌數(shù)值。
[0076]這樣，“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的(與DNA量相當(dāng)?shù)?菌數(shù)”，使用已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液和未知濃度的DNA試樣進(jìn)行PCR，達(dá)到一定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量時(shí)進(jìn)行“PCR循環(huán)數(shù)”(Ct值)的對(duì)比，就能夠求出濃度未知試樣中的“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的菌數(shù)”。其中，在這樣的對(duì)比中，從簡便性的方面出發(fā)，優(yōu)選使用表示作為PCR的模板的“目的微生物的菌數(shù)”與“Ct值”的相關(guān)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線通常以目的微生物的菌數(shù)作為橫軸、以Ct值作為縱軸而繪制制作的。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)使用的微生物可以使用模式株等公知菌株。
[0077]另外，被檢體中的目的微生物DNA量例如能夠通過可與目的微生物DNA特異性地雜交的核酸片段與被檢體試樣的雜交效率的信息求出。
[0078]這樣，根據(jù)本發(fā)明 的方法，能夠特異性地檢測(cè)TcdA毒素產(chǎn)生性C.difficile和TcdB毒素產(chǎn)生性C.difficile (實(shí)施例2)，另外如果每Ig糞便存在IO3個(gè)以上的C.difficile則能夠檢測(cè)其DNA (實(shí)施例3)，能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)。
[0079]此外，通過組合使用對(duì)C.difficiIe特異性的引物組、寡核苷酸探針，測(cè)定C.difficile的總菌數(shù),能夠準(zhǔn)確地掌握糞便中(腸內(nèi))的C.difficile的詳細(xì)情況(毒素產(chǎn)生性和非毒素產(chǎn)生性C.difficile相對(duì)于總菌數(shù)的存在比率)，能夠?qū)τ贑.difficile感染癥的診斷、臨床研究等作出貢獻(xiàn)。實(shí)施例
[0080]實(shí)施例1毒素產(chǎn)生性C.difficile的檢測(cè)
[0081][I]材料和方法
[0082](A)使用菌株和培養(yǎng)條件
[0083]C.difficile DSM1296T 從 Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen undZellkulturen GmbH (DSMZ, Germany)購買，ATCC43255、43596、43598、700057 從 AmericanType Culture Collection (USA)購買，NTCT13307、13366 從 Health Protection Agency(UK)購買，CCUG20309、37780、37785 從 Culture Collection University of Goteborg(Sweden)購買。C.difficile以外的Clostridium屬菌種全部從DSMZ購買。
[0084]所有的菌株使用1%葡萄糖添加改良GAM培養(yǎng)基(日水制藥)，在厭氧條件下以37°C培養(yǎng)24小時(shí)。菌液中的菌數(shù)測(cè)定通過DAPI染色法進(jìn)行。
[0085](B) TaqMan PCR 反應(yīng)
[0086]使用ABI79OOHT 系統(tǒng)進(jìn)行 TaqMan PCR15PCR使用 Takara ExTaq Hot Start Version(Takara)和 Ampdirect plus (shimadzu)。反應(yīng)液組成為 2XAmpdirect plus、引物 F/R0.2 μ M、TaqMan 探針 0.2 μ Μ、Rox Reference Dye> ExTaq DNA polymerase0.4Units 和模板DNA溶液5 μ L，總量設(shè)為20 μ L。以95°C 30秒將Taq酶活化后，進(jìn)行95°C 5秒、56°C 50秒的循環(huán)50次。
[0087](C) DNA提取用糞便樣品的制備
[0088]將使用RNAlater制備的10%糞便懸池液(w/v) 2mL (含有200mg糞便)進(jìn)行離心分離，除去上清lmL。添加磷酸緩沖生理食鹽水(PBS (_))lmL，用旋渦攪拌器(vortex)攪拌后，將離心分離得到的全部上清用傾析除去。添加PBS (-)lmL，用旋渦攪拌器攪拌后，除去離心分離得到的全部上清。將所得到的糞便顆粒在用于DNA提取之前保存于_80°C。
[0089](D) DNA 的提取
[0090]從培養(yǎng)菌液提取DNA按照松木等的方法(Matsuki，T.，K.ffatanabe, J.Fujimoto,Y.Kado, T.Takada, K.Matsumoto, and R.Tanaka.2004.Quantitative PCRwithl6S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of humanintestinal bifidobacteria.App1.Environ.Microbiol.70:167-173)進(jìn)行。
[0091]從幾便顆粒提取DNA 使用 FastDNA SPIN Kit for Feces (MP Biomedicals)。提取法的詳細(xì)內(nèi)容如下所示。
[0092]在裝有200mg 幾便顆粒的 2.0mL 試管(tube)中，添加 Lysing Matrix E、Sodiumphosphate buffer (憐酸鈉緩沖液)825 μ L 和 Pre-lysis solution275 μ L,用旋潤攬拌器攪拌10-15s。除去以14，OOOXg離心分離5min得到的上清，添加磷酸鈉緩沖液978 μ L和MT bufferl22 μ L進(jìn)行攪拌。用FastPrep level6.0劇烈振蕩45s,以14，000 X g離心分離15min。將上清回收至新的2.0mL試管,添加Protein precipitate solution (蛋白沉淀溶液)250 μ L，劇烈振蕩并`混合。在4°C靜置IOmin后，以14，OOOXg離心分離2min，將上清回收至15mL試管中。添加Binding matrixsolutionlmL輕柔混合后，在室溫孵育5min。除去以14，OOOXg離心分離2min得到的上清后,添加ImL Wash buffer-1,通過吹打輕柔地使顆粒重懸。將懸浮液約600 μ L移至SPIN filter tube，除去以14，000 X g離心分離Imin后的濾過液(Flow-through)。將剩余的懸浮液再次移至SPIN filter tube,除去以14，OOOX g離心分離Imin后的濾過液。添加0.5mL Wash buffer-2,通過吹打輕柔地使過濾器上的基質(zhì)重懸后，除去以14，000Xg離心分離2min后的濾過液。再次以14，OOOXg離心分離2min,將過濾器移至新的1.9mL catch tube。添加TESlOO μ L,輕輕敲打使基質(zhì)懸浮，回收以14，OOOXg離心分離2min得到的濾過液。
[0093][II]引物和探針的設(shè)計(jì)
[0094]以C.difficile的毒素基因tcdA和tcdB為靶標(biāo)，分別按照以下的程序設(shè)計(jì)特異性的引物和探針。使用從數(shù)據(jù)庫取得的20個(gè)菌株的tcdA基因序列(* I)和22個(gè)菌株的tcdB基因序列(* 2)，利用Clustal X進(jìn)行同源性檢索(比對(duì))。TcdA和TcdB被分類為Large Clostridial Toxin (LCTs),與一部分梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細(xì)菌產(chǎn)生的LCTs具有很高的同源性。因此，作為對(duì)照，將索氏梭菌的tcsL[X82638]、諾氏梭菌的tcnA[Z48636]、產(chǎn)氣莢膜梭菌的tcpL[AB262081]的基因序列一并用于比對(duì)。比對(duì)的結(jié)果，靶標(biāo)毒素基因與其他基因的同源性高，而且tcdA和tcdB在兩者的堿基序列間具有約60%的同源性，由此用引物制作用軟件沒能發(fā)現(xiàn)對(duì)于tcdA和tcdB各自的靶標(biāo)毒素基因的特異性的堿基序列。因此，通過目測(cè)確認(rèn)比對(duì)結(jié)果，通過試錯(cuò)，選擇對(duì)于靶標(biāo)基因特異性的且被認(rèn)為在菌株間保守性高的區(qū)域，設(shè)計(jì)了引物和探針(表1)。
[0095]* ItcdA 基因的 GenBank accession n0.:M30307, NC_009089, NC_013316，NC_013315, AJ011301, NZ_ADVM01000023, NZ_ABHF02000018, NZ_ABHE02000016, NZ_ABFD02000006,NZ_ABHD02000008,NZ_ABHG02000011, NZ_ABKK020000I 3，NZ_AAML04000007, NZ_ABKL02000008, FN668941, FN668375, FN665652, FN665653, FN665654, Y12616,AJ132669
[0096]* 2tcdB 基因的 GenBank accession n0.:M30307, Z23277, AJ011301, NC_009089, NC_013316, NC_013315, AF217292, NZ_ABHF02000018, NZ_ADVM01000023, NZ_ADNX01000011,NZ_ABHE02000016, NZ_ABHD02000008, NZ_ABFD02000006, NZ_ABKL02000008, NZ_ABKK02000013, NZ_ABHG02000011, NZ_AAML04000007, FN668941, FN668375，F(xiàn)N665652, FN665653, FN665654
[0097][表 I]
[0098]
【權(quán)利要求】
1.包括由序列號(hào)I所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
2.由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針。
3.如權(quán)利要求2所述的寡核苷酸探針，其特征在于: 在寡核苷酸的5’末端結(jié)合有突光物質(zhì),在3’末端結(jié)合有粹滅物質(zhì)。
4.一種實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組，其特征在于: 其具備權(quán)利要求1所述的引物對(duì)和權(quán)利要求3所述的寡核苷酸探針。
5.包括由序列號(hào)4所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或者由 與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)。
6.由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針。
7.如權(quán)利要求6所述的寡核苷酸探針，其特征在于: 在寡核苷酸的5’末端結(jié)合有突光物質(zhì),在3’末端結(jié)合有粹滅物質(zhì)。
8.一種實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組，其特征在于: 其具備權(quán)利要求5所述的引物對(duì)和權(quán)利要求7所述的寡核苷酸探針。
9.一種毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括: 以從人糞便提取的DNA為模板，使用權(quán)利要求4和/或權(quán)利要求8所述的寡核苷酸組分別進(jìn)行PCR的工序；和通過測(cè)定熒光來測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。
10.一種人糞便中的艱難梭菌中的毒素產(chǎn)生性艱難梭菌和/或非毒素產(chǎn)生性艱難梭菌的存在比率的計(jì)算方法，其特征在于，包括: 以從人糞便提取的DNA為模板，使用權(quán)利要求4和/或權(quán)利要求8所述的寡核苷酸組、以及以下所示的(a)的引物對(duì)或具備(a)的引物對(duì)和(b)的寡核苷酸探針的實(shí)時(shí)PCR用的寡核苷酸組，分別進(jìn)行PCR的工序；和通過測(cè)定熒光來測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的工序， Ca)包括由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物對(duì)、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的引物對(duì)； (b)由序列號(hào)9所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸探針、或由與該堿基序列對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列構(gòu)成的寡核苷酸探針，其中，在該寡核苷酸的5’末端結(jié)合有熒光物質(zhì)，在3’末端結(jié)合有猝滅物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103764850SQ201280042806
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月1日
【發(fā)明者】久保田博之, 牧野博, 酒井隆史, 石川英司, 大石憲司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社益力多本社