專利名稱：一種胰島素基因修飾的肝干細胞制法及其應(yīng)用和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝干細胞及其制備方法、該肝干細胞在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用、以及包括該肝干細胞的制劑。特別地，本發(fā)明涉及胰島素基因修飾的肝干細胞的制備方法和應(yīng)用，以及其胰島素基因修飾的肝干細胞及其制備方法、該胰島素基因修飾的肝干細胞在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用、制備該胰島素基因修飾的肝干細胞抗原負載的肝干細胞的制劑。
背景技術(shù)：
目前治療糖尿病的方法主要為傳統(tǒng)的治療方法有注射胰島素、口服降糖藥、控制飲食等，但往往最終患者造成胰島素依賴，目前也還無合適的治療手段。為了尋求更安全、 有效及高質(zhì)量的治療方法，各國學者在不斷地探索并尋找出更好的手術(shù)方法，提高糖尿病患者治療效果或控制糖尿病患者胰島素使用量。肝干細胞是一種來源于肝臟Herring狹隙和肝內(nèi)膽管的具有雙向分化潛能的細胞，能夠分化為肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞。由于肝臟和胰臟在胚胎發(fā)育時期，屬于同一發(fā)育胚層，在發(fā)育過程中兩者之間能相互轉(zhuǎn)化分化。已有研究表明肝干細胞能在體內(nèi)體外轉(zhuǎn)分化成胰島β細胞，在臨床上具有治療糖尿病的可能。楊立軍，等，成體肝干細胞向胰腺產(chǎn)生內(nèi)分泌激素的細胞的體外轉(zhuǎn)分化，美國國家科學院報，2002，99 (1 =8078-8083.現(xiàn)有技術(shù)中肝干細胞多數(shù)來源于流產(chǎn)胎兒的肝臟。我們選用骨髓、臍血或臍帶，通過體外分離純化，以及傳代培養(yǎng)，這就解決臨床應(yīng)用上來源的問題，和臨床上不能應(yīng)用異體細胞治療的倫理上問題?，F(xiàn)有技術(shù)僅公開了如何得到相關(guān)肝干細胞但并未教導對獲取的肝干細胞進行處理。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有以無論西醫(yī)還是傳統(tǒng)中醫(yī)，迄今為止在治療糖尿病上均局限于“降糖”上，對于激活、修復(fù)、再生損傷、硬化、萎縮的胰島β細胞均無良策。，本發(fā)明的目的是提供一種胰島素基因修飾的肝干細胞及其制備方法、在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用、以及制備該胰島素基因修飾的肝干細胞的制劑。本研究提供了一種以肝干細胞為目標，通過胰島素基因修飾制備成能分泌胰島素并分化為胰島β細胞的肝干細胞，在治療糖尿病應(yīng)用克服現(xiàn)有治療技術(shù)的不足和缺陷。其中，所述胰島素基因修飾的肝干細胞通過以下方法制備，該方法包括對肝干細胞進行克隆好的胰島素基因的腺病毒修飾的步驟，所述胰島素基因修飾的肝干細胞通過使肝干細胞與胰島素基因克隆載體電穿孔完成，所述載體選自由病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒和噬菌體所組成的組中。本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的胰島素基因修飾的肝干細胞。本發(fā)明還提供了一種胰島素基因修飾的肝干細胞制劑，所述肝干細胞制劑包括肝干細胞，其特征在于，所述肝干細胞為本發(fā)明所述的胰島素基因修飾的肝干細胞。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞制劑在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞的制劑，其中，所述制劑包括1)肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)胰島素基因；3)胰島素基因克隆的載體；4)生理鹽水；以及5)使用說明書；其中，所述胰島素基因克隆的載體選自由腺病毒、慢病毒所組成的組中；所述使用說明書包括本發(fā)明所述的肝干細胞的制備方法。由于本發(fā)明的肝干細胞經(jīng)過了胰島素基因克隆的載體的修飾，由此得到的肝干細胞產(chǎn)生了與肝干細胞不同的變化(比如特異表達了胰島素)，因此，由本發(fā)明提供的胰島素基因修飾的肝干細胞以及由該胰島素基因修飾的肝干細胞得到的制劑，能分泌胰島素并在體內(nèi)和體外分化為胰島β細胞，從而為糖尿病的根治提供了可能。


圖1為實施例1的肝干細胞形態(tài)；圖2為實施例1的肝干細胞表達AFP和SK19的熒光免疫圖片；圖3為實施例1的肝干細胞表達Nestin蛋白的熒光免疫圖片；圖4顯示胰島素基因修飾的肝干細胞表達胰島素蛋白電泳圖片；
圖5為胰島素基因修飾的肝干細胞在糖尿病動物模型中修復(fù)受損部位的修復(fù)。治療前后變化。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種胰島素基因修飾的肝干細胞的制備方法，其中，該方法包括對肝干細胞進行克隆好的胰島素基因的腺病毒修飾的步驟，所述胰島素基因修飾的肝干細胞通過使肝干細胞與胰島素基因克隆載體電穿孔完成，所述載體選自由病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒和噬菌體所組成的組中。優(yōu)選地，所述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為0. 1 40到 40 0. 1，所述電穿孔的時間為0.證-1池。更優(yōu)選所述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為1 2，所述電穿孔的時間為03h-2h。適當電穿孔比例有助于兩者產(chǎn)生更好的修飾細胞，并使肝干細胞僅含有一個胰島素基因克隆載體。本發(fā)明可以使用現(xiàn)有的載體選自由病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒和噬菌體所組成的組中。最優(yōu)選，所述載體選腺病毒、慢病毒所組成的組中。本發(fā)明適用于所有能夠從中分離出肝干細胞的來自由臍帶、骨髓、和臍帶血所組成的組中。其中，所述肝干細胞來自骨髓。本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的肝干細胞。肝干細胞在經(jīng)過本發(fā)明的制備后，所述肝干細胞的所表達的蛋白發(fā)生了變化。所述肝干細胞特異表達胰島素。反過來，通過檢測胰島素的在修飾前后的變化，可以檢測出所述修飾過程是否成功。
4
肝干細胞通常借用正常肝干細胞標志進行檢測。例如白蛋白、AFP等可確定細胞分化程度，是細胞標志的重要蛋白。。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞以及本發(fā)明的肝干細胞在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞的制劑，其中，所述制劑包括1)肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)胰島素基因；3)胰島素基因克隆的載體；4)生理鹽水；以及5)使用說明書；其中，所述胰島素基因克隆的載體選自由腺病毒、慢病毒所組成的組中；所述使用說明書包括本發(fā)明所述的肝干細胞的制備方法。其中，所述肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)肝干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述肝干細胞培養(yǎng)體系包括肝干細胞和3mL-50mL的肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在371、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為1 2，所述電穿孔的時間為03h-2h等。本發(fā)明還提供了一種肝干細胞制劑，其中，所述肝干細胞為本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞。在制備肝干細胞制劑之前，用生理鹽水洗滌并重懸所述胰島素基因修飾的肝干細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的肝干細胞制劑在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分不會引起患者不適即可。所述組合物包括1 X IO5到5 X IO7個/mL本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞；優(yōu)選為5 X IO5到1 X IO7 個/mL。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用。所述肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)肝干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述肝干細胞培養(yǎng)體系包括肝干細胞和lmL-100mL、優(yōu)選30_80mL的肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為1 2，所述電穿孔的時間為03h-2h等。本發(fā)明還提供了一種治療糖尿病的方法，其包括給患者施用選自由本發(fā)明的肝干細胞、本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞以及本發(fā)明的肝干細胞制劑所組成的組中的制劑。優(yōu)選所述施用的方式為介入注射。具體地，施用肝干細胞的方式選自由介入注射、靜脈注射、皮下注射和皮內(nèi)注射中的一種或幾種；所述肝干細胞優(yōu)選來自細胞濃度為 1 X IO5到1 X IO8細胞/mL的本發(fā)明的肝干細胞，其有效量為0. lmL-5mL/個體；所述肝干細胞制劑優(yōu)選包括1 X IO5到5 X IO7個/mL本發(fā)明的胰島素基因修飾的肝干細胞，其有效量為 0. lmL-2mL/ 個體。以上所述肝干細胞和所述肝干細胞制劑都是一次注射的劑量，一個療程三次注射，間隔一周。兩種肝干細胞一般在注射完第二針后的第三天到第七天起效。所述有效的標準是空腹血糖降低、胰島素注射用量減少等。一個療程結(jié)束后，可以間隔兩個月后繼續(xù)給藥，可以治療兩個或四個療程；如有必要，間隔時間為六個月或一年還可繼續(xù)再治療。其中，所述有效標準還可以分為以下兩個等級1.患者空腹血糖檢測對患者空腹血糖水平降低，可能檢測水平在正常范圍內(nèi)等。2.患者胰島素注射用量檢測每日監(jiān)測患者胰島素注射用量，以減少或停止為目標等。優(yōu)選所述肝干細胞和/或所述肝干細胞來自于同一患者，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應(yīng)造成的副作用。以下，對本發(fā)明的具體實施例進行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。實施例1 臍帶組織中的肝干細胞的分離和培養(yǎng)臍帶組織來自孕婦生產(chǎn)后采集的臍帶。與該患者簽署了知情同意書，在其生產(chǎn)后采集其臍帶。用眼科剪將其剪碎成為約Imm3的小塊。所得剪碎的組織小塊用0.25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量體積比消化5分鐘后，加入是胰酶溶液體積五分之一的小牛血清(美國Hyclone公司)終止，以IOOOrpm離心收集消化好的組織小塊，傾去胰酶溶液上清， 然后0. 01 % DNAse (DNA酶，上海生工)的HBSS (漢斯緩沖液，上海生工)以1克ImL的重量體積比洗滌三次，所得離心沉淀用0. 25%胰酶溶液以1克ImL的體積比在37°C下混勻接觸10分鐘，然后在IOOOrpm下離心5min收集細胞，用以1克ImL的重量體積比用杜爾貝可改良伊格爾-F12培養(yǎng)基重懸。所得重懸液用40-mm分子篩(美國BD公司)過濾。用所述孔徑的分子篩過濾，截留的是大片細胞碎片和未被消化的細胞團，濾出的是細胞懸液。收集剩余的所述細胞懸液后，向其中含有10%小牛血清、40ng/mL人表皮生長因子(印idermal growth factor，EGF)、40ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bEGF)和 30mg/mL 胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12 (Dulbecco，s modified Eagle，s medium_F12) (DMEM/ F12)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)使細胞懸液濃度被稀釋為2X105細胞/mL。然后將每5mL 所得稀釋的細胞懸液轉(zhuǎn)移至25cm2滅菌塑料培養(yǎng)瓶中在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。培養(yǎng)所得細胞呈神經(jīng)球狀生長，傾去培養(yǎng)基，然后用5mLHBSS洗滌一次，傾去洗滌液。所述洗滌過程去掉了懸浮的細胞碎片和未貼壁生長的細胞。并添加新鮮的含有10% 小牛血清、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾_F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90%時， 用Accutase消化后，用含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12 (DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)(1瓶傳幾個瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細胞密度為2 X IO5細胞/mL)。按照上述傳代條件再傳 4代，得到貼壁的細胞。取1瓶培養(yǎng)到5代的肝干細胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImLl XPBS重懸， 計數(shù)。取1份50yU2X106個)上述的傳代得到細胞懸液分別在六孔板中生長，后用ALB、 K19、AFP、Nestin等抗體進行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，大多數(shù)的肝干細胞表達為陽性。實施例2 從骨髓和臍帶血中培養(yǎng)的肝干細胞骨髓或臍血來源的處理過程經(jīng)FicolI-Hypaque密度梯度離心，中分離單個細胞后，細胞記數(shù)，加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)為完全培養(yǎng)基，含表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，堿性表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，以及含胎牛血清5% -15%的DMEM/F12(1 1)。按1-5X105細胞/cm2的密度種植于75cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶加入培養(yǎng)液為10ml。將培養(yǎng)瓶蓋口擰緊，然后內(nèi)旋1圈，放入患者專用培養(yǎng)箱，370C，5% C02培養(yǎng)，培養(yǎng)第三天，半量換液。 換液時將培養(yǎng)液緩慢吸出，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，每瓶加入5ml，370C，5% C02培養(yǎng)。當細胞貼壁達到80-90 %時，將細胞通過用胰酶或阿庫替斯酶消化，離心收集后進行培養(yǎng)，為完全培養(yǎng)基，含表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，堿性表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，以及胎牛血清5%-15%的DMEM/F12(1 1)。同樣當細胞貼壁達到80-90%時，進行消化傳代培養(yǎng)。取1瓶培養(yǎng)到5代的肝干細胞胞，經(jīng)胰酶消化，離心后細胞沉淀用ImLlXPBS重懸，計數(shù)。取1份50yU2X106個)上述的傳代得到細胞懸液分別在六孔板中生長，后用 ALB、K19、AFP、NeStin等抗體進行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，大多數(shù)的肝干細胞表達為陽性。實施例3 胰島素基因克隆腺病毒修飾肝干細胞的制備取構(gòu)建好的胰島素基因克隆腺病毒(美國htrogen公司)與肝干細胞以1 2 比例，通過電穿孔1小時，將胰島素基因克隆腺病毒植入肝干細胞中。電穿孔完之后，將胰島素基因修飾肝干細胞在DMEM/F12(1 1)完全培養(yǎng)基(含表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，堿性表皮生長因子為5ng/ml-50ng/ml，以及胎牛血清 5% -15% )中培養(yǎng)，使細胞貼壁生長達到80-90%。應(yīng)用胰島素ELISA試劑盒(美國R&D 公司)檢測胰島素基因修飾肝干細胞表達胰島素情況。實施例4 胰島素基因修飾的肝干細胞在糖尿病模型中應(yīng)用以含10%小牛血清的DMEM/F12(1 1)為培養(yǎng)基，將3 X IO6個的肝干細胞用上述實施例3所得的胰島素基因修飾的肝干細胞(得自IX IO6肝干細胞)。將所述胰島素基因修飾的肝干細胞用生理鹽水洗滌3次然后重懸至IX IO6個/mL的濃度，4°C下保存?zhèn)溆?。建立糖尿病鼠模型，隨機分為A、B和C 3組，每組10只，A組為胰島素基因修飾的肝干細胞治療組，B組為肝干細胞為對比組(注射液制備方法與A組相同)，C組為同體積生理鹽水空白組。A和B兩組在第0天鼠模型肝動脈輸注0. 5-2 X IO6個/mL肝干細胞，各 0. 5mL，半個月后再同樣劑量免疫1次。注射后分別于7、14、21、28d監(jiān)測鼠模型血糖水平， C組于相同時間點在肝動脈輸注0. 5mL生理鹽水并計算鼠模型血糖大小。胰島素基因修飾的肝干細胞對糖尿病鼠模型的血糖情況(mmol/L，x±s)見表1。表 1
組別血糖水平治療前治療后7d治療后Hd治療后21d治療后28d治療組17.310.39.2±3.6*4.3±1.”3.4±1.3#3.2 士 1·3λ對比組18.9:1:0.514.2±1.4*7.2±1.2*6.2±1.2#6.5士1.1#空白組16.5:10.718.2±2.317.1±1.616.8±1.718.3±2.1注空白組與肝干細胞治療組相比P遠小于0. 01 ；#對比組與肝干細胞治療組相比 P < 0. 01。此外，有關(guān)實施例2所得胰島素基因修飾的肝干細胞的體內(nèi)減低血糖活性，遠遠好于有關(guān)制備例1中的肝干細胞。
權(quán)利要求
1.一種胰島素基因修飾的肝干細胞制備方法，該方法包括通過臍帶、骨髓或臍帶血分離得到肝干細胞，將克隆胰島素基因的腺病毒修飾肝干細胞得到胰島素基因修飾的肝干細胞，其特征在于，所述肝干細胞通過以下方法制備，該方法包括對肝干細胞進行克隆好的胰島素基因的腺病毒修飾的步驟，所述胰島素基因修飾的肝干細胞通過使肝干細胞與胰島素基因克隆載體電穿孔完成， 所述載體選自由病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒和噬菌體所組成的組中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為0.1 40到40 0. 1，所述電穿孔的時間為0.證-1 1。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述肝干細胞與胰島素基因克隆載體中的比例范圍為1 5，所述電穿孔的時間為0jh-5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體選自由病毒載體、脂質(zhì)體、質(zhì)粒和噬菌體所組成的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體選腺病毒、慢病毒所組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述肝干細胞來自由臍帶、骨髓、和臍帶血所組成的組中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述肝干細胞來自骨髓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝干細胞表達胰島素，并能在體內(nèi)體外分化成胰島β細胞。
9.由權(quán)利要求1-18中任意一項所述的方法得到的胰島素基因修飾的肝干細胞。
10.一種肝干細胞制劑，所述肝干細胞制劑包括肝干細胞，其特征在于，所述肝干細胞為權(quán)利要求13所述的胰島素基因修飾的肝干細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制劑，其中，所述制劑包括1X IO5到5 X IO7個/mL所述胰島素基因修飾的肝干細胞。
12.權(quán)利要求17所述的胰島素基因修飾的肝干細胞在治療糖尿病制劑中的應(yīng)用。
13.一種制備權(quán)利要求12所述的胰島素基因修飾的肝干細胞的制劑，其特征在于，所述制劑包括1)肝干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)胰島素基因；3)胰島素基因克隆的載體；4)生理鹽水；以及5)使用說明書；其中，所述胰島素基因克隆的載體選自由腺病毒、慢病毒所組成的組中；所述使用說明書包括權(quán)利要求1-12中任意一項所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種胰島素基因修飾的肝干細胞制備方法及其在制備糖尿病制劑中的應(yīng)用，以及包括該胰島素基因修飾的肝干細胞的制劑。本發(fā)明還包括胰島素基因修飾的肝干細胞的制備方法和應(yīng)用。由本發(fā)明提供的胰島素基因修飾的肝干細胞制備的制劑，能夠在體內(nèi)修復(fù)糖尿病中損傷的胰島β細胞，分泌出胰島素，從而為克服糖尿病依賴胰島素治療，根治糖尿病的治療提供了可能。
文檔編號A61K35/14GK102154210SQ20101060883
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者沈達青 申請人:沈達青