專利名稱：中藥通關(guān)藤提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
中藥通關(guān)藤提取物及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于中藥提取物及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中藥通關(guān)藤提取物及其 制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
全球攜帶乙肝病毒人數(shù)為3. 5億，丙肝的感染人數(shù)也達到了 1.5億。在我國，乙肝 感染率約為10%，而感染丙肝的人約有4000萬。以上數(shù)據(jù)可見，丙肝感染群體也十分龐大， 不容忽視。
在乙肝的治療上，我國取得的成績很大，乙肝病毒的人群感染率下降也很快，但是 從絕對的數(shù)字來看，還依然龐大，即使按照現(xiàn)在的7. 18%算，我們?nèi)珖€有將近9千多萬個 乙肝表面抗原攜帶者，這些人群當(dāng)中有一部分已經(jīng)是慢性乙肝病人，有的人可能已經(jīng)進展 到肝硬化，甚至有少部分人可能還有原發(fā)性肝癌。根據(jù)國外和我國港臺地區(qū)的資料顯示，當(dāng) 然也有一部分大陸的資料，慢性乙肝感染者，也就是表面抗原陽性的患者，最終大概有四分 之一會發(fā)展到肝硬化，這個從絕對數(shù)字上來看是很大的，所以乙肝病毒的社會危害也是不 容忽視的。
而丙肝又有它的特點，一旦感染以后85%左右會變成慢性化，如果成人感染乙肝 慢性化率只有5%，而感染丙肝的慢性化率是85%，這個比例非常高，所以丙肝不治療大多 數(shù)都會變成慢性化，所以對丙肝的及時診斷和治療就更重要了。丙肝每年大概有10%到 15%會發(fā)展成為肝硬化，有到7%會發(fā)展成為肝癌，這個比例挺高的，而恰恰這一點被 我們忽略了。
現(xiàn)在為止國內(nèi)外公認(rèn)的抗病毒藥物主要是兩類，一類是干擾素，一類是口服的核 苷類藥物。干擾素類又分兩種，一種普通的干擾素，一種是長效的干擾素，核苷類藥物大概 有四五種，兩大類總共加起來七八種藥物。
這兩類藥物各有千秋，各有優(yōu)缺點，療效也不一樣，比如干擾素類，不僅有抗病毒 作用，同時也有免疫調(diào)節(jié)作用，它的優(yōu)點體現(xiàn)在有比較高的e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換，就是老百姓 說的大三陽轉(zhuǎn)成小三陽，并且有效后療效會比較持久
—般國內(nèi)外的指南認(rèn)為，如果慢性乙肝患者轉(zhuǎn)氨酶水平比較高，DNA水平不是很 高，病人又比較年輕，這樣首先可以考慮干擾素治療，有可能取得比較好的療效，盡量優(yōu)先 考慮長效干擾素，希望通過有限的療程，比如一年、一年半或者兩年，能夠?qū)崿F(xiàn)e抗原血清 學(xué)轉(zhuǎn)換，停藥后病人能夠比較穩(wěn)定，可以避免長期服藥。因此干擾素仍是慢性病毒性肝炎治 療的首選藥物之一，但是慢性乙型肝炎患者在使用干擾素抗病毒治療過程中出現(xiàn)白細胞減 少。因此急需一種藥物來替代目前的干擾素對肝病進行治療。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供了 一種治療肝炎的中藥通關(guān)藤提取物。
本發(fā)明的另一個目的是提供了這種中藥通關(guān)藤提取物的制備方法。3
本發(fā)明的第三個目的在于提供了這種中藥通關(guān)藤提取物在制備抗乙型肝炎病毒、 降低轉(zhuǎn)氨酶水平和調(diào)節(jié)免疫藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種中藥通關(guān)藤提取物，其特征在于，所述中藥提取物包含通關(guān)藤的有效部位總 酚酸和總皂苷，通過下述(i)和(ii)兩種不同路徑獲得
(i)、將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加4 20倍量、濃度為60% 90%的乙醇、回流提 取1 3次，每次提取1 3小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；
或(ii)、對原料藥通關(guān)藤中的總酚酸和總皂苷分別提取，然后將總酚酸和總皂苷 混合，獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；其中總酚酸是通過用10% 95%乙醇加熱 回流提取或超聲提取獲得；總皂苷是通過溶劑法、沉淀法、膽留醇沉淀法或二相酸水解法中 的一種提取獲得。
上述技術(shù)方案中所述的中藥通關(guān)藤提取物，其中，所述途徑(i)中的提取物是通 過將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加6 20倍量、濃度為60% 80%的乙醇、回流提取3次，每次 提取2小時獲得；
所述途徑(ii)中總酚酸在10% 95%乙醇超聲提取后進行大孔樹脂精制獲得。
上述技術(shù)方案中所述的中藥通關(guān)藤提取物，其中，所述途徑(i)中的提取物是通 過將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加20倍量、濃度為60%的乙醇、回流提取3次，每次提取2小時獲得。
上述技術(shù)方案中所述的中藥通關(guān)藤提取物在制備抗乙型肝炎病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶水 平和調(diào)節(jié)免疫藥物中的應(yīng)用。
上述技術(shù)方案中所述的中藥通關(guān)藤提取物的制備方法，通過下述(i)和(ii)兩種 不同路徑獲得，其中
(i)、將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加10 20倍量、濃度為60% 90%的乙醇、回流提 取1 3次，每次提取1 3小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；
或(ii)、對原料藥通關(guān)藤中的總酚酸和總皂苷分別提取，然后將總酚酸和總皂苷 混合，獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；其中總酚酸是通過用10% 95%乙醇加熱 回流提取或超聲提取獲得；總皂苷是通過溶劑法、沉淀法、膽留醇沉淀法或二相酸水解法中 的一種提取獲得。
上述技術(shù)方案中所述的制備方法，其中，所述途徑(i)中的提取物是通過將原料 藥通關(guān)藤粉碎后，加15 20倍量、濃度為60% 80%的乙醇、回流提取3次，每次提取2 小時獲得；
所述途徑(ii)中總酚酸在10% 95%乙醇超聲提取后進行大孔樹脂精制獲得。
上述技術(shù)方案中所述的制備方法，其中，所述途徑(i)中的提取物是通過將原料 藥通關(guān)藤粉碎后，加20倍量、濃度為60%的乙醇、回流提取3次，每次提取2小時獲得。
本發(fā)明的中藥通關(guān)藤提取物還可以添加藥學(xué)上可接受的載體，按照本領(lǐng)域的技術(shù) 方法制備成合劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、丸劑、貼劑、膏劑、酊劑、錠劑、醑劑、栓齊U、 涂膜劑、注射劑等各種劑型，應(yīng)用于抗乙型肝炎病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶水平、調(diào)節(jié)免疫、代謝綜合 征等。
中藥有效部位，是指當(dāng)一味中藥或復(fù)方中藥提取物中的一類或幾類化學(xué)成分的含量達到總提取物的50%以上，而且這一類或幾類已知化學(xué)成分被認(rèn)為是有效成分，該一類 或幾類成分的混合體即被認(rèn)為是有效部位。
本發(fā)明具有以下有益效果
所制備的含有有效部位總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物能有效預(yù)防白細胞減少 并有減輕骨髓抑制的作用，無明顯毒副作用，經(jīng)濟、方便。其主要成分留體皂苷類成分和酚 酸類成分，這些成分具有抗誘變、抗菌、抗病毒等作用，而酚酸類物質(zhì)除具有殺死癌細胞的 功能外，還有使人肝癌細胞、人胃腺癌細胞和人肺腺癌細胞向正常細胞逆轉(zhuǎn)的作用；并具有 較好的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用。
具體實施方式
為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說 明。
實施例1 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，加4倍量、濃度為90%的乙醇、回流提取1次，每次 提取1小時，獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例2 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，加20倍量、濃度為60%的乙醇、回流提取3次，每次 提取2小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例3 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，加6倍量、濃度為75%的乙醇、回流提取2次，每次 提取2小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例4 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，用10 %乙醇加熱回流提取或超聲提取獲得含有效 成分總酚酸的提取物；
對回流提取后的藥渣通過溶劑法進行提取，具體為使用甲醇或稀乙醇作溶劑進 行粗提，提取液經(jīng)回收溶劑后，用水稀釋，再經(jīng)正丁醇萃取或大孔吸附樹脂純化，得粗皂苷 后，再用硅膠柱色譜法進行分離獲得含有效成分總皂苷的提取物；
將獲得的含有效成分總酚酸和總皂苷的提取物進行混合，得到含有效成分總酚酸 和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例5 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，用95%乙醇超聲提取，獲得含有效成分總酚酸的提 取物；
對實施例4中獲得的粗皂苷采用沉淀法進行提取，具體為將粗皂苷溶于少量甲 醇或乙醇中，逐滴加入乙醚、丙酮或乙醚一丙酮(1 1)混合物，勻后析出的沉淀劑為含有 效成分總皂苷的提取物，繼續(xù)加入乙醚即可得到純度較高的含有效成分總皂苷的提取物；
將獲得的含有效成分總酚酸和總皂苷的提取物進行混合，得到含有效成分總酚酸 和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例6 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，用60 %乙醇超聲提取后，采用大孔樹脂精制，獲得5含有效成分總酚酸的提取物；
對實施例4中獲得的粗皂苷采用膽留醇沉淀法進行提取，具體為將粗皂苷溶于少 量乙醇中，加入膽甾醇飽和乙醇溶液，利用利用甾體皂苷可與膽甾醇生成難溶性的分子復(fù) 合物而得到沉淀，過濾后得沉淀依次經(jīng)過水、醇、乙醚洗滌以除去糖類、色素、油脂和游離的 膽甾醇，經(jīng)過干燥后用乙醚提取出膽留醇，得到的殘留物即為較純的含有效成分總皂苷的 提取物。
將獲得的含有效成分總酚酸和總皂苷的提取物進行混合，得到含有效成分總酚酸 和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
實施例7 通關(guān)藤提取物的制備
稱取原料藥通關(guān)藤，粉碎過篩，用60 %乙醇超聲提取后，采用大孔樹脂精制，獲得 含有效成分總酚酸的提取物；
對實施例4中獲得的粗皂苷采用二相酸水解法進行提取，使生成的苷元能進入有 機相溶劑中而減少苷元與酸的接觸時間，避免了苷元的破壞。含有效成分總皂苷的提取物。
將獲得的含有效成分總酚酸和總皂苷的提取物進行混合，得到含有效成分總酚酸 和總皂苷的通關(guān)藤提取物。
以下通過本發(fā)明所述的通關(guān)藤提取物的藥效學(xué)試驗來進一步闡述本發(fā)明所具有 的有益效果。
試驗例一通關(guān)藤提取物對肝損傷的作用
分別以10.54、5.27、2.63g生藥/kg體重的高、中、低三個劑量灌胃給予小鼠。
1、實驗材料
1. 1受試藥物
本發(fā)明所述的通關(guān)藤提取物，1克浸膏約相當(dāng)于2. 70g生藥。
1. 2劑量設(shè)計
通關(guān)藤提取物臨床人日用量為36 45g生藥，取中值為40. 5g，試驗用劑量按動 物與人公斤體重折算(簡略法大鼠按200g，系數(shù)0. 018 ；小鼠按20g，系數(shù)0. 0026)，中劑 量約相當(dāng)于人臨床等效劑量，再按1/2和2倍臨床劑量各設(shè)一個劑量組。大鼠灌胃劑量為 7. 30,3. 65、1. 82g生藥/kg，小鼠灌胃劑量為10. 54,5. 27,2. 63g生藥/kg。給予2. 2. 15細胞 藥物劑量以出現(xiàn)細胞毒性以下2個劑量級為最高給藥濃度，5個稀釋度分別為4、2、1、0.5、 0.25g/L0
1. 3藥品與試劑
護肝片，黑龍江省五常葵花藥業(yè)有限公司，批號20080631 ；動物給藥劑量按動 物與人公斤體重折算，大鼠臨床等效劑量為0. 4g/kg(ig)，小鼠為0. 6g/kg(ig)。鹽酸左 旋咪唑(左旋咪唑)，山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號080702 ；注射用環(huán)磷酰胺批號 20070102，山西普德藥業(yè)有限公司。小鼠為40mg/kg(ig)。聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠， 批號08030202 ；橄欖油，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號F20081006 ；人參皂甙；印度 墨汁，為北京Solarbio公司產(chǎn)品；ANIT(Alfa Aesar，lot 10137323)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、總膽紅素(TBIL)均為北京北化精細化學(xué)品有限公司 臨床診斷試劑分廠產(chǎn)品；Na+-K+-ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、MDA測定試劑 盒、SOD測定試劑盒(均為南京建成科技有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號20090807)；白細胞介素66(IL-6)放免檢測試劑盒，由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供，批號080225 ；其余試 劑皆為分析純。
1. 4 儀器
BS120全自動生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；安捷倫-8453紫外 分光光度計(美國惠普公司)；SN-695B型放免γ測量儀(上海日環(huán)儀器一廠)；TGL-16C 離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。
1. 5實驗動物
SPF級昆明種小鼠，18 22g。由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提 供，許可證號[SCXK-(軍)，2007-004]。
1. 6檢測指標(biāo)及方法
血清ALT、AST活性、IL_6含量及肝組織SOD活性和MDA含量均按試劑盒說明書操 作。肝組織病理學(xué)觀察40g/L甲醛溶液固定肝組織，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木素伊紅(HE) 染色，光鏡下觀察、拍照。
1. 7統(tǒng)計學(xué)處理軟件
SPSS公司SPSS for Windows 17.0。采用單樣本方差分析統(tǒng)計方法，各組之間采 用最小二乘法進行兩兩比較。
2方法與結(jié)果
取小鼠，隨機分為六組，正常對照組、模型對照組、護肝片組、通關(guān)藤提取物高、中、 低三個劑量組。每組10只，灌胃給藥，每次0. 5ml/只，每天1次，正常對照組同法給蒸餾水， 連續(xù)一周。除正常對照組外，于末次給藥后lh，每組ip 0. 1% CCl4S油溶液，禁食1 后， 小鼠眼眶取血，分離血清，測定ALT和AST。取新鮮左葉肝組織精密稱定0. 2g，加入9倍量 的生理鹽水在冰浴中勻漿，勻漿液以4000r/min離心lOmin，取上清液，按試劑盒說明書測 定SOD的活性和MDA的含量。另剪下肝臟一小部分放入10%福爾馬林溶液中固定，制作病 理切片。
表1通關(guān)藤提取物對四氯化碳致小鼠肝損傷的影響
組別動物數(shù)(只)ALT (u/L)AST (u/L)SOD (nmol/mgprot)MDA (u/mgprot)正常對照組1034. 3±3. 6126. 1±16. 223. 55±2. 894. 18±1. 90模型組10625. 6±226. 9##543. 5±218. 9##30. 51 ±6. 96**7. 00 ±2. 29**護肝片組10480. 4±157. 4**380. 4±95. 6**'*46. 09 ±6. 04**'**7. 40 ±1. 93*通關(guān)藤提取物高10459. 7±210. 9##'*352. 9±124. 1##,**44. 26 ±7. 62**'**5. 43±2. 03通關(guān)藤提取物中10472. 9±127. 5**'*418. 4±152. 9##42. 93 ±4. 23**'**6. 08±2. 32*通關(guān)藤提取物低10494. 4±155. 6**514. 1±153. 8**37. 04 ±3. 82**6. 79 ±1. 59**Oz 102028726 A 〔0075〕 ^mf ^WN^ Λ 0. 05 Sp Λ 0. 01 ；此滿陛降民鵁 *ρ Λ 0. 05 **ρ Λ O-Or
結(jié)果表明通關(guān)藤提取物高、中劑量組對CCl4引起ALT、AST和MDA升高有明顯的 降低作用。通關(guān)藤提取物低劑量組有較為明顯的降低小鼠血清中ALT、AST和MDA含量的趨 勢。通關(guān)藤提取物高、中、低三個劑量組可顯著性提高CCl4小鼠肝臟中SOD含量。
2.2本發(fā)明提取物的免疫作用
2.2.1 ^mnmimiA^mmm^mtimmm (A^ummmitm)
選用昆明種小鼠20-24g/只，全雄60只，每組12只，按表2分組給藥，每天灌胃1 次，連續(xù)7天，末次后30分鐘尾靜脈注射10%印度墨汁0. lml/10g，于30秒、5分鐘眼眶后 靜脈取血20 μ 1，加入到盛有2ml0. 1% Na2Co3溶液的試管中，搖勻，于波長675nm測定光密 度，稱肝、脾重量，計算吞噬指數(shù)K和吞噬系數(shù)a。結(jié)果如表2。
表2本發(fā)明提取物對小鼠單核細胞吞噬功能的影響
權(quán)利要求
1.中藥通關(guān)藤提取物，其特征在于，所述中藥提取物包含通關(guān)藤的有效部位總酚酸和 總皂苷，通過下述⑴和(ii)兩種不同路徑獲得(i)、將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加4 20倍量、濃度為60% 90%的乙醇、回流提取1 3次，每次提取1 3小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；或(ii)、對原料藥通關(guān)藤中的總酚酸和總皂苷分別提取，然后將總酚酸和總皂苷混合， 獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；其中總酚酸是通過用10% 95%乙醇加熱回流 提取或超聲提取獲得；總皂苷是通過溶劑法、沉淀法、膽留醇沉淀法或二相酸水解法中的一 種提取獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥通關(guān)藤提取物，其特征在于所述途徑(i)中的提取物 是通過將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加6 20倍量、濃度為60% 80%的乙醇、回流提取3次， 每次提取2小時獲得；所述途徑(ii)中總酚酸在10% 95%乙醇超聲提取后進行大孔樹脂精制獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中藥通關(guān)藤提取物，其特征在于所述途徑(i)中的提 取物是通過將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加20倍量、濃度為60%的乙醇、回流提取3次，每次提 取2小時獲得。
4.權(quán)利要求1 3中任一權(quán)利要求所述的中藥通關(guān)藤提取物在制備抗乙型肝炎病毒、 降低轉(zhuǎn)氨酶水平和調(diào)節(jié)免疫藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1中所述中藥通關(guān)藤提取物的制備方法，通過下述⑴和(ii)兩種不同路 徑獲得，其中(i)、將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加10 20倍量、濃度為60% 90%的乙醇、回流提取 1 3次，每次提取1 3小時獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；或(ii)、對原料藥通關(guān)藤中的總酚酸和總皂苷分別提取，然后將總酚酸和總皂苷混合， 獲得含總酚酸和總皂苷的通關(guān)藤提取物；其中總酚酸是通過用10% 95%乙醇加熱回流 提取或超聲提取獲得；總皂苷是通過溶劑法、沉淀法、膽留醇沉淀法或二相酸水解法中的一 種提取獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述途徑(i)中的提取物是通過將 原料藥通關(guān)藤粉碎后，加15 20倍量、濃度為60% 80%的乙醇、回流提取3次，每次提 取2小時獲得；所述途徑(ii)中總酚酸在10% 95%乙醇超聲提取后進行大孔樹脂精制獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于所述途徑(i)中的提取物是通 過將原料藥通關(guān)藤粉碎后，加20倍量、濃度為60%的乙醇、回流提取3次，每次提取2小時
全文摘要
本發(fā)明中藥通關(guān)藤提取物及其制備方法和應(yīng)用，屬于中藥提取物及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域。其中包含通關(guān)藤有效部位總酚酸和總皂苷的提取物可以是通過乙醇回流提取獲得，也可以是分別提取含總酚酸的提取物和含總皂苷的提取物，然后混合而成。本發(fā)明的中藥通關(guān)藤提取物可以制備抗乙型肝炎病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶水平和調(diào)節(jié)免疫的藥物。本發(fā)明具有保肝降酶作用，對由CCl4引起的動物肝損傷，具有一定的保護作用，同時還可在適當(dāng)劑量范圍內(nèi)可提高非特異性免疫功能。
文檔編號A61P31/20GK102028726SQ20101059896
公開日2011年4月27日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉峰群, 周旭, 張詩龍, 韓晉 申請人:中國人民解放軍第三○二醫(yī)院