專利名稱：重組人Prx-6蛋白在治療燒燙傷方面的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及重組人I^rx-6蛋白在治療燒燙傷方面的用途。
背景技術(shù)：
燒燙傷是常見病，多發(fā)病，也是致殘率較高的創(chuàng)傷性疾病。輕者也給傷者帶來(lái)很大痛苦，重者常常損害器官功能，給患者的工作和生活造成很大的不便，同時(shí)因?yàn)闊隣C傷較多發(fā)生在人的暴露部位，愈合后的疤痕毀壞傷者的容貌，還會(huì)給患者的心理造成不良影響，因此，對(duì)中輕度的燒/燙傷則要盡量縮短愈合期，減少病人痛苦，并盡量減少疤痕形成。對(duì)嚴(yán)重?zé)隣C傷者應(yīng)盡量減少再灌注引起的各種臟器損傷及繼發(fā)感染等并發(fā)癥。目前臨床治療燒傷常采用的方法，一般是在進(jìn)行創(chuàng)面早期處理后，采用包扎療法或采用暴露療法進(jìn)行治療。無(wú)論采用哪種方法，在早期清創(chuàng)時(shí)，都要進(jìn)行創(chuàng)面抗感染處理， 清創(chuàng)所選用的抗感染藥物主要有三類一是中草藥制劑，如四季青、毛冬青、黃連、黃柏等； 二是化學(xué)藥物制劑，如雙氧水、新潔爾滅、甲磺滅膿；三是抗生素制劑如青霉素、慶大霉素。 由于大多數(shù)藥物均可從創(chuàng)面吸收，大面積使用這些藥物，尤其濃度過(guò)大或使用粉劑時(shí)常常可引起中毒或內(nèi)臟損害。再者這些藥物一般都有一定的刺激性，在使用時(shí)常常會(huì)給患者增加痛苦。Peroxiredoxins(Prxs)是新近發(fā)現(xiàn)的一類非硒依賴過(guò)氧化物酶家族蛋白，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。根據(jù)I^rxs蛋白保守cys個(gè)數(shù)的不同(1個(gè)或2個(gè))，可分為I-Cys或 2-Cys亞類。迄今，已在哺乳動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)了 6種I^rxs蛋白。其中I^rxl-5為2_Cys酶， 以硫氧還蛋白作為電子供體；Prx-6蛋白是哺乳動(dòng)物中唯一的I-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH) 為電子供體(還原劑)。Prx-6蛋白首先是在牛眼睫狀體中被分離獲得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara 細(xì)胞蛋白26、p67吞噬細(xì)胞氧化酶(phox)結(jié)合蛋白、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)調(diào)節(jié)基因 1等，由2M個(gè)氨基酸組成，分子量為25. IKDa0分析該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由80 個(gè)氨基酸組成的硫氧還蛋白折疊，其中包含四個(gè)β折疊和兩個(gè)α螺旋。大量研究表明，硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)在一些參與氧化還原反應(yīng)的蛋白(如硫氧還蛋白、谷氧還蛋白、GPxl蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等)中普遍存在。另外，盡管和 GPxl蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)只有17%的同源性，但是它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有極高的同源性。這種結(jié)構(gòu)上的相似性，預(yù)示著這兩種蛋白在功能上的相關(guān)。從初期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到近年來(lái)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，越來(lái)越多的研究證明了 Prx-6蛋白具有抗氧化損傷功能。細(xì)胞水平的研究表明，過(guò)表達(dá)蛋白能明顯減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用，降低細(xì)胞質(zhì)膜損傷；抑制Prx-6蛋白的表達(dá)，可觀察到明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化、脂膜損傷及細(xì)胞凋亡?；铙w水平研究表明，Prx-6轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)高氧損傷有顯著的保護(hù)作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化損傷能力明顯降低。但是，這些研究主要是關(guān)于蛋白在心臟、肺或皮膚組織中的抗氧化損傷作用，并未涉及到蛋白在治療燒燙傷方面的用途。
綜上所述，目前尚缺乏令人滿意的治療燒燙傷的藥物，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的能夠用于治療燒燙傷的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組人蛋白在治療燒傷和燙傷方面的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種蛋白在制備治療燒燙傷的藥物中的用途。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白或其與表達(dá)標(biāo)簽(如6-His)形成的融合蛋白。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于治療燒燙傷的藥物組合物，所述的藥物組合物含有Prx-6蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體，并且所述的藥物組合物為外用制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白是人蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的外用制劑是膏劑、噴霧劑、或滴劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有其他治療燒燙傷的藥物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種治療燒燙傷的方法，包括步驟對(duì)需要治療的對(duì)象，在燒燙傷的創(chuàng)面上施用Prx-6蛋白蛋白或本發(fā)明第二方面中所述的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的治療包括促進(jìn)傷口愈合和減少創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物(包括人)。在另一優(yōu)選例中，所述的施用包括施涂或噴涂。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。


圖1顯示了 Prx-6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道1 空白對(duì)照；泳道2 :Prx_6 ；M 分子
量標(biāo)準(zhǔn)品。圖2顯示了 Prx-6蛋白親和純化色譜圖。峰1 雜蛋白；峰2 :Prx_6目的蛋白。圖3顯示了 Prx-6蛋白純化電泳圖(12% SDS-PAGE)。泳道1 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品 (Fermentas)；泳道2 親和層析純化并脫鹽后的I^rx-6蛋白；泳道3 峰1 ；泳道4 上樣穿出蛋白；泳道5 破菌上清(上樣的樣品)。圖4顯示了重組蛋白對(duì)HEF細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用(P < 0. 05)。圖5顯示了重組Prx-6蛋白對(duì)H9C2細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用(P < 0. 05)。圖6顯示了重組Prx-6蛋白治療小鼠燙傷的結(jié)果。圖中，各圖片從左至右依次為對(duì)照組O只)；Prx-6組O只)；美寶組O只)；美寶組O只)。
具體實(shí)施例方式
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本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，除了發(fā)現(xiàn)蛋白具有抗氧化作用可保護(hù) HEF等細(xì)胞之外，還首次發(fā)現(xiàn)蛋白居然具有促進(jìn)燒傷和燙傷愈合的作用，因此可用于治療燒燙傷。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。 具體地，本發(fā)明的重組人Prx-6蛋白可直接涂覆于傷口表面，對(duì)于燒/燙傷創(chuàng)面可立即收斂，抑制滲出。涂后即刻成膜，杜絕內(nèi)外感染，能加快新生肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)燒燙傷組織愈合，同時(shí)具有刺激性小、可有效控制感染、療程短等優(yōu)點(diǎn)。Prx-6 蛋白如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明蛋白”、“Peroxiredoxins蛋白” “prdx6蛋白”、“Prx_6 蛋白，，“過(guò)氧化氧化還原蛋白”等可互換使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。 它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。應(yīng)理解，這些術(shù)語(yǔ)既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳動(dòng)物(如狗、牛、羊、猴、嚙齒動(dòng)物(如小鼠))中的具有同種功能的同系物或同源蛋白。此外，該術(shù)語(yǔ)包括野生型和突變型Prx-6蛋白。人prx-6 基因的 cDNA 序列 GenBank 登錄號(hào)NM_004905. 2，如 SEQ ID NO 1 所示。 人的氨基酸序列的登錄號(hào)為NP_004896，如SEQ ID NO 2所示。應(yīng)理解，由于人等哺乳動(dòng)物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的， 可以用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA重組技術(shù)而獲得其蛋白。一類特別優(yōu)選的蛋白是prx-6類似物，即在其他哺乳動(dòng)物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中prx-6的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)prdx6的序列，通過(guò)雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過(guò)常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。藥物組合物和施用方法本發(fā)明還提供了藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明prx-6蛋白藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其組合。例如，可將本發(fā)明蛋白配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)局部給藥、口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)。一種優(yōu)選的方式是直接施涂在燒燙傷的創(chuàng)面和周圍。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如膏劑、滴劑、噴霧劑、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、 片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/ 千克體重-約10毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，本發(fā)明的蛋白還可與治療燒燙傷的其他治療劑一起使用。在優(yōu)選例中，可將本發(fā)明蛋白按0. 1-0. 5mg/cm2創(chuàng)面的用量直接施涂或噴涂在燒燙傷的創(chuàng)面。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(1)開發(fā)了人蛋白新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。燒燙傷創(chuàng)面涂覆蛋白后可立即收斂，抑制滲出，杜絕內(nèi)外感染，能加快新生肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)燙傷組織愈合，同時(shí)具有刺激性小、可有效控制感染。O)Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全安全無(wú)毒副作用，有很好的藥用前景。(3)人蛋白做成注射劑型、噴霧劑、滴劑、膏劑等，使用方便。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則份數(shù)和百分比按重量計(jì)。實(shí)施例1. pET32b (+) /Prx-6表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)編碼成熟蛋白的基因序列設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異引物(上游引物 5，-tatccatatgcccggaggtctgcttc-3，(SEQ ID NO :3),下游弓丨物5，-ttactcgagaggctgggg tgtgtagcg-3，(SEQ ID NO :4))，酶切位點(diǎn)分別為 NdeI 及 Xhol，以常規(guī)方法抽提的人附睪mRNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果見圖1，檢測(cè)到與理論值相符的688bp的擴(kuò)增片段。分離擴(kuò)增片段，用NdeI及B10I進(jìn)行雙酶切。然后，將經(jīng)過(guò)雙酶切的片段連接到已用NdeI和B10I切成線性的pET32b (+)表達(dá)載體(購(gòu)自Novagen)中，轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌 T0P10F'(購(gòu)自hvitrogen)。通過(guò)菌落PCR的方法篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)序列及表達(dá)閱讀框的正確性，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET32b (+) /Prx-6。該表達(dá)載體所表達(dá)的Prx-6 蛋白在C端附加8個(gè)氨基酸LEHHHHHH，以便于分離純化。實(shí)施例2. Prx-6蛋白的表達(dá)將質(zhì)粒pET32b (+) /Prx-6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Origami B (DE3)(購(gòu)自 Novagen)，將陽(yáng)性克隆接種于含lOOug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37度搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1 100 轉(zhuǎn)接于含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37度搖床培養(yǎng)至菌密度0D600 = 0. 6 0. 8 后，加入IPTG至終濃度0. 4mM以誘導(dǎo)目的蛋白Prx_6的表達(dá)，3_4h后離心收集菌體。實(shí)施例3. Prx-6蛋白的純化將離心收集的菌體重懸于緩沖液A中OOmM磷酸鹽緩沖液，150mM氯化鈉，pH7. 2)， 冰浴中超聲破碎，20000g低溫0度)離心15min取上清為待純化的樣品。使用緩沖液A平衡鎳親和層析柱后，將樣品上柱，然后用含50mM咪唑的緩沖液A沖洗柱子去除雜蛋白(峰 1)，用含300mM咪唑的緩沖液A將目的蛋白洗脫下來(lái)(峰2)(見圖2)。最后用G-25脫鹽柱將洗脫的蛋白置換于緩沖液A中以去除咪唑，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。經(jīng)分析，獲得了純度在95%以上蛋白，分子量約沈.11^)。(見圖3)。實(shí)施例4.蛋白的抗氧化活性(HEF細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn))HEF細(xì)胞為常用的人胚胎成纖維細(xì)胞(Zavada et al.，Nature New Biology, 240 124-125(1972)；或 US 7，811，817)。用培養(yǎng)基(高糖 DMEM+5% FBS)復(fù)蘇細(xì)胞，培養(yǎng) 48h，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合后，按照下面實(shí)驗(yàn)方法先將實(shí)施例3中獲得的Prx-6蛋白(ftxlx-6-His 融合蛋白)加入培養(yǎng)體系中，再加入H2O2，作用30min后，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素 1 : 水平(lmM、0. 5mM、0. 25mM、0. 125mM、0mM)
因素 2 :Prdx-6-His 水平(0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. 125mg/ml、0mg/ml)各實(shí)驗(yàn)組的H2A和I^rdx-e-His濃度如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種蛋白在制備治療燒燙傷的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白是重組蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白包括氨基酸序列如SEQID NO :2所示的蛋白或其與表達(dá)標(biāo)簽形成的融合蛋白。
5.一種用于治療燒燙傷的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體，并且所述的藥物組合物為外用制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人蛋白。
7.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。
8.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的外用制劑是膏劑、噴霧劑、或滴劑。
9.一種治療燒燙傷的方法，其特征在于，包括步驟對(duì)需要治療的對(duì)象，在燒燙傷的創(chuàng)面上施用Prx-6蛋白蛋白或權(quán)利要求5所述的藥物組合物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的治療包括促進(jìn)傷口愈合和減少創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組人Prx-6蛋白在治療燒燙傷方面的用途。具體地，本發(fā)明提供了人Prx-6蛋白在制備治療燒燙傷的藥物中的用途。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，Prx-6蛋白在治療燒燙傷過(guò)程中有重要的促進(jìn)傷口愈合作用。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102485272SQ20101057359
公開日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者李建遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)