專利名稱：新型抗乳腺癌多肽疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的制備，其特征在于包括一個來源于HER2/ neu (表皮生長因子受體)的多肽片段(E75或342-350)，一個效應T細胞(Th，T輔助細胞) 抗原決定基，和一個TLR(toll-like rec印tor，toll樣細胞受體)的配基，以及連接這三組分的半胱氨酸。
背景技術：
每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，約50萬婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率約為亞非拉國家的4倍。我國雖是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)，但其發(fā)病率正在逐年上升，發(fā)病的增長速度卻高出高發(fā)國家1到2個百分點，尤其是滬、京、津及沿海地區(qū)是我國乳腺癌的高發(fā)區(qū)。更令人擔憂的是，與西方國家比較，我國乳癌患者發(fā)病年齡較輕， 發(fā)病高峰年齡在40-49歲，比西方婦女早10-15年?；趪谰男蝿荩橄侔┑闹委熍c防復發(fā)引起了人們的廣泛關注。乳腺癌的傳統治療方法1.手術治療手術適應癥Halsted首創(chuàng)乳癌根治術，因手術合理，療效明確，近百年來成為人們治療乳癌所遵循的標準方式。近半個世紀以來，對乳癌術式進行了不少探索性修改，總的趨勢不外保守和擴大兩方面，至今仍爭論不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手術的代表性手術。2.放射治療可以提高手術切除率使部分不能手術的患者再獲手術機會，由于放射抑制了腫瘤細胞的活力可降低術后復發(fā)率及轉移率從而提高生存率，由于放射延長了術前觀察時間有使部分已有亞臨床型遠處轉移的病例避免一次不必要的手術。3.化療通過化療科盡早控制微轉移灶使原發(fā)癌及其周圍擴散的癌細胞產生退變或部分被殺滅以減少術后復發(fā)及轉移，進展期乳癌以及炎癥型乳癌限制了手術治療的實施術前化療可使腫瘤縮小以便手術切除，可以根據切除腫瘤標本評價術前化療效果作為術后或復發(fā)時選擇化療方案的參考。4.乳腺癌的最新治療方法腫瘤生物治療技術是近年來因生物技術發(fā)展而興起的一種全新的腫瘤治療手段，被認為是除了手術、化療、 放療之外的第四種腫瘤治療模式，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應癥廣等特點。將生物技術用于腫瘤治療是提高和改變患者自身機體免疫功能的治本的方法，被認為是攻克腫瘤的最終辦法，其應用前景廣闊。自從人類腫瘤分子特征的提高導致腫瘤相關抗原可以被人體的T淋巴細胞所識別后，發(fā)展抗腫瘤疫苗已成為一種趨勢。腫瘤的疫苗是通過誘導腫瘤患者自身的免疫監(jiān)測和殺瘤功能，有效地殺滅患者術后和放化療后體內殘存的腫瘤細胞， 達到治療腫瘤，預防復發(fā)和轉移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強，副作用輕等特點， 正逐步成為腫瘤綜合治療中的一個重要環(huán)節(jié)，也是當前腫瘤治療基礎研究和臨床應用的熱點與發(fā)展方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗，其特征在于包括來源于HER2/neU(表皮生長因子受體)的多肽片段(E75或342-350)，一個效應T細胞(Th，T輔助細胞)抗原決定基，一個TLR(toll-like receptor, toll樣細胞受體)的配基，和連接這三組分的半胱氨酸 ①以半胱氨酸為底物，通過高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，加入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，加入棕櫚酰氯，在氨基處形成?；磻?，還原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇， 在巰基處形成開環(huán)氧的氧化反應，再加入棕櫚酰氯，在兩個羥基處發(fā)生酰化反應，去掉最初半胱氨酸上的保護基，便制出Pam3Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團Fmoc-保護的氨基酸共價連接在固相載體上，20% pipe (哌啶)的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了，DIEA提供一個堿性的反應環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽，重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，脫去保護基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；③最后，將Pam3Cys上的羧基和E75 多肽上的氨基通過縮合反應連接。本發(fā)明與現有同類疫苗相比，結構新穎，合成方法獨到，具有廣泛的應用價值。
具體實施例方式1. TLR配基和化學合成1. 1.化合物(a)合成準確稱取10. OOg胱氨酸(Cys)置于圓底燒瓶中，將體系置于冰浴中緩慢滴加 29. 75g高氯酸(Ηα04)。保持體系低溫，加入^Oml乙酸叔丁酯并繼續(xù)攪拌，初有白色不溶物而后逐漸消失。室溫攪拌，見有大量固體析出時停止攪拌，室溫靜置過夜。將體系轉入冰箱0°C放置Mh，取出后迅速用布氏漏斗抽濾。濾渣用乙醚洗滌后加碳酸氫鈉溶液溶解，用等體積乙醚萃取3次。有機相經飽和食鹽水洗滌和無水硫酸鈉干燥，去除溶劑得黃色油狀液體11.85g即為化合物(a)，產率81%。1. 2.化合物(b)合成將11. 35g化合物(a)溶解于200ml 二氯甲烷，將10. 85g碳酸氫鈉溶解于IOOml 蒸餾水。兩相混合，邊攪拌邊滴加20. 67g棕櫚酰氯，室溫攪拌過夜。薄層色譜監(jiān)測(展開劑中石油醚乙酸乙酯=7 2，ν/ν)，反應結束后將體系轉入分液漏斗靜置待其分層，放出有機相，水相用3 X 20ml 二氯甲烷萃取產物。所得有機相合并，用飽和食鹽水洗2次，力口無水硫酸鈉干燥，去除溶劑得到白色固體21. 39g即為化合物(b)，產率80%。1. 3.化合物(C)和(d)合成稱取10.30g化合物(b)溶解于二氯甲烷，加入5. 67g鋅粉，室溫攪拌。逐漸滴加甲醇/濃鹽酸(37% )/濃硫酸(98% )混合溶液(體積比100 7 1)作為活化劑開始反應。薄層色譜監(jiān)測(展開劑為乙酸乙酯)反應結束后，不進行后處理直接進行下一步反應。向體系加入碳酸氫鈉粉末至體系pH> 7，加入1. 61g環(huán)氧丙醇，室溫攪拌過夜。薄層色譜監(jiān)測(展開劑為乙酸乙酯)反應結束后，將體系用砂芯漏斗墊硅藻土過濾，濾渣用 3X30ml 二氯甲烷/甲醇混合液(體積比3 1)洗滌。濾液合并旋轉蒸發(fā)去除溶劑，用少量乙酸乙酯溶解，經過硅膠柱色譜分離產物，去除溶劑得到黃色油狀液體8. 41g即為化合物(d)，產率69%。
1.4.化合物(e)合成稱取7.91g化合物(d)溶解于160ml 二氯甲烷中，依次加入5. IOg三乙胺和 0. 79gDMAP (4- 二甲氨基吡啶，用作催化劑)，混勻液體。邊搖動邊滴加10. 31g棕櫚酰氯，放熱同時有酸霧產生。室溫攪拌過夜。薄層色譜監(jiān)測(展開劑中石油醚與乙酸乙酯體積比為7 幻反應情況，追加2. 98g棕櫚酰氯(同時追加三乙胺保證體系堿性環(huán)境)后轉化完全。旋轉蒸發(fā)濃縮體系，用硅膠柱色譜分離產物，去除溶劑得到白色固體26. 31g即為化合物(e)粗品。重溶解粗品于乙酸乙酯/石油醚混合液(體積比1 6)中，室溫靜置池，轉入冰箱0°C靜置池進行重結晶。抽濾，用石油醚略洗濾渣，得到白色固體9. 90g即為化合物 (e)純品，產率63%。1. 5. Pam3Cys 合成將(e)溶解于IOml 二氯甲烷，加入95%三氟乙酸^iil，混勻后室溫攪拌。薄層色譜(展開劑石油醚與乙酸乙酯體積比3 1，加一滴冰醋酸)檢測反應結束后，將體系用飽和食鹽水洗滌至流出液為PH為中性。旋轉蒸發(fā)去除溶劑得到白色蠟狀物質。加入少量二氯甲烷至其完全溶解，再加入16倍體積的石油醚，室溫靜置1 冰箱o°c靜置1 待其重結晶。抽濾取濾渣，烘干得到白色固體8. 80g即為Pam3Cys純品，產率94%。2. Th抗原決定基和E75多肽的合成2. 1.稱取樹脂于DCM ( 二氯甲烷)，氬氣鼓動5min ；2. 2.稱取 Fmoc-Leu-OH 0. 3mmol ；2. 3. Fmoc-Leu-OH DIEA=I 2 (η)氬氣鼓動 90min ；2. 4. DCM 洗滌 5 次(次 /min)；2. 5.封閉樹脂活性 DCM DIEA MeOH = 3. 4ml 0.2ml 0.4ml 氬氣鼓動 IOmin ；2. 6. DCM洗滌5次(次/min)，再DMF (二甲基甲酰胺)洗滌5次(次/min)，后 20% pipe30min ；2. 7. 20% pipe洗滌一次，再DMF洗滌5次(次/min)，以脫出白色Fmoc粉末為宜；2. 8. Fmoc-Met-OH (0. 3mmol) HBTu DIEA=I 1 2 (η)氬氣鼓動 90min ；2. 9. DMF 洗滌 5 次(次 /min)；2. 10. 20% pipe 氬氣鼓動 30min ；2. 11. 20% pipe洗滌一次，DMF洗滌5次(次/min)；依次加入后續(xù)Fmoc-氨基酸，重復8-12的操作，按文獻順序連接多肽，最后用95% TFA, 2. 5% H20,2. 5% TIS將合成好的肽段與固相樹脂脫離。但要注意的是后續(xù)氨基酸的當量要視情況依次遞增0. 3mmol, 0. 6mmol,0. 9mmol, 1. 2mmol,氬氣鼓動時間隨氨基酸當量遞增而遞增90min，120min, 150min,210mino氬氣鼓動氨基酸連接以及20% pipe溶液脫Fmoc保護基團的時間應夠長以保障反應充分。3.Pam3Cys與E75多肽的連接Pam3Cys和E75多肽置于TBTU (0_苯并三氮唑-N，N, N' , N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT (1-羥基-苯并三氮唑)、N-甲基嗎啉、DMF、DCM的混合溶液中攪拌過夜。
權利要求
1.一種新型抗乳腺癌E75多肽疫苗，其特征在于包括一個來源于HER2/neU(表皮生長因子受體)的E75多肽片段，一個效應T細胞(Th，T輔助細胞)抗原決定基，一個 TLR(toll-likereceptor, toll樣細胞受體)的配基，和連接這三組分的半胱氨酸，該疫苗的研制方法為①以半胱氨酸為底物，通過高氯酸的氧化作用形成二聚化的半胱氨酸，力口入乙酸叔丁酯與氨基酸的羧基酯化，加入棕櫚酰氯，在氨基處形成?；磻€原二硫鍵并加入環(huán)氧丙醇，在巰基處形成開環(huán)氧的氧化反應，再加入棕櫚酰氯，在兩個羥基處發(fā)生?；磻?，去掉最初半胱氨酸上的保護基，便制出Pam3Cys化合物；②氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團Fmoc-保護的氨基酸共價連接在固相載體上，20% pipe的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了， DIEA提供一個堿性的反應環(huán)境，HBTu作為縮合劑，將第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽， 重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，脫去保護基Fmoc-，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽；③最后，將Pam3Cys上的羧基和E75多肽上的氨基通過縮合反應連接。
2.根據權利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于半胱氨酸與高氯酸的物質的量比為1 5。
3.根據權利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于加入含4倍當量的碳酸氫鈉的水溶液，加入2倍當量的棕櫚酰氯。
4.根據權利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于用鋅粉還原二硫鍵是， 逐漸滴加甲醇/鹽酸(37%)/濃硫酸混合溶液(體積比100 7 1)作為活化劑，然后加入2倍當量的環(huán)氧丙醇。
5.根據權利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于加入3倍當量的三乙胺和少量DMAP (4- 二甲氨基吡啶)作催化劑，邊搖動邊滴加2倍當量的棕櫚酰氯。
6.根據權利要求1所述的三組分疫苗的制備方法，其特征在于=Pam3Cys連接肽段時， 加入TBTU (0-苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HOBT (1-羥基-苯并三氮唑)、N-甲基嗎啉、DMF( 二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)，且DMF DCM = 5 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征在于包括一個來源于HER2/neu(表皮生長因子受體)的多肽片段(E75或342-350肽段)，一個效應T細胞(Th，T輔助細胞)抗原決定基，和一個TLR(toll-like receptor，toll樣細胞受體)的配基，連接這三組分的半胱氨酸。這些TLR的配基可以結合到樹突狀細胞表面的某些TLR上，促進了樹狀細胞的成熟和炎癥因子的釋放，也增強了樹突狀細胞對衍生多肽的吞噬和遞呈；第二部分由Th抗原決定基組成，抗體產生的過程中需要CD4+Th細胞的參與，遞呈細胞(APC)將抗原遞呈到細胞表面的MHC上，需要激活CD4+Th細胞，才能引起細胞免疫過程；第三部分是多肽片段，它是由HER2/neu蛋白衍生出的肽鏈(E75或342-350)，可有效誘導體液免疫，當其與免疫輔助物相結合，可以有效地誘導蛋白特異性免疫應答。
文檔編號A61K39/385GK102475886SQ20101056154
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權日2010年11月29日
發(fā)明者周興亮, 尹芝南, 楊文娟, 楊昭慧, 洪章勇, 趙文哲 申請人:南開大學