專利名稱：一種組織工程皮膚構建新方法
技術領域：
本發(fā)明屬于人體組織工程技術，具體涉及一種組織工程皮膚構建新方法，采用人類表皮干細胞、真皮成纖維細胞作為種子細胞，以經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾的同種無細胞真皮基質(zhì)作為支架，使用氣液界面分離法復合構建一種有活性的雙層組織工程皮膚。
背景技術：
皮膚是人體最大的組織器官，是人體的外屏障，皮膚的完整性對于人類有著重要的作用。燒(創(chuàng))傷等多種原因造成皮膚大面積缺損后，可導致人體嚴重的功能障礙，甚至危及生命。目前修復皮膚缺損最有效的方法是自體皮膚移植，但大面積燒傷自體皮源常常不能滿足治療需要，且這種方法在供皮區(qū)會造成新的損傷。同種異體皮、異種皮作為暫時性皮膚替代物雖然可以用于治療皮膚缺損創(chuàng)面，但由于免疫排斥等因素無法達到自體皮一樣的效果，而僅僅能起到覆蓋保護創(chuàng)面的作用。組織工程技術是應用生命科學和工程學技術來構建人體組織或器官的一門新興技術，隨著組織工程技術的發(fā)展，組織工程皮膚作為永久性皮膚替代物，其研究得到了很大的發(fā)展。組織工程皮膚構建的三要素為種子細胞、支架材料和組織構建。組織工程皮膚的種子細胞來源有多種，如表皮干細胞、脂肪干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞和胚胎干細胞等，它們在一定的微環(huán)境下均可被誘導向表皮細胞分化。其中，表皮干細胞具有強大的增殖和分化潛能，是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復、重建的關鍵源泉，且在體外培養(yǎng)時更容易保持表皮細胞表型；成纖維細胞是真皮的主要細胞成分，其分泌的膠原纖維和其他基質(zhì)成分對表皮細胞的生長和創(chuàng)面愈合具有促進作用，是構建組織工程皮膚真皮的一類重要細胞。支架材料是種子細胞黏附、生長、遷移、增殖和分化的載體，是組織工程皮膚的“真皮”部分。按化學性質(zhì)支架材料分為人工合成類材料和天然生物類材料兩種。人工合成類支架材料抗張強度高，降解速率和微結構容易在合成過程控制，因此容易大規(guī)模生產(chǎn)，但其最大缺點是缺乏細胞識別信號，不利于細胞黏附及特異基因激活。目前已有的組織工程產(chǎn)品多采用膠原海綿、氨基多糖等天然生物類材料，該類材料具有良好的相容性和適宜的降解速度，但其缺點是力學能力差。同種脫細胞真皮基質(zhì)屬于天然類材料，具有其它人工合成材料無法比擬的優(yōu)點，它是將同種皮膚經(jīng)過理化方法處理去除表皮層及真皮中細胞成分所得的產(chǎn)物，保留有彈力纖維、膠原纖維等維持力學支撐的基質(zhì)成分，同種脫細胞真皮基質(zhì)具有良好的力學性能、低免疫原性及天然膠原三維支架結構，是一種理想的組織工程支架材料。組織構建是組織工程的最終目標，在一定的微環(huán)境下，將培養(yǎng)的種子細胞與支架材料復合進行組織構建是組織工程皮產(chǎn)品的關鍵步驟。體外構建的組織工程皮膚產(chǎn)品在功能上要接近生理皮膚，表皮細胞必須具有含角化的多層細胞結構，才能保證皮膚移植后具有抗摩擦、保濕等防護功能。表皮細胞以單純的浸沒式培養(yǎng)只能形成多層結構，不能正常角化。而采用氣-液分離培養(yǎng)的方式進行體外培養(yǎng)，類同于模擬人體在體條件，能夠有效構建組織工程皮膚。目前組織工程皮膚已有多種產(chǎn)品，但大多數(shù)產(chǎn)品存在著皮膚薄弱、抗拉及抗摩擦能力差，應用時不易操作等缺點。經(jīng)檢索，目前以同種無細胞真皮作為支架，同時復合兩種種子細胞的產(chǎn)品還未見報道。陸洪光等發(fā)明了一種用表皮干細胞體外制作組織工程皮膚的方法(專利申請?zhí)?00710201677. 1)，該方法以表皮干細胞作為種子細胞，以去表皮真皮作為支架材料，將培養(yǎng)的表皮干細胞膜片接種于去表皮真皮上，進行液下液面培養(yǎng)而得組織工程皮膚。該方法存在一些不足，一是采用的支架材料僅通過去表皮處理，沒有經(jīng)過脫細胞處理，會使支架材料中包含較多的細胞成分，用于臨床容易導致免疫排斥反應的發(fā)生；二是僅僅用表皮干細胞作為種子細胞，缺少了成纖維細胞，影響了表皮干細胞的黏附與增殖，也將延緩缺損創(chuàng)面的愈合速度。成纖維細胞作為真皮中重要的細胞組成部分，可分泌多種細胞因子，如肝細胞生長因子、角質(zhì)形成細胞生長因子、類胰島素生長因子、TGF-β 1、前列腺素等，對表皮細胞的生長、移行和分化均有促進作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種組織工程皮膚構建新方法，使構建出的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下一種組織工程皮膚構建新方法，采用人表皮干細胞、真皮成纖維細胞作為種子細胞，以經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾的同種無細胞真皮基質(zhì)作為支架，利用氣液界面分離法復合構建為一種有活性的雙層組織工程皮膚。進一步，如上所述的組織工程皮膚構建新方法，具體包括如下步驟(1)表皮干細胞的分離和培養(yǎng)取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復沖洗，置Dispase II中浸泡過夜，冷消化分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細胞，過濾并接種于IV 型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，通過差速粘附篩選表皮干細胞，加專用培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)成纖維細胞的分離和培養(yǎng)取步驟(1)中分離的真皮，PBS緩沖液沖洗，剪碎，真皮面向下散在接種于培養(yǎng)瓶， 倒置一段時間后，加入成纖維細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)同種無細胞真皮的制備采用高滲鹽溶液-SDS-胰蛋白酶法制備同種無細胞真皮取同種刃厚皮片，使其浸于Nacl溶液中恒溫震蕩，脫去表皮；在十二烷基硫酸鈉-磷酸鹽溶液中超聲處理，破碎細胞；以胰蛋白酶消化，清除細胞殘骸；最后以生理鹽水清洗備用；(4) IV型膠原修飾真皮支架取步驟(3)所得的同種無細胞真皮，將IV型膠原鋪于真皮支架的乳頭層面上，并放置于培養(yǎng)箱中過夜；(5)接種成纖維細胞用絲裂霉素C處理步驟⑵所得第3或第4代成纖維細胞，接種于步驟⑷所得真皮支架上，加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 3天；(6)接種表皮干細胞將步驟(1)所得第2或第3代表皮干細胞接種于步驟(5)所得的真皮支架上，添加足量培養(yǎng)基使真皮支架完全浸沒，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，形成初期復合物；(7)氣液分離培養(yǎng)構建組織工程皮膚以Transwell培養(yǎng)小室作為氣液分離支架，將步驟(6)所得復合物轉(zhuǎn)移至該氣液分離支架上，添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基液面須與復合物最底部平齊，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，即完成組織工程皮膚的制備過程。上述制備過程中所使用的表皮干細胞專用培養(yǎng)基為含5%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基；成纖維細胞專用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液；復合皮膚專用培養(yǎng)基為含 10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用表皮干細胞與成纖維細胞兩種種子細胞，解決了單純表皮細胞在支架材料上增殖緩慢的缺點。本發(fā)明采用同種脫細胞真皮作為支架材料，既具備良好的天然皮膚結構，為種子細胞提供良好的支架環(huán)境；又具備良好的生物相容性和極低免疫原性，有效避免了排斥反應的發(fā)生。經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾，可以更好的促進種子細胞的黏附與增殖。本發(fā)明采用氣-液分離的方法，模擬人體在體條件，可有效構建組織工程皮膚。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。作為組織工程三要素之一，種子細胞的篩選與培養(yǎng)是構建組織工程皮膚重要的一步。表皮干細胞因其具有較大的增殖和分化潛能成為種子細胞的首選，但該細胞的特征之一是慢周期性，這會影響細胞的增殖速度，而體內(nèi)體外的研究均表明表皮干細胞的分化月上皮-間充質(zhì)相互作用有關，即和真皮成纖維細胞密切相關。所以，添加真皮成纖維細胞作為種子細胞可以促進表皮干細胞的增殖與分化。本發(fā)明即采用表皮干細胞與成纖維細胞共同作為種子細胞，解決了單純表皮細胞在支架材料上增殖緩慢的缺點。支架材料是組織工程的第二要素，本發(fā)明采用同種脫細胞真皮作為支架材料，既具備了良好的天然皮膚結構，為種子細胞提供良好的支架環(huán)境；又具備了良好的生物相容性和極低免疫原性，有效避免了排斥反應的發(fā)生。經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾，可以更好的促進種子細胞的黏附與增殖。組織構建是組織工程的最終目標，在一定的微環(huán)境下，將培養(yǎng)的種子細胞與支架材料復合進行組織構建是組織工程皮產(chǎn)品的關鍵步驟。本發(fā)明采用氣_液分離的方法，模擬人體在體條件，可有效構建組織工程皮膚。實施例1(1)表皮干細胞的分離和培養(yǎng)取2 4cm2同種皮膚組織(本實施例中取3cm2)，置于含雙抗的PBS中反復沖洗， 剪除脂肪和皮下組織，剪成0.5X0. 5cm2的小塊，移入Dispase II (2. 4U/ml)中，4°C過夜。 分離真皮、表皮，收集表皮皮片并剪碎，37°C條件下置0. 25%胰酶與0. 02%的EDTA混合消化液內(nèi)消化30分鐘，血清終止，200目細胞篩子過濾。IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，表皮干細胞專用培養(yǎng)基重懸，調(diào)定細胞密度為(1 2) X 106ml，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)瓶中， 快速篩選15分鐘后，棄去未貼壁細胞，更換新的培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1 次，約7天細胞達80%匯合時，傳代。所述的表皮干細胞專用培養(yǎng)基為含5%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基。(2)成纖維細胞的分離和培養(yǎng)以組織塊法培養(yǎng)成纖維細胞取步驟(1)中分離的真皮，PBS沖洗3次，剪成Imm3 的小塊，真皮面向下散在接種于培養(yǎng)瓶底部，37°C條件下倒置5小時，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液，37°C>5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。(3)同種無細胞真皮的制備采用高滲鹽溶液-SDS-胰蛋白酶法制備同種無細胞真皮取-70°C條件下保存厚度為0. 3mm的同種皮片，使用前從-70°C條件下取出后立即放入37士2°C的恒溫水浴鍋內(nèi)復溫，再浸入lmol/L Nacl溶液中，37°C條件下恒溫震蕩24小時脫表皮，磷酸鹽緩沖液反復沖洗，置于含5g/L十二烷基硫酸鈉-磷酸鹽溶液(SDS)中4小時，磷酸鹽緩沖液沖洗，0. 25% 胰蛋白酶消化1小時，生理鹽水溶液反復沖洗后備用。(4) IV型膠原修飾真皮支架取步驟(3)所得的同種無細胞真皮，將IV型膠原(100μ g/ml)鋪于真皮支架的乳頭層面上，并放置于培養(yǎng)箱中過夜；(5)接種成纖維細胞絲裂霉素C (10 μ g/ml 40 μ g/ml)處理步驟⑵所得第3或第4代成纖維細胞， 以密度為5X 104/ml接種于步驟(4)所得真皮支架上，加入成纖維細胞專用培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液)，置37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 3天。(6)接種表皮干細胞將步驟⑴所得第2或第3代表皮干細胞以密度為1 X 107ml接種于步驟(5)所得的真皮支架上，添加足量表皮干細胞專用培養(yǎng)基(含5%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基)使真皮支架完全浸沒，于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，形成初期復合物。(7)氣液分離培養(yǎng)構建組織工程皮膚以Transwell培養(yǎng)小室作為氣液分離支架，將步驟(6)所得復合物轉(zhuǎn)移至該氣液分離支架上，添加復合皮膚專用培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基液面須與復合物最底部平齊，于37°C、5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，即完成組織工程皮膚的制備過程。本發(fā)明構建所得的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構，組織形態(tài)學顯示該組織工程皮膚具有表皮和真皮雙層結構，其中真皮膠原支架完整，表皮層中具有多層不同分化程度的細胞，達到了組織工程皮膚的形態(tài)學要求。在本發(fā)明中提及的所有文獻都在本申請引用中作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，在不偏離本發(fā)明的權利要求精神基礎上所作這些等價形式的修改，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種組織工程皮膚構建新方法，其特征在于采用人表皮干細胞、真皮成纖維細胞作為種子細胞，以經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾的同種無細胞真皮基質(zhì)作為支架，利用氣液界面分離法復合構建為一種有活性的雙層組織工程皮膚。
2.如權利要求1所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于具體包括如下步驟(1)表皮干細胞的分離和培養(yǎng)取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復沖洗，置Dispase II中浸泡過夜，冷消化分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細胞，過濾并接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，通過差速粘附篩選表皮干細胞，加專用培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)成纖維細胞的分離和培養(yǎng)取步驟(1)中分離的真皮，PBS緩沖液沖洗，剪碎，真皮面向下散在接種于培養(yǎng)瓶，倒置一段時間后，加入成纖維細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)同種無細胞真皮的制備采用高滲鹽溶液-SDS-胰蛋白酶法制備同種無細胞真皮取同種刃厚皮片，使其浸于 Nacl溶液中恒溫震蕩，脫去表皮；在十二烷基硫酸鈉_磷酸鹽溶液中超聲處理，破碎細胞； 以胰蛋白酶消化，清除細胞殘??；最后以生理鹽水清洗備用；(4)IV型膠原修飾真皮支架取步驟(3)所得的同種無細胞真皮，將IV型膠原鋪于真皮支架的乳頭層面上，并放置于培養(yǎng)箱中過夜；(5)接種成纖維細胞用絲裂霉素C處理步驟(2)所得第3或第4代成纖維細胞，接種于步驟(4)所得真皮支架上，加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 3天；(6)接種表皮干細胞將步驟(1)所得第2或第3代表皮干細胞接種于步驟(5)所得的真皮支架上，添加足量培養(yǎng)基使真皮支架完全浸沒，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，形成初期復合物；(7)氣液分離培養(yǎng)構建組織工程皮膚以Transwell培養(yǎng)小室作為氣液分離支架，將步驟(6)所得復合物轉(zhuǎn)移至該氣液分離支架上，添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基液面須與復合物最底部平齊，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，即完成組織工程皮膚的制備過程。
3.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(1)中取2 4cm2 同種皮膚小塊；所述的Dispase II的濃度為2. 4U/ml ；所述的表皮干細胞專用培養(yǎng)基為含 5%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基。
4.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(2)中所述的倒置時間為5小時；所述的專用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液。
5.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(3)中所述的十二烷基硫酸鈉_磷酸鹽溶液的濃度為5g/L ；所述的胰蛋白酶的濃度為0. 25%。
6.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(4)中所述的IV 型膠原的濃度為100yg/ml。
7.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(5)中所述的絲裂霉素C的濃度為10 μ g/ml 40 μ g/ml ；所述的FBS在DMEM培養(yǎng)基中的含量為10% ；培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2飽和濕度。
8.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(6)中的表皮干細胞專用培養(yǎng)基為含5%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2飽和濕度。
9.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于步驟(7)中培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2飽和濕度；復合皮膚專用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基。
10.如權利要求2所述的組織工程皮膚構建新方法，其特征在于所述的同種皮膚組織源自健康兒童包皮環(huán)切術所切除的包皮組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種組織工程皮膚構建方法，該方法采用人表皮干細胞、真皮成纖維細胞作為種子細胞，以經(jīng)過人胎盤IV型膠原修飾的同種無細胞真皮基質(zhì)作為支架，利用氣液界面分離培養(yǎng)法復合構建為一種有活性的雙層組織工程皮膚。該方法構建的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構，組織形態(tài)學顯示該組織工程皮膚具有表皮和真皮雙層結構，其中真皮膠原支架結構完整，表皮層中具有多層不同分化程度的細胞，達到組織工程皮膚的形態(tài)學要求。
文檔編號A61L27/40GK102462864SQ20101054143
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者劉曉明, 周沫, 張乃麗, 張育敏, 李寶興, 李寶明, 李幼忱, 李靖, 王旭昇, 董麗, 趙亞平, 陳學英, 馬紹英 申請人:中國輻射防護研究院