專利名稱：一種溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
引導(dǎo)組織再生技術(shù)的原理是使用屏障膜隔離周?chē)浗M織的長(zhǎng)入，隔離周?chē)M織的 長(zhǎng)入，為牙周組織和骨組織的再生提供空間。屏障膜的性能在一定程度上決定了引導(dǎo)組織 再生技術(shù)的成敗。目前，可吸收性生物膜由于具有生物相容性好，無(wú)須二次手術(shù)取出等優(yōu) 點(diǎn)，在牙周組織再生和骨缺損的修復(fù)中已得到廣泛應(yīng)用。但目前國(guó)內(nèi)外的膜產(chǎn)品存在生產(chǎn) 工藝復(fù)雜、價(jià)格高、不具有骨誘導(dǎo)作用等缺陷。殼聚糖是甲殼素脫乙?；难苌?，具有良好的生物相容性、可降解活性以及促 進(jìn)組織再生活性。以殼聚糖為基材的溫敏凝膠系統(tǒng)可以在低溫或常溫下保持液體狀態(tài)，當(dāng) 溫度升高后發(fā)生相轉(zhuǎn)變。由于其相轉(zhuǎn)變條件溫和、具有良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受 到廣泛關(guān)注，已被應(yīng)用于組織工程、藥物載體等領(lǐng)域。當(dāng)凝膠形成后，由于疏水作用、氫鍵及 共價(jià)鍵等靜電作用，使之具有多孔的網(wǎng)狀支架形態(tài)，并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和空間保持能 力。因此，利用殼聚糖制備可吸收性生物膜具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，現(xiàn)有技術(shù)中，并沒(méi)有關(guān)于利用殼聚糖溫敏凝膠制備引導(dǎo)組織再生膜的相關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜，其生物相 容性好，可應(yīng)用于引導(dǎo)組織再生或引導(dǎo)骨再生領(lǐng)域，本發(fā)明還提供了其制備方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種溫敏凝膠引導(dǎo)的組織再生屏障膜的制備方法，步驟如下(1)將殼聚糖溶解在濃度能保證殼聚糖充分溶解且溶解后所得溶液pH大于5. 0的 乙酸溶液中，制得殼聚糖濃度為0. 02g/ml的殼聚糖酸溶液，滅菌，于冰浴中放置至少15分 鐘(防止凝結(jié))，備用；(2)將β -甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得濃度為0. 35 0. 85g/ml的β -甘油磷 酸鈉溶液，過(guò)濾除菌，于冰浴中放置至少15分鐘(防止凝結(jié))，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將殼聚糖酸溶液與β -甘油磷酸鈉溶液混合，其中， 殼聚糖與β-甘油磷酸鈉的質(zhì)量比為2 (3. 5 8. 5)，混合后繼續(xù)攪拌8 12分鐘，得到 澄清、均質(zhì)的殼聚糖/ β “甘油磷酸鈉溶液，靜置1. 5 2. 5小時(shí)，脫泡；(4)將殼聚糖/β _甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得。所述步驟(1)中，滅菌為121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘。所述步驟(2)中，過(guò)濾除菌是用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌。上述制備方法制備的引導(dǎo)組織再生膜，具有多孔結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，其有效成分組成包括殼聚糖和β “甘油磷酸鈉，其中，殼聚糖的重量百分比為19. 0 36. 4%, β -甘油磷酸鈉的重量百分比為63. 6 81. 0% ；屏障膜具有多孔的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)(可 根據(jù)β-甘油磷酸鈉的重量百分比調(diào)節(jié)孔徑大小)；具有一定的抗拉強(qiáng)度；具有生物降解性 能；具有良好的生物相容性。使用時(shí)，將屏障膜植入體內(nèi)，起到隔離周?chē)浗M織的長(zhǎng)入、隔離周?chē)M織的長(zhǎng)入的 功能，為牙周組織和骨組織的再生提供空間。另外，也可以將步驟(3)制備得到的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液直接注入體內(nèi)， 在人體體溫下，自然成膜。本發(fā)明是利用殼聚糖溶液中加入弱堿性的β -甘油磷酸鈉具有溫度相轉(zhuǎn)變的特 性，在37°C完成脫水后，形成透明略帶黃色的生物膜，具有多孔的結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出了一定的 硬度和韌性。本發(fā)明的引導(dǎo)組織再生膜其合成方法簡(jiǎn)單，成膜條件溫和，具有良好的細(xì)胞生物 相容性，符合生物體內(nèi)應(yīng)用的要求，作為一種新型生物膜具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為紅外光譜分析曲線圖，其中，曲線a 殼聚糖；曲線b β _甘油磷酸鈉；曲線 c:殼聚糖+5% β-甘油磷酸鈉(Α膜)；曲線d:殼聚糖+10% β-甘油磷酸鈉(B膜)。圖2為L(zhǎng)929細(xì)胞形態(tài)示意圖，其中，a 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；b 經(jīng)過(guò)胰酶消化后接種； (倒置相差顯微鏡X10)。圖3為實(shí)施例1所制備得到的組織再生膜的形態(tài)圖，其中，a 正面圖；b 側(cè)面圖。圖4為實(shí)施例1所制備得到的組織再生膜在電鏡下的形貌圖，其中，a 殼聚糖 +5% β-甘油磷酸鈉所制備的屏障膜表面形貌；b:殼聚糖+10% β-甘油磷酸鈉所制備的 屏障膜表面形貌。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)1.材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料1. 1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株小鼠成纖維細(xì)胞株(L929 cells)由山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。1. 1.2主要試劑殼聚糖(脫乙酰度95%，海得貝生物技術(shù)有限公司，濟(jì)南)，五水β-甘油磷酸鈉 (Sigma, USA)，MTT (Sigma公司，美國(guó))，DMEM(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)， 胰酶(Amres公司，美國(guó))，胎牛血清(上海復(fù)蒙生物制品公司)，其余試劑均為分析純。1.1. 3儀器與設(shè)備萬(wàn)能電子測(cè)力儀(新三思有限公司，深圳)，紅外光譜儀(VRTEX 70，Bruker Opti 殼聚糖，德國(guó))，電子分析天平(賽多利斯股份公司，德國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德 國(guó))，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(MK-3，上海雷勃分析儀器公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，高速離心機(jī)(TDL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)，微量移液器(Eppendof公司，德 國(guó))，恒溫水浴箱(DK-8B，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、磁力攪拌器(90-2型，上海滬西分 析儀器廠)、電子PH計(jì)(Orion Research公司，美國(guó))、測(cè)厚儀(六菱儀器設(shè)備有限公司，上 海)。1. 2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1殼聚糖/ β _甘油磷酸鈉溶液的制備及溫敏特性將適量的殼聚糖粉末溶入0. IM乙酸溶液，磁力攪拌2小時(shí)，最終形成濃度為 0. 02g/ml的殼聚糖溶液，121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘。0. 5g，1. Og五水β -甘油磷酸鈉分 別溶解于Iml去離子水，0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌。配制前分別將殼聚糖與β-甘油磷酸鈉溶 液置于0°C冰浴15分鐘防止凝結(jié)，分別取殼聚糖溶液各IOmL在冰浴中磁力攪拌(200rpm) 逐滴加入兩種不同濃度的β _甘油磷酸鈉溶液，混合后繼續(xù)攪拌10分鐘，最終獲得澄清、均 質(zhì)的A (含β -甘油磷酸鈉0. 5g)、B (含β -甘油磷酸鈉1. Og)兩組溶液。殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉混合溶液室溫靜置約2h脫泡，采用倒置法觀察其溫敏凝 膠特性。取2mL注入直徑為12mm的玻璃管中，放入37°C恒溫水浴箱。每隔一分鐘取出玻璃 管并倒置觀察溶液的流動(dòng)性，倒置30秒溶液不流動(dòng)的時(shí)間點(diǎn)計(jì)為凝膠時(shí)間。1. 2. 2殼聚糖/ β _甘油磷酸鈉膜的制備分別取Α、Β兩組溶液0. 5ml注入24孔板(每組5復(fù)孔)，放入37°C電動(dòng)恒溫箱中 凝膠并自然干燥，紫外線消毒30min，備用。另外，將IOml兩組溶液注入培養(yǎng)皿(直徑4cm) 中，水平置入37°C電動(dòng)恒溫箱中干燥成膜，進(jìn)行物理特性分析和拉伸強(qiáng)度測(cè)量。1.2. 3膜的表征材料樣品研磨成粉后KBr壓片，在^ΟΟ-δΟΟοπΓ1波長(zhǎng)范圍進(jìn)行傅里葉紅外光譜分 析。同時(shí)采集純殼聚糖與甘油磷酸鈉粉末的紅外光譜圖，進(jìn)行對(duì)照分析。 培養(yǎng)皿中的復(fù)合膜經(jīng)ΡΗ7. 4的PBS液浸泡24h，切割成10 X 30mm長(zhǎng)方形，并測(cè)量厚 度，重復(fù)5次，取均值。在室溫條件下采用萬(wàn)能拉伸機(jī)測(cè)量拉伸強(qiáng)度，每組重復(fù)測(cè)量5次，取 均值。1. 2. 4細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為三組實(shí)驗(yàn)組(A，B組)和空白對(duì)照組(C組)。實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理在24孔板 成膜后，經(jīng)紫外線照射30min，樣品用75%酒精浸泡2h，消毒的去離子水反復(fù)沖洗并吸干。 每孔中加入500 μ LDMEM培養(yǎng)液，浸泡2h，吸干。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L929細(xì)胞，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，用2. 5g/L胰蛋白酶消化單層細(xì)胞， 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成IX 105/mL單個(gè)細(xì)胞懸液。按每孔300 μ L將L929 細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)(約3Χ IO4/孔)，在37°C、5% C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵 育24小時(shí)后吸去原培養(yǎng)液，按500 μ L/孔加入新培養(yǎng)液，隔日換液。分別培養(yǎng)3、4、5d，各 觀察時(shí)間點(diǎn)取出1塊培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5g/L)100yL，37°C繼續(xù)孵育 4h后終止培養(yǎng)，小心吸去上清液，每孔加入750 μ L 二甲基亞砜(DMSO)振蕩15min，使結(jié)晶 充分溶解，吸取上清150 μ L移入96孔板中，在490nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度(A)值。1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11. 0統(tǒng)計(jì)軟件，A值和細(xì)胞相對(duì)增殖率均采用均數(shù)士標(biāo) 準(zhǔn)差(i±s)表示，各時(shí)間點(diǎn)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用
5Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗(yàn)，設(shè)定 α = 0.05。2.結(jié)果2. 1殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溶液的溫敏特性與成膜性A、B兩種溶液在37°C下均可形成凝膠，β -甘油磷酸鈉含量越高，凝膠時(shí)間越短。 在37°C電熱溫箱中約24-48小時(shí)干燥成膜，β-甘油磷酸鈉濃度越高其成膜速度越快。當(dāng) 凝膠脫水達(dá)到一定時(shí)間后，殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉復(fù)合膜表現(xiàn)出良好的可塑性和韌性，干 燥后表現(xiàn)出一定的強(qiáng)度和脆性，再用ΡΗ7. 4的PBS浸泡后，膜恢復(fù)一定的柔韌性，抗拉強(qiáng)度 隨β -甘油磷酸鈉含量增高而降低(表1)。表1.殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉復(fù)合膜的特性 2. 2殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溫敏凝膠膜的紅外光譜分析殼聚糖的紅外光譜分析如圖Ia所示，位于3435CHT1的寬峰是N-H與0_Η基團(tuán)聯(lián)合 振動(dòng)吸收峰重疊所致。C-H對(duì)稱與非對(duì)稱吸收峰位于ΖδΤΘΙΘΖ^πΓ1，C = 0伸縮振動(dòng)峰位 于1656CHT1 (氨基I)，N-H變形振動(dòng)吸收峰位于1598CHT1 (氨基II)，C-O伸縮振動(dòng)吸收峰分 別位于1155、1091和1032CHT1。β -甘油磷酸鈉的紅外光譜特征如下在3254CHT1處的寬 峰是O-H振動(dòng)吸收峰，無(wú)機(jī)相PO43-的伸縮振動(dòng)吸收峰值位于gOO-^OOcnT1，彎曲振動(dòng)吸收峰 位于 500-700CHT1 (圖.Ib)。通過(guò)比較殼聚糖/ β _甘油磷酸鈉復(fù)合膜樣品的紅外光譜(圖lc、d)，殼聚糖原位 于3435CHT1的吸收峰發(fā)生了紅移，說(shuō)明殼聚糖的N-H基與β -甘油磷酸鈉的O-H基結(jié)合形 成共價(jià)鍵。殼聚糖氨基Ι、ΙΙ的特征峰也發(fā)生了紅移，暗示氨基與磷酸根之間形成化學(xué)鍵結(jié) 合。磷酸根特征峰仍然存在，說(shuō)明仍存在較多未結(jié)合的單體甘油磷酸鈉，這與殼聚糖/ β-甘油磷酸鈉體系中部分β-甘油磷酸鈉只起到中和作用有關(guān)。同時(shí)，C-H對(duì)稱吸收峰值 減弱，也表明C-H與O-H基之間發(fā)生了靜電作用。2. 3殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溫敏凝膠膜的細(xì)胞生物相容性本實(shí)驗(yàn)采用的是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞(圖2a)，經(jīng)過(guò)胰酶消化后接種到孔 板內(nèi)(圖2b)。培養(yǎng)3、4、5d后各組材料的A值見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組A值均隨培養(yǎng) 天數(shù)的增加而升高，培養(yǎng)3、4、5d時(shí)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，但實(shí) 驗(yàn)組即A、B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。培養(yǎng)3、4、5d后各組材料的細(xì)胞相對(duì)增殖 率及材料毒性分級(jí)見(jiàn)表3。L929細(xì)胞第3、4、5d的相對(duì)增殖率均在300%以上，表明材料對(duì) 細(xì)胞沒(méi)有毒性，且能明顯促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖。表2培養(yǎng)3、4、5d后各組材料的吸光度值(S ±s，η = 5)
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增殖率 分級(jí) 增殖率 分級(jí)增殖率(%) 分 目前，可吸收性生物膜由于具有生物相容性好，無(wú)須二次手術(shù)取出等優(yōu)點(diǎn)，在牙 周組織再生和牙槽骨缺損的修復(fù)中已得到廣泛應(yīng)用。其原理是隔離周?chē)浗M織的長(zhǎng)入， 為牙周組織和骨組織的再生提供空間。膜的性能在一定程度上決定了 GTR和引導(dǎo)骨再生 (guided boneregeneration，GBR)技術(shù)的成敗。目前國(guó)內(nèi)外的膜產(chǎn)品存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、 價(jià)格高、不具有骨誘導(dǎo)作用等。本研究初探了殼聚糖/ β “甘油磷酸鈉溫敏凝膠膜的制備方 法，通過(guò)與L929細(xì)胞的共培養(yǎng)初步評(píng)價(jià)其細(xì)胞生物相容性。殼聚糖是甲殼素脫乙?；难苌?，具有良好的生物相容性、可降解活性以及促 進(jìn)組織再生活性。然而，殼聚糖一般僅能溶于稀酸性溶液，當(dāng)PH達(dá)到6. 2時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。當(dāng) 弱堿性的β-甘油磷酸鈉加入殼聚糖溶液后，二者間由于存在疏水作用、氫鍵及共價(jià)鍵等 靜電作用，可以在低溫或常溫下保持液體狀態(tài)，當(dāng)溫度升高后發(fā)生相轉(zhuǎn)變。殼聚糖/β _甘 油磷酸鈉復(fù)合溶液相轉(zhuǎn)變條件溫和、形成的凝膠具有良好的生物相容性、多孔的網(wǎng)狀支架 形態(tài)、一定的機(jī)械強(qiáng)度和空間保持能力等優(yōu)點(diǎn)。通常制備的殼聚糖產(chǎn)品往往需要堿性溶液的預(yù)處理等工序。本研究中，殼聚糖溶 于0. IM乙酸溶液后，加入弱堿性的β-甘油磷酸鈉混合形成PH中性的透明溶液。由于殼 聚糖的氨基與甘油磷酸鈉的磷酸根結(jié)合而甘油暴露，使殼聚糖沒(méi)有發(fā)生沉淀。但溫度 升高后，疏水作用加強(qiáng)而導(dǎo)致殼聚糖及其復(fù)合物析出形成凝膠。在37°C恒溫箱完成脫水過(guò) 程，形成透明略帶黃色的生物膜，并表現(xiàn)出了一定的硬度和韌性。通過(guò)觀察溶液的溫敏特性，β -甘油磷酸鈉含量越高，其形成凝膠和成膜的速度越 快，膜的厚度也隨之增加。由此推斷所形成的殼聚糖甘油磷酸鈉復(fù)合膜隨著甘油
7磷酸鈉的增加，所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑亦增加。而膜的多孔結(jié)構(gòu)有利于組織細(xì)胞的吸附及 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。紅外光譜分析殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉之間形成了以靜電作用為基礎(chǔ)的化學(xué)鍵結(jié) 合，使之在形成多孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上具備一定的機(jī)械強(qiáng)度。力學(xué)測(cè)定殼聚糖/ β “甘油磷酸鈉 溫敏凝膠膜在濕潤(rùn)狀態(tài)下的抗拉強(qiáng)度達(dá)到IMpa左右，符合體內(nèi)應(yīng)用的要求。L929細(xì)胞作為一種標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系，常用于體外評(píng)價(jià)生物材料的生物相容性。MTT 比色實(shí)驗(yàn)比較各時(shí)間點(diǎn)的A值，結(jié)果表明殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溫敏凝膠膜具有明顯的促 進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組A值之間差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。 其原因可能有以下兩點(diǎn)1.由于膜具有多孔結(jié)構(gòu)，其表面積大于單純的24孔板面積，接種 后有利于細(xì)胞的粘附和增殖。2.膜材料中的殼聚糖和β-甘油磷酸鈉都具有良好的生物相 容性，形成的殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉復(fù)合物具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用。4.結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，殼聚糖/ β _甘油磷酸鈉溫敏凝膠具有良好的成膜特性，其 合成方法簡(jiǎn)單，成膜條件溫和。殼聚糖/ β “甘油磷酸鈉復(fù)合膜具有良好的細(xì)胞生物相容 性，符合生物體內(nèi)應(yīng)用的要求，作為一種新型生物膜具有良好的應(yīng)用前景。實(shí)施例1制備引導(dǎo)組織再生屏障膜制備方法如下(1)將殼聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得殼聚糖濃度為0. 02g/ml的殼聚 糖酸溶液，121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(2)將β -甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得濃度為0. 56g/ml的β -甘油磷酸鈉溶 液，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將IOml殼聚糖酸溶液與Iml β -甘油磷酸鈉溶液混 合，混合后繼續(xù)攪拌10分鐘，得到澄清、均質(zhì)的殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溶液，靜置2小時(shí)， 脫泡；(4)將殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得。上述制備方法制備的組織再生膜，如圖3所示，其具有多孔結(jié)構(gòu)，如圖4所示，掃描 電鏡下可見(jiàn)，膜表面粗糙、多孔；其有效成分組成包括殼聚糖和甘油磷酸鈉，其中，殼聚 糖的重量百分比為26.3%，β-甘油磷酸鈉的重量百分比為73.7%。實(shí)施例2殼聚糖溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜的表征表征方法如下(1)紅外光譜分析材料樣品研磨成粉后KBr壓片，在^ΟΟ-δΟΟοπΓ1波長(zhǎng)范圍進(jìn)行傅里葉紅外光譜分 析。同時(shí)采集純殼聚糖與甘油磷酸鈉粉末的紅外光譜圖，進(jìn)行對(duì)照分析。通過(guò)比較殼聚糖/ β _甘油磷酸鈉復(fù)合膜樣品的紅外光譜(圖lc、d)，殼聚糖原位 于3435CHT1的吸收峰發(fā)生了紅移，說(shuō)明殼聚糖的N-H基與β -甘油磷酸鈉的O-H基結(jié)合形 成共價(jià)鍵。殼聚糖氨基Ι、ΙΙ的特征峰也發(fā)生了紅移，暗示氨基與磷酸根之間形成化學(xué)鍵結(jié) 合。磷酸根特征峰仍然存在，說(shuō)明仍存在較多未結(jié)合的單體甘油磷酸鈉，這與殼聚糖/ β-甘油磷酸鈉體系中部分β-甘油磷酸鈉只起到中和作用有關(guān)。同時(shí)，C-H對(duì)稱吸收峰值 減弱，也表明C-H與O-H基之間發(fā)生了靜電作用。
(2) X射線衍射分析殼聚糖粉末及實(shí)驗(yàn)樣品研磨成粉，采用日本Rigaku公司D/MAX-2500PC型X射線 衍射儀進(jìn)行分析。結(jié)果，殼聚糖粉末在β-甘油磷酸鈉的作用下，原位于2 θ =20.3°、11.46°以及 36.22°的衍射峰消失或減弱，衍射曲線變得平緩，表明殼聚糖結(jié)合了 甘油磷酸鈉分子 的磷酸根而結(jié)晶度降低。(3)掃描電鏡分析將溫敏凝膠制備的屏障膜室溫干燥，表面噴金，采用日本Hitachi公司，SU-70型 掃描電鏡進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)殼聚糖溫敏凝膠所成膜具有粗糙多孔的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，隨著β _甘油 磷酸鈉含量的增加，其孔徑越大，有利于細(xì)胞的附著、增殖和營(yíng)養(yǎng)成分的交換。實(shí)施例3殼聚糖溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜的體外細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)方法如下(1)主要試劑MTT(Sigma公司，美國(guó))，DMEM(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)，胰 酶(Amres公司，美國(guó))，胎牛血清(上海復(fù)蒙生物制品公司)，其余試劑均為分析純。(2)細(xì)胞培養(yǎng)和接種選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L929細(xì)胞，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，用2. 5g/L胰蛋白酶消化單層細(xì)胞， 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成IX 105/mL單個(gè)細(xì)胞懸液。按每孔300 μ L將L929 細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)(約3Χ IO4/孔)，在37°C、5% C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵 育24小時(shí)后吸去原培養(yǎng)液，按500 μ L/孔加入新培養(yǎng)液，隔日換液。(3) MTT比色實(shí)驗(yàn)分別培養(yǎng)3、4、5d，各觀察時(shí)間點(diǎn)取出1塊培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液 (5g/L) 100 μ L，37°C繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，小心吸去上清液，每孔加入750 μ L 二甲基亞 砜(DMSO)振蕩15min，使結(jié)晶充分溶解，吸取上清150 μ L移入96孔板中，在490nm波長(zhǎng)下 酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度(A)值。培養(yǎng)3、4、5d后各組材料的A值見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組A值均隨培養(yǎng) 天數(shù)的增加而升高，培養(yǎng)3、4、5d時(shí)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，但實(shí) 驗(yàn)組即A、B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。培養(yǎng)3、4、5d后各組材料的細(xì)胞相對(duì)增殖 率及材料毒性分級(jí)見(jiàn)表3。L929細(xì)胞第3、4、5d的相對(duì)增殖率均在300%以上，表明材料對(duì) 細(xì)胞沒(méi)有毒性，且能明顯促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖。實(shí)施例4制備引導(dǎo)組織再生屏障膜制備方法如下(1)將殼聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得殼聚糖濃度為0. 02g/ml的殼聚 糖酸溶液，121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(2)將β-甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得濃度為0.35g/ml的β -甘油磷酸鈉溶 液，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將IOml殼聚糖酸溶液與Iml β -甘油磷酸鈉溶液 混合，混合后繼續(xù)攪拌12分鐘，得到澄清、均質(zhì)的殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溶液，靜置1. 5小時(shí)，脫泡；(4)將殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得，其中， 殼聚糖的重量百分比為36.4%，β-甘油磷酸鈉的重量百分比為63.6%。實(shí)施例5制備引導(dǎo)組織再生屏障膜制備方法如下(1)將殼聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得殼聚糖濃度為0. 02g/ml的殼聚 糖酸溶液，121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(2)將β -甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得濃度為0. 85g/ml的β -甘油磷酸鈉溶 液，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，于冰浴中放置15分鐘以防止凝結(jié)，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將IOml殼聚糖酸溶液與Iml β -甘油磷酸鈉溶液混 合，混合后繼續(xù)攪拌8分鐘，得到澄清、均質(zhì)的殼聚糖/ β -甘油磷酸鈉溶液，靜置2. 5小時(shí)， 脫泡；(4)將殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得，其中， 殼聚糖的重量百分比為19.0%，β-甘油磷酸鈉的重量百分比為81.0%。
權(quán)利要求
一種溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)將殼聚糖溶解在濃度能保證殼聚糖充分溶解且溶解后所得溶液pH大于5.0的乙酸溶液中，制得殼聚糖濃度為0.02g/ml的殼聚糖酸溶液，滅菌，于冰浴中放置至少15分鐘，備用；(2)將β 甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得濃度為0.35～0.85g/ml的β 甘油磷酸鈉溶液，過(guò)濾除菌，于冰浴中放置至少15分鐘，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將殼聚糖酸溶液與β 甘油磷酸鈉溶液混合，其中，殼聚糖與β 甘油磷酸鈉的質(zhì)量比為2∶(3.5～8.5)，混合后繼續(xù)攪拌8～12分鐘，得到澄清、均質(zhì)的殼聚糖/β 甘油磷酸鈉溶液，靜置1.5～2.5小時(shí)，脫泡；(4)將殼聚糖/β 甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37℃干燥成膜，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜的制備方法，其特征在于所 述步驟(1)中，滅菌為121°C高壓蒸汽滅菌10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏凝膠引導(dǎo)組織再生屏障膜的制備方法，其特征在于所 述步驟(2)中，過(guò)濾除菌是用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的制備方法制備得到的引導(dǎo)組織再生屏障膜，其特征在 于其有效成分組成包括殼聚糖和甘油磷酸鈉，其中，殼聚糖的重量百分比為19.0 36. 4%, β-甘油磷酸鈉的重量百分比為63. 6 81. 0%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種溫敏凝膠引導(dǎo)的組織再生屏障膜的制備方法，步驟如下(1)將殼聚糖溶解在乙酸溶液中，制得殼聚糖酸溶液，滅菌，于冰浴中放置至少15分鐘，備用；(2)將β-甘油磷酸鈉溶于去離子水，制得β-甘油磷酸鈉溶液，過(guò)濾除菌，于冰浴中放置至少15分鐘，備用；(3)在不斷攪拌、冰浴條件下，將殼聚糖酸溶液與β-甘油磷酸鈉溶液混合，得到澄清、均質(zhì)的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液，靜置，脫泡；(4)將殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液注入平底容器中，37℃干燥成膜，即得。本發(fā)明的引導(dǎo)組織再生膜其合成方法簡(jiǎn)單，成膜條件溫和，具有良好的細(xì)胞生物相容性，符合生物體內(nèi)應(yīng)用的要求，作為一種新型生物膜具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L31/04GK101927036SQ20101025479
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者孫康寧, 崔軍, 徐欣, 梁杰 申請(qǐng)人:山東大學(xué)