專(zhuān)利名稱(chēng)：以殼聚糖和貝殼粉末為原料制備人工骨的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織工程及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人工骨的制備方 法，具體說(shuō)是一種以殼聚糖和貝殼粉末為原料制備人工骨的方法。
背景技術(shù)：
骨缺損是矯形外科臨床常見(jiàn)病例，通常采用自體骨移植、同種異體骨移植、帶血供 的游離骨移植等方法對(duì)其進(jìn)行治療。但這些方法普遍受材料來(lái)源的制約，為此，人們?cè)噲D通 過(guò)組織工程的方法來(lái)解決骨缺損的修復(fù)問(wèn)題。人工骨替代材料是近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)。人工骨的作用原理包括3個(gè)方面。①骨生成作用(osteogenesis)人工骨材料中 包含了具有分化成骨潛能的活細(xì)胞，具有骨形成作用；②骨傳導(dǎo)作用(osteoconduction) 人工骨材料通過(guò)促進(jìn)宿主骨與人工骨表面的結(jié)合，引導(dǎo)骨形成；③骨誘導(dǎo)作用 (osteoinduction)人工骨材料通過(guò)提供一種生物刺激，誘導(dǎo)局部細(xì)胞或移植的細(xì)胞分化 形成成熟的成骨細(xì)胞。1)人工骨研制中的材料應(yīng)用概況材料的選擇一直是生物可降解型人工骨研制工作的核心。許多種類(lèi)的材料被應(yīng)用 于此項(xiàng)研究中。在這些材料中，天然生物材料主要包括脫鈣骨基質(zhì)(DBM)，膠原，明膠，纖維 蛋白，硫酸軟骨素，殼聚糖，海藻酸鈉，絲素蛋白等。人工合成無(wú)機(jī)材料主要包括生物活性玻 璃陶瓷(BGC)，羥基磷灰石(HA)，磷酸三鈣(TCP)，磷酸鈣骨水泥(CPC)和硫酸鈣(CS)，半水 硫酸鈣(CSH)等。人工合成有機(jī)高分子材料主要包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚乳 酸和聚乙醇酸共聚物(PLGA)等。2)貝殼在人工骨研究中的應(yīng)用正逐步引起重視軟體動(dòng)物貝殼由三層結(jié)構(gòu)構(gòu)成，由內(nèi)到外依次是珍珠層、棱柱層和角質(zhì)層。貝殼由 95%左右的無(wú)機(jī)物和5%左右的有機(jī)物構(gòu)成。其無(wú)機(jī)組成相為碳酸鈣，有機(jī)組成相主要為蛋 白質(zhì)和多糖。貝殼具有優(yōu)良的力學(xué)性質(zhì)，來(lái)源豐富，價(jià)廉物美；貝殼的成分與骨器官相似，貝殼 的發(fā)育與骨修復(fù)的過(guò)程和機(jī)理非常相似；貝殼中還可能含有具有促進(jìn)生物礦化作用的信號(hào) 分子。所以，人們希望用貝殼制備人工骨，以實(shí)現(xiàn)其他材料所不能達(dá)到的骨修復(fù)效果。由于貝殼為弧形的片狀形態(tài)，其形態(tài)和厚度基本不能達(dá)到骨器官的要求，這就注 定了貝殼整體材料不適合于直接被加工成人工骨。將貝殼進(jìn)行粉碎制備成粉末，采用一定 的工藝按特定的骨形狀將貝殼粉末成型，這就成為以貝殼為材料研制人工骨的必然選擇。3)殼聚糖殼聚糖，英文名稱(chēng)Chitosan，是蝦蟹等無(wú)脊椎動(dòng)物的幾丁質(zhì)外骨骼經(jīng)脫乙酰反應(yīng) 后的產(chǎn)品。殼聚糖由于具有良好的生物相容性，而在生物醫(yī)學(xué)及制藥等方面得到了極其廣 泛的應(yīng)用。殼聚糖的規(guī)格主要是以其脫乙酰基程度(％ )來(lái)標(biāo)示的。殼聚糖難溶解于水相 介質(zhì)，但溶于稀酸。殼聚糖易與戊二醛發(fā)生交聯(lián)作用而形成水不溶性物質(zhì)，同時(shí)，其機(jī)械強(qiáng) 度得到加強(qiáng)。
4)貝殼粉末與羥基磷灰石的比較在人工骨的研究中，殼聚糖與羥基磷灰石復(fù)合是最普遍的材料組合方式。羥基磷 灰石是天然珊瑚的主要成分，與貝殼中的碳酸鈣晶體結(jié)構(gòu)的力學(xué)性質(zhì)相當(dāng)。但是二者又有 本質(zhì)的差異。在人工骨的研究中所使用的羥基磷灰石是通過(guò)化學(xué)方法所合成的，化學(xué)反應(yīng) 條件的細(xì)微變化均會(huì)嚴(yán)重影響其力學(xué)性質(zhì)。貝殼良好的力學(xué)性質(zhì)主要取決于碳酸鈣晶體與 貝殼中有機(jī)物的納米級(jí)相對(duì)空間幾何結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)在貝殼粉末中仍然得到了保持。從這 種意義上講，作為制備人工骨的材料，貝殼粉末優(yōu)于羥基磷灰石。同時(shí)，貝殼的成分與骨器 官相似，貝殼的發(fā)育與骨修復(fù)的過(guò)程和機(jī)理非常相似；貝殼中還可能含有具有促進(jìn)生物礦 化作用的信號(hào)分子。這些優(yōu)良性質(zhì)也是羥基磷灰石所不能比擬的。5)目前人工骨研究中所存在的問(wèn)題目前，在人工骨的研究中，人們普遍認(rèn)為高的孔隙率和直徑大于lOOum的孔徑有 利于細(xì)胞在人工骨中的生長(zhǎng)?；谶@樣的觀(guān)點(diǎn)，人們?cè)谌斯す堑难芯恐衅娴刈非蟾叩目?隙率和大的孔徑，所制備的人工骨每立方厘米所含干物質(zhì)的量不高于0. 1克，這樣的人工 骨材料幾乎沒(méi)有機(jī)械強(qiáng)度可言。由于機(jī)械強(qiáng)度差，植入體內(nèi)后形態(tài)不易保持。同時(shí)，也難以 進(jìn)行移植前的再整形。事實(shí)上，對(duì)于一種在體內(nèi)可以降解的人工骨而言，高的孔隙率和直徑 大于lOOum的孔徑并不是完全必要的。因?yàn)椋诓牧系闹鸩浇到饧凹?xì)胞對(duì)材料的逐步侵襲 過(guò)程之中，在材料中會(huì)自然形成一些滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移所需要的孔隙。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種以殼聚糖和貝殼粉末為材 料制備人工骨的方法，該方法著眼于骨傳導(dǎo)作用，在優(yōu)先考慮人工骨力學(xué)性能的前提下，兼 顧其孔隙率和孔徑。本發(fā)明依次通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)殼聚糖溶液的準(zhǔn)備稱(chēng)取一定量的殼聚糖，加入質(zhì)量比濃度為1 5%的乙酸 溶液，殼聚糖與質(zhì)量比濃度為1 5%的乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1 10 20，密封40°C 條件下待殼聚糖完全溶解，制得殼聚糖乙酸溶液；(2)混合液的制備稱(chēng)取一定量的貝殼粉末，貝殼粉末與步驟(1)殼聚糖的質(zhì)量比 為4 9 1，加入步驟(1)制得的殼聚糖乙酸溶液中，機(jī)械攪拌直至貝殼粉末在殼聚糖乙 酸溶液中分散均勻，得貝殼粉末乳液；(3)成型將步驟⑵所得貝殼粉末乳液倒入模具中，40°C條件下硬化后，去除模 具，冷凍干燥；(4)交聯(lián)將冷凍干燥后的材料浸沒(méi)于戊二醛，密封靜置24小時(shí)；(5)漂洗、高壓蒸汽滅菌全部倒掉戊二醛，置于自來(lái)水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)， 再用三蒸水漂洗3次，每次1小時(shí)，然后置于滅菌鍋中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；(6)冷凍干燥將材料冷凍干燥后密封保存。漂洗前可進(jìn)行整形，切割成長(zhǎng)方體或其它形狀。上述方法中所用的殼聚糖為國(guó)內(nèi)外市面銷(xiāo)售的藥用級(jí)別的殼聚糖，其脫乙酰度不 低于85%，貝殼粉末為經(jīng)機(jī)械粉碎后進(jìn)行篩分(400目)所得粉末。臨床使用在移植前，根據(jù)患者骨缺損部位對(duì)移植物形態(tài)的要求，可以將本材料切割成弧形、板狀、不規(guī)則形等任意形態(tài)。在貝殼的三層結(jié)構(gòu)中，角質(zhì)層直接與水體接觸，其粗糙的表面常粘附了大量雜質(zhì) 不易清除干凈，故在本發(fā)明方法中所使用的貝殼材料是背角無(wú)齒蛘貝殼去除角質(zhì)層后所剩 余部分，它包含了貝殼棱柱層和珍珠層。背角無(wú)齒蛘，學(xué)名An0d0nta woodiana(Lea 1834)，屬軟體動(dòng)物門(mén)，瓣鰓綱，蛘科， 俗稱(chēng)“河蛘”，營(yíng)淡水生，在重慶地區(qū)的資源貯量極其豐富。本方法所得人工骨適用于骨缺損部位的填充，其作用機(jī)理為骨傳導(dǎo)作用 (osteoconduction)，即通過(guò)促進(jìn)宿主骨與人工骨表面的結(jié)合，引導(dǎo)骨形成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所制備的人工骨與報(bào)道的相關(guān)研究相比，具有不可比擬的優(yōu)良力學(xué)性能， 彎曲模量達(dá)250-900MPa，壓縮模量達(dá)500_1300MPa，楊氏模量達(dá)160_280Mpa。同時(shí)，其內(nèi)部 的蜂窩狀結(jié)構(gòu)能夠滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。所采用的高壓蒸汽滅菌步驟，不但可以實(shí)現(xiàn)滅菌 的目的，還可以實(shí)現(xiàn)溫度對(duì)本人工骨內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)的改善。所制備的人工骨的孔隙率、孔徑 大小及生物力學(xué)參數(shù)等，可以根據(jù)殼聚糖及貝殼粉末的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)描述，下面的描述是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā) 明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 1)人工骨的制備(1)殼聚糖溶液的準(zhǔn)備稱(chēng)取殼聚糖12. 5克置于500毫升燒杯中，加入250毫升質(zhì)量比濃度為乙酸溶 液，用牛皮紙封住燒杯口，置入烘箱中(40°C，)，待殼聚糖完全溶解后取出。(2)混合液的制備稱(chēng)取112. 5克貝殼粉末，加入殼聚糖溶液中，機(jī)械攪拌直至貝殼粉末在殼聚糖溶 液中分散均勻。(3)成型將上述混合液倒入上述模具中，置入烘箱中(40°C，)，待硬化到一定程度后，破壞 并去除模具，冷凍干燥。(4)交聯(lián)將上述材料置于大燒杯中，加入500毫升戊二醛，用牛皮紙封住燒杯口，靜置24小 時(shí)。(5)漂洗全部倒掉燒杯中的戊二醛，置于自來(lái)水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)。(6)整形取出材料，切割成60mm(寛)X60mm(高)XlOOmm(長(zhǎng))的長(zhǎng)方體。(7)漂洗將整形后的材料用三蒸水漂洗3次，每次1小時(shí)。(8)高壓蒸汽滅菌
將材料置于滅菌鍋中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。(10)冷凍干燥將材料冷凍干燥后密封保存。2)性能檢測(cè)(1)采用掃描電鏡觀(guān)察其斷面結(jié)構(gòu)。(2)孔隙率的測(cè)定采用比重法，在室溫條件下測(cè)定選用一個(gè)比重瓶，加滿(mǎn)蒸餾水并稱(chēng)質(zhì)量(Ml)；把 質(zhì)量為Ms的樣品浸入蒸餾水中，抽真空，使樣品中的氣體完全被蒸餾水取代，待比重瓶補(bǔ) 滿(mǎn)蒸餾水后稱(chēng)質(zhì)量(M2)；將浸透了蒸餾水的樣品取出，稱(chēng)剩余的蒸餾水與比重瓶的質(zhì)量 (M3)。計(jì)算公式e = (M2-M3-Ms) / (M1-M3) X 100 %(3)力學(xué)性能檢測(cè)將樣品在CMT6503型微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上測(cè)試彎曲模量、壓縮模量和拉伸 強(qiáng)度，加載速度為lmm/min。(4)生物安全性檢測(cè)①供試液準(zhǔn)備取樣品lg，生理鹽水中下浸提24h(37士 1°C )，常溫下8000rpm離心5min，取上清 液作為供試液備用，并將生理鹽水作為對(duì)照。②過(guò)敏性試驗(yàn)隨機(jī)抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七組，分別用已配制好的7種供試液，對(duì)七 組小白鼠進(jìn)行腹腔注射，觀(guān)察15min內(nèi)小白鼠有無(wú)爪搔鼻、噴嚏、豎毛、干嘔或咳嗽三聲以 上、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡等反應(yīng)，并記錄結(jié)果；第3天，進(jìn)行第二次腹腔 注射；第5天，進(jìn)行第三次腹腔注射；第14天，進(jìn)行第一次尾靜脈攻擊，觀(guān)察15min內(nèi)小白鼠 的反應(yīng)，并記錄結(jié)果；第15天、第16天、第17天陸續(xù)完成靜脈注射；第19天，進(jìn)行第二次尾 靜脈攻擊。如兩次攻擊小白鼠均未出現(xiàn)明顯的上述過(guò)敏現(xiàn)象，即可認(rèn)為受試品不會(huì)引起過(guò) 敏反應(yīng)。③動(dòng)物急性(單劑量)毒性隨機(jī)抽取32只小白鼠，雌雄各半，分成八組，分別用已配制好的7種供試液對(duì)七組 小白鼠進(jìn)行靜脈注射，另外一組用生理鹽水作陰性對(duì)照。觀(guān)察小白鼠的生長(zhǎng)情況，并記錄小 白鼠的體重。④皮膚刺激試驗(yàn)隨機(jī)抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七組，分別用已配制好的7種供試液對(duì)七組 小白鼠進(jìn)行試驗(yàn)。在脊柱兩側(cè)各選3個(gè)2 3cm3面積的去毛區(qū)，將試驗(yàn)樣品斑貼，左側(cè)3 點(diǎn)為供試液，右側(cè)3點(diǎn)為生理鹽水，用4層25mmX25mm紗布覆蓋，包扎固定。4h后除去斑貼 物，并標(biāo)記斑貼部位，用溫水或70%乙醇清潔后吸干，觀(guān)察斑貼部位的反應(yīng)。每12h重復(fù)一 次，連續(xù)7天，后續(xù)觀(guān)察7天，并記錄結(jié)果。⑤溶血試驗(yàn)取2.0士0.2kg的白兔1只，自心臟取血20ml，用玻璃棒攪拌除去血塊，加入生理鹽 水7ml，肝素1ml，混合后4°C下，2200rpm,離心lOmin，分離，棄去上清，用生理鹽水反復(fù)離心清洗，直至上清不呈紅色，然后按所得紅細(xì)胞容積，用生理鹽水配成2 %的懸液，即用移液槍 按0.2ml 9. 8ml (血細(xì)胞生理鹽水)的比例配置。添加順序供試液、生理鹽水，37°C水浴10min，2%紅細(xì)胞懸液，37°C水浴，觀(guān)察 15min，結(jié)果無(wú)棕色絮狀沉淀；然后1000rpm，5min離心，取上清液，用UV-2100分光光度計(jì) 測(cè)定各吸收值，以生理鹽水為對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)為質(zhì)地均一的蜂窩狀，孔隙率20-35%;孔徑15-50微米。 彎曲模量250-800MPa，壓縮模量500_1250MPa，楊氏模量為160_200Mpa。生物安全性測(cè)試表 明，樣品的安全性指標(biāo)合格。實(shí)施例2 1)人工骨的制備(1)殼聚糖溶液的準(zhǔn)備稱(chēng)取殼聚糖6克置于200毫升燒杯中，加入60毫升質(zhì)量比濃度為3 %的乙酸溶液， 用牛皮紙封住燒杯口，置入烘箱中(40°C，)，待殼聚糖完全溶解后取出。(3)混合液的制備稱(chēng)取24克貝殼粉末，加入殼聚糖溶液中，機(jī)械攪拌直至貝殼粉末在殼聚糖溶液中 分散均勻。(4)成型(如實(shí)施例1)(5)交聯(lián) 將上述材料置于大燒杯中，加入100毫升戊二醛，用牛皮紙封住燒杯口，靜置24小 時(shí)。(6)漂洗(如實(shí)施例1)(7)整形取出材料，切割成30mm(寛)X30mm(高)X60mm(長(zhǎng))的長(zhǎng)方體。(8)漂洗(如實(shí)施例1)(9)高壓蒸汽滅菌(如實(shí)施例1)(10)冷凍干燥(如實(shí)施例1)2)性能檢測(cè)(如實(shí)施例1)檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)為質(zhì)地均一的蜂窩狀，孔隙率10-15%;孔徑15-30微米。 彎曲模量500-900MPa，壓縮模量600_1350MPa，楊氏模量為200_280Mpa。生物安全性測(cè)試表 明，樣品的安全性指標(biāo)合格。實(shí)施例3 1)人工骨的制備(1)殼聚糖溶液的準(zhǔn)備稱(chēng)取殼聚糖8克置于200毫升燒杯中，加入100毫升質(zhì)量比濃度為5%的乙酸溶 液，用牛皮紙封住燒杯口，置入烘箱中(40°C，)，待殼聚糖完全溶解后取出。(3)混合液的制備稱(chēng)取42克貝殼粉末，加入殼聚糖溶液中，機(jī)械攪拌直至貝殼粉末在殼聚糖溶液中 分散均勻。(4)成型(如實(shí)施例1)
(5)交聯(lián)將上述材料置于大燒杯中，加入100毫升戊二醛，用牛皮紙封住燒杯口，靜置24小 時(shí)。(6)漂洗(如實(shí)施例1)(7)整形取出材料，切割成40mm(寛)X40mm(高)X70mm(長(zhǎng))的長(zhǎng)方體。(8)漂洗(如實(shí)施例1)(9)高壓蒸汽滅菌(如實(shí)施例1)(10)冷凍干燥(如實(shí)施例1)2)性能檢測(cè)(見(jiàn)實(shí)施例1)檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)為質(zhì)地均一的蜂窩狀，孔隙率18-32%;孔徑15-45微米。 彎曲模量350-750MPa，壓縮模量550-1 lOOMPa,楊氏模量為180_260Mpa。生物安全性測(cè)試表 明，樣品的安全性指標(biāo)合格。
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權(quán)利要求
一種以殼聚糖和貝殼粉末為原料制備人工骨的方法，其特征在于，依次通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)殼聚糖溶液的準(zhǔn)備稱(chēng)取一定量的殼聚糖，加入質(zhì)量比濃度為1～5％的乙酸溶液，殼聚糖與質(zhì)量比濃度為1～5％的乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1∶10～20，密封40℃條件下待殼聚糖完全溶解，制得殼聚糖乙酸溶液；(2)混合液的制備稱(chēng)取一定量的貝殼粉末，貝殼粉末與步驟(1)殼聚糖的質(zhì)量比為4～9∶1，加入步驟(1)制得的殼聚糖乙酸溶液中，機(jī)械攪拌直至貝殼粉末在殼聚糖乙酸溶液中分散均勻，得貝殼粉末乳液；(3)成型將步驟(2)所得貝殼粉末乳液倒入模具中，40℃條件下硬化后，去除模具，冷凍干燥；(4)交聯(lián)將冷凍干燥后的材料浸沒(méi)于戊二醛，密封靜置24小時(shí)；(5)漂洗、高壓蒸汽滅菌全部倒掉戊二醛，置于自來(lái)水龍頭下，流水沖洗2小時(shí)，再用三蒸水漂洗3次，每次1小時(shí)，然后置于滅菌鍋中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；(6)冷凍干燥將材料冷凍干燥后密封保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的貝殼材料是背角無(wú)齒蛘貝殼去 除角質(zhì)層后所剩余部分，它包含了貝殼棱柱層和珍珠層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用的殼聚糖為國(guó)內(nèi)外市面銷(xiāo)售的藥 用級(jí)別的殼聚糖，其脫乙酰度不低于85%，貝殼粉末為經(jīng)機(jī)械粉碎后進(jìn)行400目篩分所得 粉末。
全文摘要
一種以殼聚糖和貝殼粉末為原料制備人工骨的方法。所述的殼聚糖為國(guó)內(nèi)外市面銷(xiāo)售的藥用級(jí)別的殼聚糖，其脫乙酰度不低于85％。所述的貝殼粉末為背角無(wú)齒蚌貝殼去除角質(zhì)層后所剩余部分，它包含了貝殼棱柱層和珍珠層。所制備的人工骨彎曲模量達(dá)250-900MPa，壓縮模量達(dá)500-1300MPa，楊氏模量達(dá)160-280MPa。同時(shí)，其內(nèi)部的蜂窩狀結(jié)構(gòu)能夠滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求?？紫堵?、孔徑大小及生物力學(xué)參數(shù)等，可以根據(jù)殼聚糖及貝殼粉末的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。適用于骨缺損部位的填充，其作用機(jī)理為骨傳導(dǎo)作用(osteoconduction)，即通過(guò)促進(jìn)宿主骨與人工骨表面的結(jié)合，引導(dǎo)骨形成。
文檔編號(hào)A61L27/44GK101856515SQ201010192439
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者劉彬, 張耀光, 戴麗, 王志堅(jiān), 蒲德永 申請(qǐng)人:西南大學(xué)