專利名稱：一種吡啶甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種吡啶甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物 中的應(yīng)用。具體涉及N2，N5-雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙基]_2，5-吡啶甲酰胺在制備抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
親環(huán)素Cycliphilins(CyPs)是普遍分布的細(xì)胞內(nèi)蛋白，在植物、細(xì)菌和哺乳 動(dòng)物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環(huán)孢素A的細(xì)胞受體被發(fā)現(xiàn)的。環(huán)孢素 A(CyclosporinA,CsA)是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的含11個(gè)氨基酸的環(huán)狀多肽，是一種 用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制劑，已被廣泛用于臨床，年銷售額在50億美元 以上。由于CsA用于臨床以來表現(xiàn)出各種毒副作用，對患者及移植物存活率的影響越來越 引起人們的重視，許多科學(xué)研究者正在努力尋找與CsA作用類似的、毒副作用低的替代物。 目前CsA也已經(jīng)開始用于腫瘤治療當(dāng)中，并且主要是與其它抗癌藥物如紫杉醇、阿霉素、長 春新堿等搭配使用，增強(qiáng)這些藥物的抗腫瘤活性(Clin Cancer Res. 11，2320-2326)。因?yàn)?環(huán)孢菌素A同時(shí)也是極為有效的免疫抑制劑，因此用于這些疾病的治療時(shí)不可避免會(huì)帶來 免疫抑制的副作用?？朔庖咭种频姆椒ㄖ饕獌煞N，一是對環(huán)孢菌素A的免疫抑制基團(tuán)進(jìn) 行修飾，或者從真菌中提取非免疫抑制的環(huán)孢菌素衍生物；另一種方法是根據(jù)CYP蛋白的 結(jié)構(gòu)，篩選或設(shè)計(jì)新的非肽類小分子抑制劑。CyPs廣泛分布于從微生物到哺乳動(dòng)物的各類物種中。Cyclophilin A(CyPA)是首 先從牛的胸腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的CyP家族中第一個(gè)成員，并驗(yàn)證它具有PPIase活性(Science， 226,544-547 ；Nature 337,473-478)。重組人 T 細(xì)胞的 cyclophilin A(hCyPA)的三維 結(jié)構(gòu)及它與CsA、四肽及一些二肽形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)已有報(bào)道(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 88,9483-9487 ；J. Mol. Biol. 228,539-550 ;J. Mol. Biol. 234, 1119-1130.； Nature,353,276-279 ；Proc.Natl.Acad. Sci. U. S. A. 88,3324-3328 ；Biochemistry,35, 7362-7368)。CyPA與HIV相關(guān)蛋白質(zhì)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)也已報(bào)道(Cell，87，1285-1294 ； Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成員與CyPA具有序列同源性及三維結(jié)構(gòu)類似 的特性(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90，11850-11854 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91， 5183-5186 ;J. Mol. Biol. 331,45-56)。CyPJ是CyP家族的新成員，CYP-J cDNA長1. 25Kb，編碼161個(gè)氨基酸，已從人的 胎腦cDNA文庫中分離并鑒定(Cytogenet. Cell Genet. 92，231-236)。在氨基酸序列上與線 蟲(C. elegans.) CYP10具有72%的同源性。其具體核苷酸和氨基酸序列詳見NCBI網(wǎng)站上 基因登陸號(hào)為AF146799的基因報(bào)告。CYPJ蛋白能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的克隆形成率，可以促進(jìn)肝 癌細(xì)胞物質(zhì)的復(fù)制增殖，并且能促進(jìn)肝癌腫瘤細(xì)胞生長，因此，可以作為篩選抗肝癌藥劑的 靶標(biāo)。惡性腫瘤已成為人類致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗腫瘤藥物均有各 種不良反應(yīng)，因此，尋找新型的低副作用抗腫瘤藥物成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種吡啶甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體涉 及N2，N5-雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙基]_2，5-吡啶甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的抗腫瘤藥物為針劑或者片劑。所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物或者抗宮頸 癌藥物。本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，即將N2，N5_雙[2_(3，4_二甲氧苯 基)乙基]-2，5-吡啶甲酰胺加入腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中。所述的腫瘤細(xì)胞可以是肝癌細(xì)胞或者宮頸癌細(xì)胞等。具體的說，所述的腫瘤細(xì)胞 是例如QGY細(xì)胞或者SK-H印1細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞，或者例如Hela細(xì)胞的宮頸癌細(xì)胞。加入FD7的具體方法可以采用實(shí)施例4中所采用的方法，或者其它常規(guī)的操作。本發(fā)明的N2，N5-雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙基]-2，5-吡啶甲酰胺(即『2 ， N~ 5 ~ -bis [2_ (3,4-dimethoxyphenyl) ethyl] -2, 5-pyridinedicarboxamide)，在本發(fā)明中 簡稱為FD7。本發(fā)明的N2，N5_雙[2_(3，4_ 二甲氧苯基)乙基]-2，5_吡啶甲酰胺，其分子量為 493. 56，結(jié)構(gòu)式為 其相關(guān)信息如下化合物Id :AK-968/13026076MDL 號(hào)MFCD01835541先前對于本發(fā)明的FD7的研究主要集中在其是一種CypJ抑制劑，BIAcore分子互 作儀驗(yàn)證其能與CypJ結(jié)合，其平衡-解離常數(shù)KD(M) :4.64X10_5。其次，通過a -胰凝乳 蛋白酶活性測定法(a-chymotrypsin-coupled enzymic assay)測得本發(fā)明的N2，N5-雙 [2- (3,4- 二甲氧苯基)乙基]-2，5-吡啶甲酰胺，其酶活抑制IC50值(y M)為56. 3士2. 67。進(jìn)一步的研究表明，本發(fā)明的CypJ小分子抑制劑FD7對腫瘤細(xì)胞生長有抑制作 用。本發(fā)明測定了 FD7對肝癌細(xì)胞QGY細(xì)胞的殺傷情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)D7對腫瘤細(xì)胞 SK-Hepl和Hela細(xì)胞有一定程度的殺傷力。此外，F(xiàn)D7還能夠有效降低QGY細(xì)胞的克隆形 成率。因此，本發(fā)明的FD7能夠抑制CYPJ的活性或者表達(dá)量，對于CYPJ表達(dá)量高的腫瘤 細(xì)胞殺傷效果更好。本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué)合成的方法。利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FD7發(fā)生相互作 用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效 果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH 通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而 有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌 內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的人FD7為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物 組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不 限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本 發(fā)明的人FD7可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通 過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物 組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量， 例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD7還可與其他治 療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的人FD7被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的FD7施用于哺乳動(dòng)物，其中 該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千 克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還 應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明提供了小分子化合物N2，N5_雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙基]_2，5_吡啶甲 酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該化合物能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。FD7是針對細(xì) 胞靶點(diǎn)CYPJ設(shè)計(jì)的藥物，不易形成耐藥性，而且，對于高表達(dá)CYPJ蛋白的腫瘤細(xì)胞效果特 別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)，抑瘤效果明顯，特異 性好。因此，本發(fā)明的FD7可以作為新的抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)，為治療和治愈腫瘤提供了一 種新的途徑和手段。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例ICypJ小分子抑制劑的虛擬篩選在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，檢索到了人類CYPA蛋白的X光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代 碼1CWA)。這個(gè)結(jié)構(gòu)是CYPA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。從這 個(gè)結(jié)構(gòu)中，確定了 CYPA的活性位點(diǎn)，并且確定了活性位點(diǎn)中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān) 鍵氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)CYPJ與CYPA高度同源的序列，我們與中國科學(xué)院上海藥物所合作， 建立了 3D結(jié)構(gòu)模型，并且在此后的蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析時(shí)也得到了證實(shí)(CYPJ PDB代碼 1XYH)。針對CypJ活性位點(diǎn)，對若干小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫 主要包括SPECS和CNPD。最后篩選到了本發(fā)明的FD7。整個(gè)計(jì)算過程是在中科院上海藥物 所64CPU-SGI 0RIGN3800計(jì)算機(jī)和上海超算中心392CPU-神威I超級(jí)計(jì)算機(jī)上進(jìn)行的。實(shí)施例2利用BIAcore分子互作儀驗(yàn)證虛擬篩選結(jié)果BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實(shí)現(xiàn)跟蹤生物分子間的相互作用，無需任何標(biāo)記物，因此最大限度的保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將目的生物分子 (CypJ蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶劑并且流過芯片表面。監(jiān)測 器能實(shí)時(shí)跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物分子結(jié)合、解離整個(gè)過程的變化。通 過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，本發(fā)明的N2，N5-雙[2- (3,4- 二甲氧苯基)乙基]_2，5-吡啶甲酰 胺與CypJ結(jié)合的平衡-解離常數(shù)KD(M) 4. 64X 10_5。實(shí)施例3利用酶活實(shí)驗(yàn)證明小分子化合物對CypJ酶活抑制的能力測定CyP活性的方法很多，但以a _胰凝乳蛋白酶活性測定法 (a -chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含月甫M酸的寡月太 底物，如 N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe 對硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide)在溶液中其順式、反式結(jié)構(gòu)處于平衡，CyP能催化該底物發(fā)生順反異構(gòu)作 用，即催化脯氨酸由順式變?yōu)榉词?；?dāng)其處于反式結(jié)構(gòu)時(shí)，C端p-nitroanilide被a -胰凝 乳蛋白酶裂解，釋放出色素基團(tuán)對硝基苯胺，在390nm連續(xù)測定吸光值的變化即可得知CyP 的PPIase活性。本發(fā)明以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定小分子配體在不同濃度 下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計(jì)算出小分子配體的IC5Q值。本發(fā)明的N2，N5-雙[2-(3， 4-二甲氧苯基)乙基]-2，5-吡啶甲酰胺(Interchim公司)其酶活抑制IC5(1值(y M)為 56. 3 士 2. 67。實(shí)施例4MTS法測定FD7對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用人肝癌細(xì)胞株SK-H印1細(xì)胞(ATCC公司)3X 103/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24小 時(shí)使之貼壁后加入FD7 (Interchim公司)，設(shè)6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在 37°C,5%C02條件下培養(yǎng)72小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)液，用MTS試劑盒(Promega公司)測定細(xì)胞 存活率，測試方法為將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗一遍，按照lOOiU/well的量加入預(yù)先配制 好的MTS顯色溶液(10ml無血清培養(yǎng)基中加入2ml溶液1和100 yl溶液2，充分混勻)。將 一個(gè)沒有細(xì)胞的孔設(shè)為本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼 續(xù)培養(yǎng)2 4小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀讀取光吸收值(參考波長630-700nm，測定波長490nm)， 計(jì)算細(xì)胞存活率，以測定孔光吸收值/對照孔光吸收值作為細(xì)胞存活率的數(shù)值。結(jié)果加入了 N2，N5-雙[2_(3，4_二甲氧苯基)乙基]_2，5_吡啶甲酰胺后，SK-H印1 細(xì)胞的數(shù)量約為對照的63%。用同樣的方法處理Hela細(xì)胞，結(jié)果Hela細(xì)胞的數(shù)量約為對照的70%。實(shí)施例5FD7對克隆形成率的影響QGY細(xì)胞(ATCC公司)1000個(gè)/皿接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，一組加入FD7，另一組 加入DMS0作為對照。連續(xù)培養(yǎng)15-20天時(shí)間，中間酌情換液。用室溫1 XPBS洗一次，加 2ml預(yù)冷的甲醇4°C固定lOmin。棄去固定用的甲醇，用預(yù)冷的1 XPBS洗一次，加GIMESA染 色劑，室溫染色lOmin，清水洗3遍，去浮色，拍照、計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞數(shù)目確定克隆大小，大于200個(gè)細(xì)胞的稱為大克隆，100-200個(gè)細(xì)胞之間 的稱為中克隆，50-100個(gè)細(xì)胞之間的稱為小克隆。比較大中克隆之間的差異，重復(fù)2次每 次三皿取平均值，加入FD7后QGY細(xì)胞所形成的克隆數(shù)顯著少于加入DMS0后所形成的克隆 數(shù)。這些結(jié)果提示，F(xiàn)D7能抑制細(xì)胞克隆形成。
權(quán)利要求
一種吡啶甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的甲酰胺衍生物是N2，N5 雙[2 (3，4 二甲氧苯基)乙基] 2，5 吡啶甲酰胺。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗腫瘤藥物為針劑或者片劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗宮頸癌藥物。
5.一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，將N2，N5-雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙 基]-2，5-吡啶甲酰胺加入腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是肝癌細(xì)胞或者宮頸癌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是H印G2細(xì)胞或者SK-Hepl 細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是Hela細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種吡啶甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了小分子化合物N2，N5-雙[2-(3，4-二甲氧苯基)乙基]-2，5-吡啶甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該化合物能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。該化合物針對細(xì)胞靶點(diǎn)CYPJ設(shè)計(jì)的藥物，不易形成耐藥性，而且，對于高表達(dá)CYPJ蛋白的腫瘤細(xì)胞效果特別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)，抑瘤效果明顯，特異性好，為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號(hào)A61K31/44GK101890010SQ20101017501
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者余龍, 張明君, 陳帥 申請人:復(fù)旦大學(xué)