專利名稱：一種以肝癌相關(guān)基因dlk1為靶點(diǎn)的核糖核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地,本發(fā)明涉及肝癌相關(guān)基因DLKl、 以其mRNA序列為靶點(diǎn)的一組siRNA、及其在制備診斷肝癌試劑、制備基因治療肝癌的藥物 中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例,每年死于肝病約30萬,其50%為原發(fā)性肝 癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%左右。絕大多數(shù)與HBV、HCV感染有關(guān)。肝癌發(fā)病率在 我國居2-3位,主要在青壯年男性發(fā)病,在華東地區(qū)的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，近年來， 有持續(xù)上升趨勢。在上海,肝癌的發(fā)病率居第三位,僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個(gè) 比例還有繼續(xù)上升的趨勢?，F(xiàn)在,肝癌,特別是肝炎病毒引起的肝癌已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國人 民生命安全。因此，非常有必要對(duì)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制作深入的研究。隨著人類基因組測序的完成，基因組學(xué)的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到以解析基因功能為 主的功能基因組學(xué)研究。功能基因組學(xué)的重點(diǎn)是以疾病為中心,全力解決人類疾病相關(guān)基 因研究中的重大科學(xué)問題。肝癌在我國素有“國病”之稱,經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的探索,對(duì)于肝癌 的早期診斷和治療雖然有了一定的認(rèn)識(shí)，但肝癌預(yù)后仍然很差，特別是對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了 解及治療藥物的新靶點(diǎn)方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關(guān)的基因，特別是尋找新 的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)。DLKl基因定位于染色體14q32上。DLKl是在胞外 區(qū)域包含6個(gè)EGF樣重復(fù)序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLKl首先是在脂肪前體細(xì)胞 中發(fā)發(fā)現(xiàn)，與脂肪細(xì)胞的分化緊密相關(guān)。DLKl基因具有抑制脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化 的功能。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)DLKl在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株等腫瘤細(xì)胞中 存在表達(dá)，表明DLKl基因可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)；同時(shí)在老鼠的胎肝細(xì)胞和膽汁淤積引起的 肝纖維化細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)DLKl的表達(dá)。在我們的前期肝癌及癌旁表達(dá)譜分析的研究中，發(fā)現(xiàn) DLKl基因在肝癌中的表達(dá)較癌旁組織中明顯增加，提示DLKl基因可能對(duì)肝癌的發(fā)生相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種肝癌相關(guān)基因DLKl的mRNA序列，蓋基因定 位在人染色體14q32上，可用于制備治療原發(fā)性肝癌的RNA千擾藥物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供肝癌相關(guān)基因DLKl的mRNA序列。本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，含有所述以DLKHraRNA為靶點(diǎn)的siRNA序列。本發(fā)明還提供一種含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種用于治療肝癌的試劑盒，其含有所述的以 DLKl上mRNA為靶點(diǎn)的siRNA。
在本發(fā)明的又--方面,還提供了一種用于治療肝癌的生物芯片，其含有以DLKl上 mRNA為靶點(diǎn)的siRNA。在本發(fā)明的又一方面，還提供了肝癌相關(guān)基因DLKl在制備診斷肝癌及腫瘤的試 劑，和制備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明由于對(duì)DLKl基因進(jìn)行了體外動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn),證實(shí)DLKl缺失能夠?qū)е赂文[ 瘤細(xì)胞顯著縮小，認(rèn)為DLKl基因在進(jìn)行制備治療肝癌的基因藥物中有巨大作用，可以成為 基因治療的靶點(diǎn)。


圖1是實(shí)施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLKlOl 1的RNA千擾效率示意圖,其 中，pSUPER為空載對(duì)照，pSUPER Luc+為陰性對(duì)照；圖2是實(shí)施例2中三次克隆實(shí)驗(yàn)中的一次的實(shí)驗(yàn)照片；圖3是實(shí)施例2中從上到下為Hep3B、HepG2和Huh-7細(xì)胞在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的克 隆數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖，其中，*表示與對(duì)照組比較時(shí)P值< 0. 05 ；圖4是實(shí)施例3中DLKl表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的IIuh 7細(xì)胞株的鑒定示意圖，其中， β -actin作為各樣品蛋白上樣量對(duì)照；圖5是實(shí)施例3中DLKl表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)Huh_7細(xì)胞株的生長曲線比較示意圖，其中， 細(xì)胞活力在450nm波長處測量，每點(diǎn)....I:: F所標(biāo)的黑色刻度線標(biāo)志為其標(biāo)準(zhǔn)差；圖6是實(shí)施例4中DLKl表達(dá)下調(diào)的Huh 7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性降低示意圖； 上圖為4周后攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周后取下的皮下腫瘤照 片,其中Huh-7pl011A4細(xì)胞在六周后仍無腫瘤形成；圖7是實(shí)施例5中SMMC-7721瞬間轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl后的生長曲 線示意圖；圖 8 是實(shí)施例 5 中 SMMC-7721 瞬間轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 0 和 pcDNA3. 0-DLKl 后的 Western Blotting分析鑒定圖，其中DLKl為轉(zhuǎn)染pcDNA3. O-DLKl質(zhì)粒,3. 0為轉(zhuǎn)染pcDNA3. 0質(zhì)粒， blank為沒有轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞，β -actin作為各樣品蛋白上樣量對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)--步詳細(xì)的說明。本發(fā)明的實(shí)施例如下所示實(shí)施例1構(gòu)建并鑒定DLKl的RNAi質(zhì)粒在本實(shí)施例中，引入pSUPER質(zhì)粒，以構(gòu)建能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行比較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RNAi 的質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有Hl-RNA多聚酶III基因啟動(dòng)子，將能轉(zhuǎn)錄出含有短鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA(shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER質(zhì)粒的該啟動(dòng)子之后，使此載體在轉(zhuǎn)染入細(xì) 胞后能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定合成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的shRNA，即達(dá)到比較穩(wěn)定的沉默目的基因的作用。在本實(shí)施例中所用的寡核苷酸序列如下1、pSUPER Luc+正 向 引 物 igatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaagtactcagcg taagtttttg gaaa
反 向 引 物agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttgaatcgaagta ctcagcgtaa gggg2、pSUPER DLK874 正 向 引 物；gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttgacacaggtga gacctttttg S3.0.3.反 向 引 物agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttgaatcttgaca caggtgagac cggg3、pSUPER DLKK) 11 正 向 引 物gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagctctttcatagg cacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca a&iaaggtgtc catgaaagag ctctctcttgaagagctctt tcataggcac cggg其中pSUPER Luc+質(zhì)粒，其RNAi所針對(duì)的片段為改良過的北美螢火蟲 (Photinuspyralis)螢光素酶基因的19個(gè)堿基片段。該基因Luc+是具有種屬特異性的報(bào) 告基因，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在該基因也不表達(dá)。因此，本實(shí)施例中pSUPER Luc+質(zhì)粒為 RNAi干擾體系的參照，以排除pSUPER Luc+質(zhì)粒在RNAi過程中可能出現(xiàn)的非特異的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。而pSUPERDLK874和pSUPER DLK1011質(zhì)粒干擾的靶序列分別針對(duì)DLKl基因序列第 874和第1011個(gè)堿基開始的連續(xù)19個(gè)堿基片段。將靶序列對(duì)應(yīng)的cDNA序列分別插入到正向引物(Forward primer)和反向引物 (Reverse primer)的前段空缺內(nèi)，同時(shí)將該cDNA的互補(bǔ)cDNA序列插入后段空缺,形成完整 的正向引物,共64個(gè)堿基。在得到人工合成DNA序列后,對(duì)正向引物和反向引物進(jìn)行退火 和磷酸化，隨后連接入pSUPER載體，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化進(jìn)行陽性克隆的篩選。利用pSUPER質(zhì)粒內(nèi)部固定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcorI和Hind III，對(duì)pSUPER Luc+質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。陽性克隆酶切后的條帶大小約為360bp,而陰性克隆酶切后為300bp。所挑選的8 個(gè)pSUPER Luc+克隆中左起第2和3號(hào)克隆酶切后的條帶略高于其它條帶，大小符合陽性 克隆的特征。選擇該兩個(gè)克隆經(jīng)測序鑒定發(fā)現(xiàn)3號(hào)克隆的序列完全符合目的序列片段。而 4個(gè)pSUPER DLKlOl 1克隆中，左起1、3、4號(hào)均為陽性,測序鑒定發(fā)現(xiàn)1號(hào)克隆的序列完全 符合目的序列片段。另外，pSUPER DLK874質(zhì)粒的鑒定篩選過程同上。最終得到該三個(gè)以 pSUPER為載體的RNAi質(zhì)粒。將構(gòu)建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011瞬間轉(zhuǎn)染入內(nèi)源性表達(dá)DLKl的HCC 細(xì)胞Huh-7、Hep3B 和 HepG2 中，并以 pSUPER Luc+為對(duì)照質(zhì)粒，用 Real-time Quantitative PCR鑒定其沉默DLKl基因表達(dá)的效果(見圖1)。圖1中的數(shù)據(jù)是以各樣品的管家基因β肌動(dòng)蛋白(β -actin)表達(dá)量為參考經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)平均值。本實(shí)施例中，DLKl的Real-timeQuaiititative PCR引物如下正向弓I物5，-gtactcggga aaggactgcc 3，反向引物5’ -ctcgcagaaa ttgcctgaga-3，所用探針·為5，-FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3'以上Real-time Quantitative PCR的實(shí)驗(yàn)每個(gè)都至少重復(fù)進(jìn)行3次。由圖1可見，由pSUPER載體介導(dǎo)的RNA干擾能使目的基因DLKl的表達(dá)在上述三種細(xì)胞內(nèi)下調(diào)50-60%。實(shí)施例2瞬間克隆形成試驗(yàn)(證明HCC細(xì)胞的DLKl表達(dá)抑制后其克隆形成能力降低)在鑒定pSUPER載體介導(dǎo)的RNAi有效的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)施例1中的三種內(nèi)源性表達(dá) DLKl的細(xì)胞進(jìn)行瞬間克隆形成試驗(yàn)(見圖2、圖3),并以無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的HCC細(xì)胞株 Bel-7402細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。將pSUPER 空載質(zhì)粒和 pSUPER DLK874、pSUPER DLKlOl 1 質(zhì)粒與 pcDNA3. 0 質(zhì)粒以 10比1的比例分別共轉(zhuǎn)染入HepSB, HepG2, Huh-7和Bel-7402細(xì)胞,此處pc!)NA3. 0質(zhì)粒 為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提供G418抗性。在轉(zhuǎn)染后，各對(duì)照組的分別取等量細(xì)胞分入IOOmm細(xì)胞 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并用含適當(dāng)濃度的G418的MEM或者DMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選并等待耐藥 克隆的形成。其中HepG2和G418篩選濃度為1000 μ g/ml, Ifep3B、Huh-7和Bel-7402均為 600 μ g/m!。待3-4周，克隆形成較為完全后染色并拍照保存?？梢钥吹?在內(nèi)源性DLKl被下調(diào)后，Hep3B, HepG2和Huh_7細(xì)胞形克隆形成的數(shù) 目都有明顯下降，即其克隆形成能力被顯著削弱。而沒有內(nèi)源性表達(dá)的Bel-7402細(xì)胞在同 樣的實(shí)驗(yàn)中其形克隆形成的數(shù)目卻沒有明顯改變。實(shí)施例!Western Blotting分析(證明Huh-7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制后其生長 增殖能力降低)以 Huh-7 細(xì)胞為對(duì)象，將 pSUPER 空載質(zhì)粒和 pSUPER DLK874、pSUPERDLK1011 質(zhì)粒 與pcDNA3. 0質(zhì)粒以10比1的比例分別共轉(zhuǎn)染入Huh-7細(xì)胞，構(gòu)建DLKl表達(dá)抑制的Huh-7 穩(wěn)定細(xì)胞株，并用Western BlottingAnalysis對(duì)于其中的4株穩(wěn)定細(xì)胞株在蛋白水平上對(duì) DLKl的表達(dá)進(jìn)行鑒定(見圖4)。圖4中，pSUPER C5為pSUPER空載質(zhì)粒穩(wěn)定細(xì)胞株；pl011B3和pl011A4為穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染pSUPER DLK1011后形成的亞克??；p874C2為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER DLK874后形成的亞克隆。 得到兩株DLKl穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞株Huh-7p874C2和Huh-7pl011A4，而穩(wěn)定株Huh-7pl()l 1B3 中DLKl的表達(dá)并沒有下調(diào)。在建立了 DLKl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，研究了這兩株穩(wěn)定株的生長屬性是否 受DLKl下調(diào)的影響而改變，為此，比較這些細(xì)胞及對(duì)照的生長曲線。如圖5所示，當(dāng)DLKl 的表達(dá)被下調(diào)后，其穩(wěn)定株的生長增殖能力明顯減弱。與之比較的空載穩(wěn)定細(xì)胞株pSUPER C5和內(nèi)源性DLKl表達(dá)沒有被下調(diào)的對(duì)照穩(wěn)定細(xì)胞株P(guān)1011B3,它們兩者的生長狀態(tài)良好。 雖然它們之間也略有差異，即PSUPER C5要比pl011B3生長增殖能力稍微更強(qiáng)一些，但是這 兩者總的要比P874C2和pl011A4的生長增殖能力都要顯著得多。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)重復(fù)三次后，得 到相似的結(jié)果。實(shí)施例4無胸腺的BLAB/cA裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(證明Huh-7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制 后其在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力降低)本實(shí)施例共取32只裸鼠，分成四組，每組八只，分別于皮下注射相同量(2X IO6) 的Huh 7pSUPER C5、pl011B3、p874C2和pl011A4細(xì)胞。注射后四周觀察裸鼠的生存狀態(tài)及 所成腫瘤的形態(tài)指標(biāo)(見圖6)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，DLKl被穩(wěn)定下調(diào)的Huh-7p874C2細(xì)胞在裸鼠皮下所成的腫瘤要比 對(duì)照組Huh-7pSUPER C5和pl011B3細(xì)胞在裸鼠下所成的腫瘤在體積上顯著減小，而且Huh-7pl011A4在觀察注射腫瘤細(xì)胞后六周仍然未見肉眼可見腫瘤形成,解剖證實(shí)該注射Huh-TplOl 1A4細(xì)胞的8只裸鼠確實(shí)沒有腫瘤形成。注射Huh_7pSUPER C5、pl011B3、p874C2 細(xì)胞后的所有裸鼠在四周后都形成了腫瘤，而且注射了 Huh-7pSUPER C5和ρ 1011Β3細(xì)胞所 形成的腫瘤經(jīng)解剖分離后顯示其所成腫瘤實(shí)體的體積比H:Uh 7p874C2的更大(見圖6)，并 且該兩組腫瘤實(shí)體本身沒有顯著性差異。但注射了 Huh-7pSUPER C5和pl011B3細(xì)胞的裸 鼠與注射了 Huh-7p874C2和pl011A4細(xì)胞的裸數(shù)的體重凈重、進(jìn)食能力和精神狀態(tài)在4周 后沒有顯著差異，所有裸鼠在實(shí)驗(yàn)中止即解剖前全部存活。本實(shí)施例結(jié)果顯示對(duì)于內(nèi)源性表達(dá)DLKl的肝癌細(xì)胞株在模型動(dòng)物皮下進(jìn)行的成 瘤實(shí)驗(yàn)中，DLKl對(duì)于腫瘤細(xì)胞的成瘤能力起了重要的增強(qiáng)作用。由于DLKl被穩(wěn)定下調(diào)的 細(xì)胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了 Huh-7pl011A4細(xì)胞的8只裸鼠都沒有長出肉眼 可見的腫瘤，因此本實(shí)施例證明了 Iiuh 7細(xì)胞的DLKl表達(dá)被抑制后其在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力 降低。實(shí)施例5DLK1促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的生長以上實(shí)施例均采用了 RNAi的手段使DLKl的表達(dá)受到抑制，觀察到DLKl的表達(dá)抑 制后,肝癌細(xì)胞生長增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有顯著的降低,這提示DLKl對(duì)于肝 癌細(xì)胞的生長增殖及成瘤性起著某種維持或限制的作用。本實(shí)施例用以驗(yàn)證DLKl是否可 以直接起到癌基因的作用來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞中，瞬間轉(zhuǎn)入之前所構(gòu)建的過表達(dá)DLKl 全長蛋白的PCDNA3. 0-DLKl質(zhì)粒，并以pcDNA3. 0空載質(zhì)粒為對(duì)照，觀察細(xì)胞的生長增殖 曲線(見圖7)。Western Blotting Analysis中的樣品為生長曲線所用同一批轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞,各樣品上樣量均為20 μ g,以鑒定轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒后DLKl在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)的效率(見圖8)。在本實(shí)施例中，在SMMC-7721細(xì)胞中進(jìn)行了該兩個(gè)質(zhì)粒的瞬間轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen),在轉(zhuǎn)染4-5小時(shí)后將含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液撤去，更 換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液，以盡量減少轉(zhuǎn)染試劑的毒性對(duì)于細(xì)胞的損傷。繼續(xù)培養(yǎng)至次 曰，計(jì)數(shù)后分入96孔板內(nèi)生長，每孔均勻分入1000個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過8天的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 DLKl的SMMC-7721細(xì)胞比轉(zhuǎn)染了空載質(zhì)粒的細(xì)胞生長顯著增快。本實(shí)施例結(jié)果表明DLKl能顯著增強(qiáng)無內(nèi)源性DLKl表達(dá)的HCC細(xì)胞株SMMC-7721 的生長增殖能力。
權(quán)利要求
一種以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點(diǎn)的核糖核酸，其特征在于它的寡核苷酸序列如下siRNASGAGCUACGAGUGUCUGUGCAAGCdTdT(SEQ ID NO10)；ASGCUUGCACAGACACUCGUAGCUCdTdT(SEQ ID NO11)。
2.--種如權(quán)利要求1所述的以肝癌相關(guān)基因DLKl為靶點(diǎn)的核糖核酸在制備治療原發(fā) 性肝癌的RNA千擾藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點(diǎn)的核糖核酸，它的寡核苷酸序列如下siRNASGAGCUACGAGUGUCUGUGCAAGCdTdT(SEQ IDNO10)；ASGCUUGCACAGACACUCGUAGCUCdTdT(SEQ ID NO11)。此外，本發(fā)明還公開了上述以肝癌相關(guān)基因DLK1為靶點(diǎn)的核糖核酸在制備治療原發(fā)性肝癌的RNA干擾藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101812454SQ20101017008
公開日2010年8月25日 申請日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者韓澤廣, 黃健 申請人:上海人類基因組研究中心