專利名稱：一種重組雞IFN-γ基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體說就是一種重組雞IFN-Y基因的克隆表達(dá)及活性 檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近50年來，由于全球畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致一些抗藥性型細(xì)菌的 產(chǎn)生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來極大的威脅。現(xiàn)在一些國(guó)家已明令禁止一些 抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此，生產(chǎn)者們迫切需要一種既有效又有利于環(huán)保的 新方法來控制畜禽疾病.細(xì)胞因子可決定機(jī)體在感染疾病或疫苗免疫之后所發(fā)生的免疫 應(yīng)答的類型及程度，是機(jī)體內(nèi)天然的免疫反應(yīng)調(diào)控因子。因此，細(xì)胞因子可望成為一種極具 前途的、可以替代傳統(tǒng)抗生素的新型治療方法。近幾年來伴隨大量的細(xì)胞因子基因被成功 克隆，細(xì)胞因子療法在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用變得更加可行。由于雞的免疫系統(tǒng)及其對(duì)微生 物感染和疫苗免疫的反應(yīng)性類似于哺乳動(dòng)物，因此雞可以作為細(xì)胞因子控制集約化飼養(yǎng)條 件下的家畜疾病的研究及臨床應(yīng)用提供一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。作為動(dòng)物模型，雞有易 于飼養(yǎng)、價(jià)格低廉、繁殖速度快、便于大批量處理等優(yōu)點(diǎn)。由此可見，雞細(xì)胞因子的研究不僅 在科研而且在實(shí)際應(yīng)用中都具有深遠(yuǎn)的意義。干擾素首先它是一類多功能細(xì)胞因子。干擾素(Interference，IFN)是由培養(yǎng)的 細(xì)胞或動(dòng)物體受到適宜的刺激時(shí)所產(chǎn)生的一種微量的、具有高度生物學(xué)活性的一類非特異 性抗病毒物質(zhì)。英國(guó)科學(xué)家Aliek Isaacs和lean Lindenmann(1957年)利用雞胚絨毛 尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)，從中獲得了一種高活性多功能的糖蛋白，該蛋白能夠抑 制流感病毒在絨毛尿囊膜細(xì)胞中的繁殖，他們稱其為干擾素(Interferon，IFN)。Lampson 等(1963年)純化了干擾素，證明其是分子量為20 34KD的蛋白質(zhì)。近年來，干擾素一直 是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其是 IFN-Y，因?yàn)樗谡T導(dǎo)并激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生殺傷力機(jī)制中是一種最重要的細(xì)胞因子。1973 年，Youngert和Salvin發(fā)現(xiàn)來自淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在一種IFN，但抗原性不同于以往 發(fā)現(xiàn)的IFN，遂命名為II型IFN。1980年國(guó)際干擾素命名委員會(huì)建議將各種干擾素先根據(jù) 動(dòng)物的來源確定分類，再根據(jù)干擾素的抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)分成不同的型別。哺乳動(dòng)物 的干擾素分為兩類1型干擾素和II型干擾素。I型干擾素又主要包括IFN-a、IFN-3、 IFN-co和IFN-t，它們具有相關(guān)的結(jié)構(gòu)并享用同一類受體，前3種主要是對(duì)病毒感染的應(yīng) 答產(chǎn)生的，能誘導(dǎo)機(jī)體抗病毒蛋白的產(chǎn)生。II型干擾素又稱免疫干擾素，即IFN-Y，是由活 化的T淋巴細(xì)胞在誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生的，與I型干擾素不享用同一類受體，對(duì)免疫系統(tǒng)有 調(diào)節(jié)作用，是哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞活化因子。此時(shí)II型IFN就統(tǒng)一命名為IFN-y。在醫(yī)學(xué) 界IFN-y作為一種免疫佐劑已取得了較好的成就，但到目前為止，人類對(duì)IFN-Y并不完全 明了，尤其是在我們畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用更少之又少，對(duì)IFN-y進(jìn)行進(jìn)一步的研究，對(duì)于指 導(dǎo)畜牧生產(chǎn)具有重要的作用。在家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，預(yù)防禽類傳染性疾病主要采用疫苗免疫，但疫苗往往比較單
3一，而病毒卻復(fù)雜多樣且變異快，常導(dǎo)致疫苗未能達(dá)到很好的免疫效果，嚴(yán)重的還能導(dǎo)致人 畜共患。在疾病的治療方面常常又會(huì)因?yàn)榇罅渴褂盟幬镆鹨幌盗械乃幬餁埩艉涂顾幮缘?問題。因此研究一種新型的廣譜抗感染類生物制劑就迫在眉睫。干擾素因其作用機(jī)理的獨(dú) 特性而具有廣譜的抗病毒活性和免疫增強(qiáng)作用。研究表明，重組干擾素與天然干擾素具有 同樣的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性，因此重組干擾素的研究和應(yīng)用將成為家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中增強(qiáng) 雞的免疫，減少雞的疾病，降低雞的死亡率的重要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組雞IFN- Y基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的所述的重組雞IFN-Y基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè) 方法，步驟如下步驟一以帶有信號(hào)肽的重組質(zhì)粒PMD-18T-preIFN-Y為模板，擴(kuò)增無信號(hào)肽 ChlFN- y基因片段，接著將PCR產(chǎn)物純化回收后連接入克隆載體pMDIS-T，構(gòu)建克隆載體 pMD18-T-ChIFN-Y，測(cè)序表明與Genebank提供的雞IFN-Y基因序列同源性達(dá)100% ；步驟二 測(cè)序后的產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pProEXTMHTa上，將表達(dá)載體 pProEX HTa-ChIFN-Y 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主 E. coli DH5 a 中，0.1mmol/L IPTG、30 °C 誘導(dǎo) 4h， 產(chǎn)生了與預(yù)期分子量為20. OkD的特異誘導(dǎo)表達(dá)條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析，證明融合蛋白 ChlFN- y成功獲得表達(dá)；步驟三對(duì)最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，在確定的最佳誘導(dǎo)條件下，既當(dāng)菌體密度達(dá)到 0D600 = 0.6時(shí)開始誘導(dǎo)，0. 5mmol/L IPTG、30°C誘導(dǎo)4h，融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白總
量的40%左右；步驟四將菌液超聲裂解于4°C，12000Xg離心30min，分別取上清和沉淀進(jìn)行 15%的SDS-PAGE可溶性分析，結(jié)果表明表達(dá)蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而 一部分在裂解沉淀中以包涵體的形式存在；利用Novagen公司純化試劑盒對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示了良好的純化效果，pProEX HTa-IFN- y得到了單一的目 的條帶；將獲得的洗脫液按照蛋白純化儀中的脫鹽程序進(jìn)行脫鹽，收集蛋白液，結(jié)果顯示目 的蛋白和洗脫液里的鹽成分分離成功；步驟五利用雞成纖維細(xì)胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系統(tǒng)測(cè)定 天然純化的rchlFN- y蛋白的抗病毒效價(jià)為1. 61 X 104U/mL ；步驟六將純化的融合蛋白用PBS緩沖液稀釋至100ii g/mL，在第14、21和28天 對(duì)肉仔雞進(jìn)行注射免疫(100 y g/只)，在28天免疫后對(duì)肉仔雞進(jìn)行48小時(shí)急性熱應(yīng)激，分 別在6、12、24和48小時(shí)取心臟、肝、肺、胸腺、脾和法式囊六個(gè)組織測(cè)定各組織中HSP70的 表達(dá)含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，ChlFN- y對(duì)對(duì)HSP70具有抑制作用。本發(fā)明一種重組雞IFN-Y基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法，采用原核表達(dá)系統(tǒng)， 成功表達(dá)了 ChlFN-Y融合蛋白，分子量約為20kD，與GenBank上發(fā)布的其他的ChIFN-Y基 因核苷酸序列進(jìn)行比較，其同源率為100%;能與抗His的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。利 用雞成纖維細(xì)胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系統(tǒng)測(cè)定天然純化的rchlFN-Y 抗病毒活性效價(jià)為1.61X104U/mL，這為研制新型抗病毒干擾素制劑奠定了良好的基礎(chǔ)。用 純化重組ChlFN-Y融合蛋白對(duì)肉仔雞進(jìn)行免疫，結(jié)果顯示ChlFN-Y融合蛋白熱應(yīng)激條件下可以影響不同器官HSP-70的表達(dá)量，表明重組ChIFN-Y融合蛋白推遲了 HSP-70的產(chǎn) 生，緩解了熱應(yīng)激帶來的負(fù)面影響。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 本發(fā)明一種重組雞IFN-Y基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法，步驟如 下步驟一以帶有信號(hào)肽的重組質(zhì)粒PMD-18T-preIFN-Y為模板，擴(kuò)增無信號(hào)肽 ChlFN- y基因片段，接著將PCR產(chǎn)物純化回收后連接入克隆載體pMDIS-T，構(gòu)建克隆載體 pMD18-T-ChIFN-Y，測(cè)序表明與Genebank提供的雞IFN-Y基因序列同源性達(dá)100% ；步驟二 測(cè)序后的產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pProEXTMHTa上，將表達(dá)載體 pProEX HTa-ChIFN-Y 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主 E. coli DH5 a 中，0.1mmol/L IPTG、30 °C 誘導(dǎo) 4h， 產(chǎn)生了與預(yù)期分子量為20. OkD的特異誘導(dǎo)表達(dá)條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析，證明融合蛋白 ChlFN- y成功獲得表達(dá)；步驟三對(duì)最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，在確定的最佳誘導(dǎo)條件下，既當(dāng)菌體密度達(dá)到 0D600 = 0.6時(shí)開始誘導(dǎo)，0. 5mmol/L IPTG、30°C誘導(dǎo)4h，融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白總
量的40%左右；步驟四將菌液超聲裂解于4°C，12000Xg離心30min，分別取上清和沉淀進(jìn)行 15%的SDS-PAGE可溶性分析，結(jié)果表明表達(dá)蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而 一部分在裂解沉淀中以包涵體的形式存在；利用Novagen公司純化試劑盒對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示了良好的純化效果，pProEX HTa-IFN- y得到了單一的目 的條帶；將獲得的洗脫液按照蛋白純化儀中的脫鹽程序進(jìn)行脫鹽，收集蛋白液，結(jié)果顯示目 的蛋白和洗脫液里的鹽成分分離成功；步驟五利用雞成纖維細(xì)胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系統(tǒng)測(cè)定 天然純化的rchlFN- y蛋白的抗病毒效價(jià)為1. 61 X 104U/mL ；步驟六將純化的融合蛋白用PBS緩沖液稀釋至100ii g/mL，在第14、21和28天 對(duì)肉仔雞進(jìn)行注射免疫(100 y g/只)，在28天免疫后對(duì)肉仔雞進(jìn)行48小時(shí)急性熱應(yīng)激，分 別在6、12、24和48小時(shí)取心臟、肝、肺、胸腺、脾和法式囊六個(gè)組織測(cè)定各組織中HSP70的 表達(dá)含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，ChlFN- y對(duì)對(duì)HSP70具有抑制作用。實(shí)施例2 本發(fā)明對(duì)編碼ChlFN-Y成熟蛋白基因進(jìn)行克隆、表達(dá)并檢測(cè)其相關(guān)生 物活性，為ChlFN-Y在家禽養(yǎng)殖業(yè)疾病防治及綠色飼料的開發(fā)中提供理論依據(jù)。本發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)區(qū)別在于，本發(fā)明是將干擾素成熟蛋白基因(去掉信號(hào)肽)構(gòu)建到表達(dá)載體 (pProEX HTa)上而獲得的一種可溶性蛋白，避免復(fù)性而保留了蛋白的天然性。在蛋白活性 檢測(cè)的時(shí)候采用的是弱毒的新城疫NDV(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所保存)，操作更簡(jiǎn)單，只 須在普通細(xì)胞間即可操作，無須在更嚴(yán)格的細(xì)胞間(P3)操作。在檢測(cè)重組干擾素抗 熱應(yīng)激活性時(shí)，注射的劑量和注射的方式上也有獨(dú)到之處。本發(fā)明根據(jù)Genebank提供的雞 IFN-y基因序列成功擴(kuò)增了雞IFN-y成熟蛋白基因，克隆至原核表達(dá)載體pProEXTMHTa， 在大腸桿菌BL21中獲得了高效表達(dá)并獲得了可溶性蛋白，將純化后的原核表達(dá)蛋白對(duì)肉 仔雞進(jìn)行注射免疫，研究其部分活性。
權(quán)利要求
一種重組雞IFN-γ基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法，步驟如下步驟一以帶有信號(hào)肽的重組質(zhì)粒PMD-18T-preIFN-γ為模板，擴(kuò)增無信號(hào)肽ChIFN-γ基因片段，接著將PCR產(chǎn)物純化回收后連接入克隆載體pMD18-T，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-ChIFN-γ，測(cè)序表明與Genebank提供的雞IFN-γ基因序列同源性達(dá)100％；步驟二測(cè)序后的產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pProEXTMHTa上，將表達(dá)載體pProEXTMHTa-ChIFN-γ轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli DH5α中，0.1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)4h，產(chǎn)生了與預(yù)期分子量為20.0kD的特異誘導(dǎo)表達(dá)條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析，證明融合蛋白ChIFN-γ成功獲得表達(dá)；步驟三對(duì)最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，在確定的最佳誘導(dǎo)條件下，既當(dāng)菌體密度達(dá)到OD600＝0.6時(shí)開始誘導(dǎo)，0.5mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)4h，融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白總量的40％左右；步驟四將菌液超聲裂解于4℃，12000×g離心30min，分別取上清和沉淀進(jìn)行15％的SDS-PAGE可溶性分析，結(jié)果表明表達(dá)蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而一部分在裂解沉淀中以包涵體的形式存在；利用Novagen公司純化試劑盒對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示了良好的純化效果，pProEXTMHTa-IFN-γ得到了單一的目的條帶；將獲得的洗脫液按照蛋白純化儀中的脫鹽程序進(jìn)行脫鹽，收集蛋白液，結(jié)果顯示目的蛋白和洗脫液里的鹽成分分離成功；步驟五利用雞成纖維細(xì)胞-新城疫(新城疫IV系弱毒苗)(CEF-NDV)系統(tǒng)測(cè)定天然純化的rchIFN-γ蛋白的抗病毒效價(jià)為1.61×104U/mL；步驟六將純化的融合蛋白用PBS緩沖液稀釋至100μg/mL，在第14、21和28天對(duì)肉仔雞進(jìn)行注射免疫(100μg/只)，在28天免疫后對(duì)肉仔雞進(jìn)行48小時(shí)急性熱應(yīng)激，分別在6、12、24和48小時(shí)取心臟、肝、肺、胸腺、脾和法式囊六個(gè)組織測(cè)定各組織中HSP70的表達(dá)含量，試驗(yàn)結(jié)果表明，ChIFN-γ對(duì)對(duì)HSP70具有抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組雞IFN-γ基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)方法。步驟如下以帶有信號(hào)肽的重組質(zhì)粒PMD-18T-preIFN-γ為模板，擴(kuò)增無信號(hào)肽ChIFN-γ基因片段；測(cè)序后的產(chǎn)物亞克隆到表達(dá)載體pProEXTMHTa上，將表達(dá)載體pProEXTMHTa-ChIFN-γ轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli DH5α中；對(duì)最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化；本發(fā)明為研制新型抗病毒干擾素制劑奠定基礎(chǔ)。用純化重組ChIFN-γ融合蛋白對(duì)肉仔雞進(jìn)行免疫，結(jié)果顯示ChIFN-γ融合蛋白熱應(yīng)激條件下可以影響不同器官HSP-70的表達(dá)量，表明重組ChIFN-γ融合蛋白推遲了HSP-70的產(chǎn)生，緩解了熱應(yīng)激帶來的負(fù)面影響。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101851628SQ20101015738
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者代麗, 單安山, 鄭燕斌 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)