專利名稱：：一種禽用油乳劑疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
具體涉及禽用油乳劑疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：我國(guó)禽肉產(chǎn)品屢遭封關(guān)，1996年8月1日至2001年5月24日，歐盟以我國(guó)出口的禽肉中含有動(dòng)物疫病和農(nóng)藥、獸藥殘留等為由對(duì)我國(guó)封關(guān)5年。2004年歐盟又以禽流感為由全面禁止進(jìn)口我國(guó)禽肉產(chǎn)品，直到2008年8月才宣布解除我國(guó)禽肉產(chǎn)品禁令。剛解除禁令又遇“配額”難題。解決所有問(wèn)題的先決條件就是要提高我國(guó)禽產(chǎn)品質(zhì)量。為減少禽病害發(fā)生，同時(shí)為避免長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素、激素類產(chǎn)品所造成的菌群失調(diào)，耐藥菌株增加及藥物殘留等負(fù)面影響，以發(fā)展優(yōu)質(zhì)，無(wú)公害的禽產(chǎn)品，保證我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展并參與國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，具有良好免疫效果的疫苗將起極其重要的作用。目前，預(yù)防和控制家禽傳染病除生物安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特別是通過(guò)油乳劑疫苗的免疫。油性佐劑疫苗是已公認(rèn)的可有效強(qiáng)化免疫性的疫苗。油乳劑疫苗的生物安全性高，具有用最小量的抗原，最少的接種次數(shù)，延長(zhǎng)免疫刺激時(shí)間，使機(jī)體產(chǎn)生足夠量的抗體的特點(diǎn)，所以乳化品質(zhì)優(yōu)良的油乳劑苗是保證免疫效果的前提。在現(xiàn)有的油乳劑疫苗(簡(jiǎn)稱“油苗”)生產(chǎn)過(guò)程中，通常添加2%的硬脂酸鋁來(lái)增加其穩(wěn)定性，但其粘度較大引起免疫注射的應(yīng)激反應(yīng)較大，如導(dǎo)致嚴(yán)重接種反應(yīng)、形成無(wú)菌性化膿損害和接種部位周?chē)纬扇庋磕[等，可產(chǎn)生外部可見(jiàn)的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死。而且人們懷疑在接種部位有殘留的可能，這便妨礙了疫苗的使用，這種現(xiàn)象在種雞免疫中表現(xiàn)得尤為明顯?；谶@個(gè)原因，使用含有礦物油的油性佐劑的疫苗有時(shí)是受到一定限制的。對(duì)于油性佐劑疫苗而言，已知這種疫苗不僅在免疫強(qiáng)化作用方面，而且在藥物制劑的穩(wěn)定性方面，都在相當(dāng)大的程度上受到乳劑類型、所用油性成分以及所結(jié)合的表面活性劑種類等因素的影響。尤其就滅活疫苗來(lái)說(shuō)制備出一種具有在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生充分免疫保護(hù)作用，并有著良好再現(xiàn)性的疫苗，是非常困難的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種禽用油乳劑疫苗，該疫苗不含硬脂酸鋁，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的抗體產(chǎn)生能力，并解決注射疫苗引起的動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)以及疫苗殘留問(wèn)題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供一種該疫苗的制備方法。本發(fā)明提供的油乳劑疫苗是油包水油性佐劑疫苗，水相的體積分?jǐn)?shù)為33.3%，油相的體積分?jǐn)?shù)為66.7%，其中水相含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原和親水性非離子型表面活性劑；油相含有礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑。所述生物學(xué)上可接受的抗原，如禽用禽流感抗原、新城疫抗原、支氣管炎抗原、減蛋綜合癥抗原、法氏囊抗原及其混合物等。所述親水性非離子型表面活性劑常溫下呈液態(tài)為好，優(yōu)選吐溫-80。所述親油性非離子型表面活性劑常溫下呈液態(tài)為好，優(yōu)選司盤(pán)-80。所述油相中所含的卵磷脂最好為脫油型的。適于本發(fā)明的礦物油如常規(guī)的白油佐劑等。本發(fā)明提供的油乳劑疫苗可以是以下質(zhì)量組成水相生物學(xué)上可接受的有效量的抗原20%水性非離子型表面活性劑水70%-79%油相卵磷脂丙二醇異甘露醇單油酸脂親油性非離子型表面活性劑2%-15%礦物油70%-95%本發(fā)明的疫苗可以采用下列技術(shù)步驟制備1.水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水做3倍稀釋，然后121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫，再加入一定量的抗原使親水性非離子型表面活性劑最終濃度為1%_10%，抗原最終濃度為20%，混合均勻備用。2.油相的制備將一定量的礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟倥c親油性非離子型表面活性劑混勻?yàn)橛拖?，?jīng)121°C滅菌30min，冷卻至室溫，使親油性非離子型表面活性劑最終濃度為2%-15%、丙二醇最終濃度-5%、卵磷脂最終濃度_5%、異甘露醇單油酸脂最終濃度-5%。3.乳化按油相水相=21的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為9000-13000rpm，溫度10_20°C的情況下，將水相以0.6mL/s的速度加入油相中，再繼續(xù)以速度13500-17500rpm乳化3_7min。上述技術(shù)方案步驟2中，異甘露醇單油酸脂可通過(guò)以下方式制備油酸甲酯、異甘露醇與甲醇鈉在25-50mmHg真空度下加熱至100°Clh，冷至室溫，加入己烷，過(guò)濾除去異甘露醇，在218°C-220°C/0.175mmHg下蒸餾得到異甘露醇單油酸脂。本發(fā)明方法得到的禽用油乳劑疫苗，不含硬脂酸鋁，降低了疫苗粘度更利于吸收，從而減少留存，在接種部位表現(xiàn)出優(yōu)異的局部安全性，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力。通過(guò)調(diào)整油相和水相的配方及其比例，減少了免疫注射引起的應(yīng)激反應(yīng)，且不影響疫苗的穩(wěn)定性及免疫效果，從而也就提高了疫苗質(zhì)量。這種疫苗即使在低粘度區(qū)域穩(wěn)定性也較高，副反應(yīng)較小，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力以及保持高水平的抗體產(chǎn)生的能力都很強(qiáng)。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單易行。具體實(shí)施例方式為了舉例說(shuō)明，以非限制性的方式提供下面的實(shí)施例。實(shí)施例11.將4份吐溫-80以3倍水稀釋，然后在121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫；取HA效價(jià)為81og2的新城疫抗原60份與12份3倍水稀釋、121°C滅菌30min吐溫-80，加28份的水混合均勻?yàn)樗唷?.先將88份的白油、2份的丙二醇、2份的卵磷脂和2份的異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟?，再與6份的司盤(pán)-80混勻?yàn)橛拖嘟?jīng)121°C滅菌30min，冷卻至室溫備用。3.按油相水相=21的體積比例，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為1IOOOrpm,溫度10-20V的情況下，水相加入油相的速度為0.6mL/s,再繼續(xù)以速度15500rpm乳化5min，制備的疫苗分為三份，批號(hào)分別為0901、0902和0903。對(duì)比例11.取HA效價(jià)為81og2的同實(shí)施例1的新城疫抗原60份與12份3倍水稀釋在121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫的吐溫_80，加28份水混合均勻?yàn)樗唷?.將94份的白油、6份的司盤(pán)-80和2份(0.02g/mL)的硬脂酸鋁混合均勻?yàn)橛拖?，?jīng)121°C滅菌30min，冷卻至室溫備用。3.按油相水相=21的體積比例，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為1IOOOrpm,溫度10-20V的情況下，水相加入油相的速度為0.6mL/s,再繼續(xù)以速度15500rpm乳化5min，制備的疫苗分為三份，批號(hào)分別為0904、0905和0906。比較實(shí)施例1和對(duì)比例1制備疫苗的性狀1.外觀兩者均為乳白色均勻乳劑。2.劑型兩者均呈油包水型。在潔凈的水面上，滴一滴油乳劑，觀察其形態(tài)、是否分散、分散開(kāi)的時(shí)間。結(jié)果顯示兩者形狀均為規(guī)則圓形、不擴(kuò)散。3.粘度用ImL吸管(上口內(nèi)徑2.7mm，下口內(nèi)徑1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗ImL，令其垂直自然流出，記錄流出0.4mL所需要的時(shí)間。結(jié)果顯示兩者3次流出時(shí)間均在5s內(nèi)，符合規(guī)程要求，以無(wú)硬脂酸鋁疫苗黏度更低，均在3s內(nèi)。4.穩(wěn)定性(1)取IOmL疫苗置于離心管中以3000r/min離心15min，管底析出的水相^0.5mL。(2)取疫苗在37°C左右放置21d，結(jié)果顯示不分層，沒(méi)有破乳現(xiàn)象。5.純凈性檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁(yè)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，完全符合，安全無(wú)副作用，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。6.安全性檢驗(yàn)用14日齡SPF(無(wú)特定病原體)雞，每種疫苗免疫10只雞，每只腿部肌肉注射疫苗lmL，空白對(duì)照10只。每天觀察免疫雞只，接種后14天剖檢雞只，觀察局部及全身反應(yīng)，觀察局部疫苗吸收情況。兩種疫苗檢測(cè)性狀對(duì)比見(jiàn)表1。表1兩種疫苗檢測(cè)性狀對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>7.效力檢驗(yàn)血清學(xué)方法用30-60日齡SPF(無(wú)特定病原體)雞，每種疫苗免疫10只雞，每只皮下或肌肉注射疫苗20μL，空白對(duì)照10只。接種后21-28日，每只雞靜脈采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。表2兩種疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從效力檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可以看出，無(wú)硬脂酸鋁油苗與常規(guī)方法制備的疫苗效力無(wú)明顯區(qū)另|J，在免疫后21天都能使抗體效價(jià)達(dá)到要求。結(jié)論上述結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的油性佐劑疫苗即使不含硬脂酸鋁，它所顯示的免疫作用也與含硬脂酸鋁疫苗的作用基本相同，且與含硬脂酸鋁的油苗相比，本發(fā)明的疫苗有更好的局部反應(yīng)能力。此外，這些結(jié)果也表明，按照本發(fā)明的方法制備的油性疫苗同樣具有高穩(wěn)定性，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)顯示出極好的功效，同時(shí)粘度更低，易于注射，注射引起的應(yīng)激反應(yīng)更小，對(duì)動(dòng)物體更安全。不僅黏度降低免疫效果良好，而且不會(huì)產(chǎn)生常規(guī)油佐劑疫苗所引起的較大應(yīng)激反應(yīng)，常見(jiàn)的免疫注射部位浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死等問(wèn)題都得以解決。另一方面，由于疫苗黏度降低，在接種家禽后，更容易吸收，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留的情況，符合生物安全的要求，有利于禽類產(chǎn)品的出口，提高產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。對(duì)保證我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，對(duì)發(fā)展綠色食品的生產(chǎn)和保證人民的身體健康具有重要意義。上列詳細(xì)說(shuō)明系針對(duì)本發(fā)明之一可行實(shí)施例之具體說(shuō)明，惟該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案之專利范圍中。權(quán)利要求一種禽用油乳劑疫苗，是油包水油性佐劑疫苗，水相的體積分?jǐn)?shù)為33.3％，油相的體積分?jǐn)?shù)為66.7％，其中水相含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原和親水性非離子型表面活性劑；油相含有礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑。2.按照權(quán)利要求1所述的禽用油乳劑疫苗，其特征是所述生物學(xué)上可接受的抗原是指禽用禽流感抗原、新城疫抗原、支氣管炎抗原、減蛋綜合癥抗原、法氏囊抗原及其混合物；所述親水性非離子型表面活性劑是指吐溫-80；所述親油性非離子型表面活性劑是指司盤(pán)-80；所述卵磷脂最好是脫油型；所述礦物油是指常規(guī)白油佐劑。3.按照權(quán)利要求2所述的禽用油乳劑疫苗，其特征是含有以下質(zhì)量組成水相生物學(xué)上可接受的有效量的抗原20%水性非離子型表面活性劑水70%-79%油相卵磷脂丙二醇異甘露醇單油酸脂親油性非離子型表面活性劑2%-15%礦物油70%-95%4.按照權(quán)利要求3所述的禽用油乳劑疫苗，其特征是異甘露醇單油酸脂通過(guò)以下方式制備油酸甲酯、異甘露醇與甲醇鈉在25-50mmHg真空度下加熱至100°Clh，冷至室溫，加入己烷，過(guò)濾除去異甘露醇，在218°C-220V/0.175mmHg下蒸餾得到異甘露醇單油酸脂。5.一種權(quán)利要求14之一所述的禽用油乳劑疫苗的制備方法，包括下列步驟(1)水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水做3倍稀釋，然后121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫，再加入一定量的抗原使親水性非離子型表面活性劑最終濃度為1%_10%，抗原最終濃度為20%，混合均勻備用。(2)油相的制備將一定量的礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻?yàn)樽魟?，再與親油性非離子型表面活性劑混勻?yàn)橛拖啵?jīng)121°C滅菌30min，冷卻至室溫，使親油性非離子型表面活性劑最終濃度為2%-15%、丙二醇最終濃度-5%、卵磷脂最終濃度_5%、異甘露醇單油酸脂最終濃度-5%。(3)乳化按油相水相=21的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉(zhuǎn)速為9000-13000rpm，溫度10_20°C的情況下，將水相以0.6mL/s的速度加入油相中，再繼續(xù)以速度13500-17500rpm乳化3_7min。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種禽用油乳劑疫苗及其制備方法，是油包水油性佐劑疫苗，水相的體積分?jǐn)?shù)為33.3％，油相的體積分?jǐn)?shù)為66.7％，其中水相含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原和親水性非離子型表面活性劑；油相含有礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑。該疫苗不含硬脂酸鋁，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的抗體產(chǎn)生能力，并解決注射疫苗引起的動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)以及疫苗殘留問(wèn)題。文檔編號(hào)A61K39/39GK101829323SQ20101015726公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年4月28日優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日發(fā)明者喬榮岑,習(xí)向鋒,孫進(jìn)忠,張海洋,張?jiān)S科,李三,陶家權(quán)申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司