專利名稱：山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
目前流行性感冒病毒日益嚴(yán)重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相關(guān)，我國(guó)是流感高發(fā)國(guó)家之一，不但人口眾多，而且生活習(xí)慣也有利于流感病 毒的轉(zhuǎn)播，每年人平均發(fā)病次數(shù)達(dá)到0. 3 0. 7次不等，重點(diǎn)人群達(dá)到2 4次。流感對(duì)人 類存在嚴(yán)重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會(huì)直 接導(dǎo)致器官破壞和變態(tài)反應(yīng)致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治療手段，如針對(duì)臨床癥狀進(jìn)行炎癥反應(yīng)治療，治標(biāo)不治本。目前最常見 的預(yù)防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西 藥磷酸奧司他韋(達(dá)菲)_神經(jīng)氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預(yù)防接種弊端在于接種 人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護(hù)率不高，保護(hù)時(shí)間也較短(3 6個(gè)月)。目前大多數(shù)非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對(duì)流感病 毒，且抗病毒作用機(jī)理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風(fēng)寒，西醫(yī)所認(rèn)為的感冒 的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡(jiǎn)單的說(shuō)，不是所有的治療感冒的中藥組方都 有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達(dá)菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基-3(1-丙氧乙酯)-1_環(huán)己烯-1羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對(duì)流感病毒進(jìn) 入細(xì)胞有特異性抑制作用，但是不僅價(jià)格昂貴，而且有一些患者服用后出現(xiàn)嘔吐、惡心、失 眠、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應(yīng)。達(dá)菲是在體內(nèi)被位于肝臟和 腸道的酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物而起著抑制神經(jīng)氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功 能不正常也將影響其藥效，腎功能不全患者也要慎用。因此，針對(duì)性抑制流感病毒復(fù)制、抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表面唾液酸， 從而導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的 產(chǎn)生將是治療流感病毒性感冒的病因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種山香圓葉乙醇滲漉提取物，抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水 解細(xì)胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而能有效的 抑制流感病毒復(fù)制，更重要地是克服藥物的副反應(yīng)弊端。本發(fā)明的另一目的是提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物制備預(yù)防和治療流感及其 并發(fā)癥疾病的藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供了含有山香圓葉乙醇滲漉提取物的藥物組合物。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，通過(guò)將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取 方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸漬12 72小時(shí)后，以1
38ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏 或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸 漬24 72小時(shí)后，以1 7ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 13倍量的滲漉液， 回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑， 浸漬24 48小時(shí)后，以1 6m/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 11倍量的滲漉液， 回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑， 浸漬48小時(shí)后，以1 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 10倍量的滲漉液，回 收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸 漬36小時(shí)后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙 醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸漬 36小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓 濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸 漬12小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙 醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸漬72 小時(shí)后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃 縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。本發(fā)明還提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥 疾病的藥物的用途。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒FM1。優(yōu)選的，用于抑制神經(jīng)氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。本發(fā)明還提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物制劑，該制劑以所述的山香圓葉乙 醇滲漉提取物為主要活性成分。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分，山香 圓葉乙醇滲漉提取物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨酸 酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)，山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠通過(guò)抑制 流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流 感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒對(duì)細(xì)胞的感染、生長(zhǎng)，以及預(yù)防和治療流感及其并 發(fā)癥。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，其是通過(guò)將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉 提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸漬12 72小時(shí)后，以 1 8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至 稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例1制備方法取山香圓葉粗粉，用50%乙醇作為提取劑，浸漬24小時(shí)后，以7ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山 香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例2制備方法取山香圓葉粗粉，用60%乙醇作為提取劑，浸漬48小時(shí)后，以2ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例3制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸漬48小時(shí)后，以5ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例4制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸漬36小時(shí)后，以2ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例5制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸漬36小時(shí)后，以4ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例6制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸漬12小時(shí)后，以3ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例7制備方法取山香圓葉粗粉，用80%乙醇作為提取劑，浸漬24小時(shí)后，以6ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例8制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸漬72小時(shí)后，以4ml/kg/ 分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香 圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1、提取工藝優(yōu)化研究山香圓葉主要含黃酮類、有機(jī)酸等化合物，黃酮類化合物以乙醇提取效果較佳，因此，我們以乙醇濃度(A)、收集乙醇量(B)、滲漉速度(C)、浸漬時(shí)間(D)四項(xiàng)作為考察因素， 每一因素設(shè)三個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1、表2)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu) 化研究，考察指標(biāo)為總黃酮提取率。
表1因素水平表 取山香圓葉藥材27份，每組平均三份，共九組，按表1L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試 驗(yàn)。結(jié)果見表2。表2L9 (34)正交試驗(yàn)表 方差分析將正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。表3以總黃酮提取率為指標(biāo)的方差分析

結(jié)論直觀分析可知，收集乙醇量(B)對(duì)提取效果影響較大，浸漬時(shí)間(A)、滲漉速 度(C)及乙醇濃度(D)對(duì)提取效果影響較小。表3方差分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了直觀分析結(jié) 論，即因素B對(duì)提取效果有較大影響。結(jié)合K值分析，確定提取條件為取山香圓葉，用70% 乙醇浸漬72小時(shí)后，以3 6ml/kg/分鐘滲漉，收集藥材10倍量滲漉液，回收乙醇，減壓濃 縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用取實(shí)施例4制備方法所獲得的山香圓葉乙醇滲漉提取物，加適量水使溶解，應(yīng)用 神經(jīng)氨酸酶抑制劑鑒定試劑盒測(cè)定山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經(jīng)氨酸酶(N1)的效價(jià) 見表1。(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 yl神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)緩 沖液；b.每孔再分別加入0、1、2、5、7. 5、10iU H5m神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入0 20 yl Milli-Q 水。(2).樣品檢測(cè)的準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 u 1神經(jīng)氨酸酶檢測(cè) 緩沖液；b.每孔再加入10 u 1 H5N1神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入0 10 ill山香圓葉乙醇滲 漉提取物樣品；d.每孔再加入0 10 ill Milli-Q水。(3).檢測(cè)步驟a.振動(dòng)混勻約lmin ；b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5W神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品 也一起孵育；c.每孔加入10 U 1神經(jīng)氨酸酶熒光底物；d.再振動(dòng)混勻約lmin ；e. 37°C孵育20 30min后進(jìn)行熒光測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm。(4).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品對(duì)于H5W神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度 曲線后計(jì)算出山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)于H5m神經(jīng)氨酸酶的IC50。山香圓葉乙醇滲漉 提取物達(dá)到對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率IC50為13. 35mg/ml。見表4。表4.山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經(jīng)氨酸酶的活性
提取物 檢測(cè)靶酶靶酶底物提取物濃度酶抑制率(效價(jià))
山香圓葉乙神經(jīng)氨酸 54_68mg/ml77.3%神經(jīng)氨酸
醇滲漉提取酶熒光底 13.35mg/ml50.0%
酶(N1)
物物 3.58mg/100ml9.8%根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看到(1).山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分；(2).山香圓葉乙醇滲漉提取物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的 能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)；(3).由上述實(shí)驗(yàn)可見，山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠通過(guò)抑制流感病毒表面神經(jīng) 氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，
7從而減少了流感病毒對(duì)細(xì)胞的感染、生長(zhǎng)，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥。醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無(wú)法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨酸 酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知山香圓葉乙醇滲漉提取物具有預(yù)防和治療流感病毒性感冒的 良好效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)3 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)流感病毒感染雞胚的抑制作用取山香圓葉乙醇滲漉提取物，加適量水使溶解，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株 (FM1) (H1N1)鑒定山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制FM1流感病毒在雞胚中復(fù)制和抑制的能 力。(1).將FM1流感病毒液接種于10天齡無(wú)特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0.2ml，37°C 孵育72小時(shí)，觀察并計(jì)算半數(shù)雞胚感染量(EID50)。(2).山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)雞胚 的毒性作用采用，無(wú)菌生理鹽水對(duì)山香圓葉乙醇滲漉提取物作系列稀釋后接種于10天齡 無(wú)特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0. 2ml，每個(gè)濃度接種6胚，37°C孵育，觀察雞胚生長(zhǎng)發(fā)育 情況，以雞胚可存活96小時(shí)的最大濃度作為藥物的TD。(3).山香圓葉乙醇滲漉提取物在 雞胚中對(duì)流感病毒的抑制作用采用，0. lml的流感病毒液和不同稀釋度的山香圓葉乙醇滲 漉提取物混合，37°C作用2小時(shí)，接種于10天齡無(wú)特定病原體雞胚尿囊腔，每組接種6胚， 37°C孵育72小時(shí)。病毒攻擊量為50EID50，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、無(wú)菌生理鹽水正常對(duì)照，計(jì)算 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)病毒抑制作用的半數(shù)有效劑量(ED50)。(1).FM1流感病毒對(duì)雞胚的毒力經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，其EID50為10_5_°7。(2). 山香圓葉乙醇滲漉提取物接種于雞胚后，其生長(zhǎng)發(fā)育與正常對(duì)照組基本一致。96小時(shí) 雞胚均存活。雞胚給予山香圓葉乙醇滲漉提取物原液未見雞胚死亡，所以可認(rèn)為TD0為 9.2g/100ml。(3).山香圓葉乙醇滲漉提取物在雞胚中對(duì)流感病毒的抑制作用見表5。表5.山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)流感病毒感染雞胚的抑制作用 與病毒對(duì)照組比較*P < 0. 05由表5可知，山香圓葉乙醇滲漉提取物在22. 5 90. Omg/ml對(duì)流感病毒有顯著的 抑制作用(P < 0. 05)，ED50 為 31. 5mg士 2. 76mg/ml, TI 為 13. 94士 1. 42。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)FM1流感病毒影響取山香圓葉乙醇滲漉提取物，加適量水使溶解，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株 (FM1) (H1N1)鑒定山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制FM1流感病毒毒力的能力。(1). FM1對(duì)狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)的毒力測(cè)定采用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)微量法。(2).山香圓葉乙 醇滲漉提取物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性測(cè)定采用無(wú)血清的DMEM對(duì)山香圓葉乙醇滲漉提取物作系 列稀釋后接種于已形成單層的MDCK細(xì)胞孔中，每孔100 u 1，每個(gè)稀釋度重復(fù)4個(gè)孔，同時(shí) 設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù) 觀察3天，以“+ ++++”記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最 大無(wú)毒濃度(TD0)。(3).山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制FM1流感病毒作用測(cè)定MDCK細(xì)胞 5X 105/ml，每孔100 u 1，分別于96孔板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日吸去孔中培養(yǎng) 液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100iil，37°C吸附lh后吸去上清液。用磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗2次，以藥物的TD0為第1孔，再用無(wú)血清的DMEM液對(duì)山香圓葉乙醇滲漉提取物 作系列稀釋，分別加入上述已感染病毒的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和正常對(duì)照組，37°C、5% C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察流感病毒產(chǎn)生的MDCK細(xì)胞病變特征，即單層細(xì)胞變性變圓等，連 續(xù)3天，計(jì)算出藥物的50%抑制病變濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。TI的計(jì)算TI = TD50/ IC50，TI值越大，表明藥物的安全范圍越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney檢驗(yàn)法比 較試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組細(xì)胞病變的差異，對(duì)藥物劑量和對(duì)病毒感染細(xì)胞避免發(fā)生細(xì)胞病變 (CPE)的抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效反應(yīng)關(guān)系。(1).FM1流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的毒力經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，其TCID50為10_4 81。 (2).山香圓葉乙醇滲漉提取物MDCK細(xì)胞的TD0分別為1105. 8mg士23. 55mg/100ml。(3). 將山香圓葉乙醇滲漉提取物作系列稀釋后，對(duì)100TCID50流感病毒進(jìn)行抑制試驗(yàn)，計(jì)算藥 物的半數(shù)有效量IC50及TI值大小，結(jié)果見表6。表6.山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)FM1流感病毒的IC50(mg/100ml)及TI(x士s) 由表6可知，山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制FM1流感病毒致細(xì)胞病變的作用均隨 著藥物劑量的增加而增強(qiáng)。對(duì)藥物劑量和藥物對(duì)CPE的抑制率進(jìn)行的相關(guān)性分析表明，山 香圓葉乙醇滲漉提取物的劑量與藥物對(duì)CPE抑制率之間呈明顯的正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)5 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FM1株的死亡保 護(hù)結(jié)果取山香圓葉乙醇滲漉提取物，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FM1) (H1N1)鑒定 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FM1株的死亡保護(hù)作用。(1).流感病毒 FM1株病毒做10倍倍比稀釋后分別接種每組10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚輕度麻醉 后，每組分別給與不同稀釋度的病毒，每只小鼠滴鼻接種20 yl。觀察10天的小鼠死亡情 況，按Reed-Muench法計(jì)算LD50為10_136。故確定實(shí)驗(yàn)所用的造模濃度為10LD50。(2).山 香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FM1株的死亡保護(hù)作用正常對(duì)照組、流 感病毒FM1株病毒對(duì)照組、山香圓葉乙醇滲漉提取物11. 25mg/ml、22. 5mg/ml、45. Omg/ml、 90. Omg/ml劑量組等分別灌胃，灌胃容量均為0. 4ml/只。3天后，除正常對(duì)照組外各組在乙鼻感染小鼠20 u 1/只。同時(shí)正常對(duì)照組給予同 體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給藥，正常對(duì)照組和流感病毒FM1株病毒對(duì)照組給生理鹽 水8天，劑量同上。逐日觀察動(dòng)物發(fā)病和記錄死亡數(shù)，共觀察14天，計(jì)算死亡率(死亡率= 每組死亡數(shù)/每組小鼠總數(shù)X 100%)，結(jié)果見表7。(3).山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠 體內(nèi)感染流感病毒FM1株肺指數(shù)的影響正常對(duì)照組、流感病毒FM1株病毒對(duì)照組、山香圓 葉乙醇滲漉提取物11. 25mg/ml、22. 5mg/ml、45. 0mg/ml、90. Omg/ml劑量組等分別灌胃，灌 胃容量均為0. 4ml/只。3天后，除正常對(duì)照組外各組在乙醚輕度麻醉下用1. 0LD50流感病 毒FM1株滴鼻感染小鼠20iU/只。同時(shí)正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼 續(xù)給藥，正常對(duì)照組和流感病毒FM1株病毒對(duì)照組給生理鹽水8天，劑量同上。于病毒感染 后第8天處死小鼠，稱體重，取肺稱肺重，計(jì)算肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量X 100 % )； 此外，取脾稱脾重，計(jì)算脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量X 100% )，結(jié)果見表7。
表7.山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FM1株的死亡保護(hù)結(jié)果 注※※P < 0. 01VS流感病毒模型組表8.山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒FM1株的脾指數(shù)和肺指 數(shù)的影響 注##P < 0. 01VS正常對(duì)照組 ※？ < 0. 05VS流感病毒模型組(1).由表7可知，山香圓葉乙醇滲漉提取物在45.0 90. Omg/ml對(duì)流感病毒感染 小鼠有顯著的保護(hù)作用(P < 0. 01)。(2).由表8可知，山香圓葉乙醇滲漉提取物在90. Omg/ml對(duì)流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制率有顯著的作用(P < 0. 05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)6 山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)慢性腎功能衰竭的影響1)SD大鼠，200 240g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(滬)2003-00022)試劑及藥物腺嘌呤，腺嘌呤(含量>98%，為進(jìn)口分裝，中國(guó)上海，批號(hào) 20010520)，實(shí)施例4制備方法所獲得的山香圓葉乙醇滲漉提取物；3)試驗(yàn)方法雄性SD大鼠，體重220g左右，先用普通飼料喂養(yǎng)10天正常生長(zhǎng)后， 按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、給藥實(shí)驗(yàn)組和造模對(duì)照組，每組12只。給藥實(shí)驗(yàn)組和造模對(duì) 照組用腺嘌呤灌胃制作慢性腎功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg d)灌胃，用蒸 餾水制成混懸液約2ml/只，共20天；20天后給藥，給藥實(shí)驗(yàn)組以山香圓葉乙醇滲漉提取物 1.2g/(kg.d)灌胃，山香圓葉乙醇滲漉提取物以蒸餾水制成混懸溶液(0. 2g/ml)，每次約 2ml/只，分次灌胃，正常對(duì)照組和造模對(duì)照組以等體積水灌胃，給藥35天后將大鼠用乙醚 麻醉.鼠尾動(dòng)脈采血觀察各項(xiàng)指標(biāo)。4)結(jié)果表9.山香圓葉乙醇滲漉提取物對(duì)CRF大鼠腎功能的影響 注經(jīng)T檢驗(yàn)，給藥實(shí)驗(yàn)組與造模對(duì)照組比較“*”表示P < 0.05，“**”表示卩 < 0. 01本實(shí)驗(yàn)用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模對(duì)照組大鼠精神萎靡，體重明顯 降低，血清BuruSer明顯升高，Hb明顯下降，Ret明顯升高，表明大鼠腎功能受損，經(jīng)給予山 香圓葉乙醇滲漉提取物治療后.大鼠精神明顯振作，體重逐漸恢復(fù)，提高肌酐清除率，促進(jìn) 代謝產(chǎn)物的排出，降低血清BUN、SCr濃度，腎功能和貧血明顯改善，表明山香圓葉乙醇滲漉 提取物對(duì)腺嘌呤所致大鼠腎損傷有防治作用。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看到(1).山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠提取出有效的防治慢性腎功能衰竭成分；(2).山香圓葉乙醇滲漉提取物在具有抑制神經(jīng)氨酸酶活性的作用同時(shí)，還具有治 慢性腎功能衰竭的作用，克服了達(dá)菲嚴(yán)對(duì)肌酐清能力差和腎功能衰竭人群的副作用，反之 還有防治效果。
1權(quán)利要求
一種山香圓葉乙醇滲漉提取物，通過(guò)將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25～90％乙醇作為提取劑，浸漬12～72小時(shí)后，以1～8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4～14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸漬24 72小時(shí)后，以1 7ml/kg/分鐘的速度 進(jìn)行滲漉，收集藥材5 13倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙 醇滲漉提取物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取 山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑，浸漬24 48小時(shí)后，以1 6m/kg/分鐘的 速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓 葉乙醇滲漉提取物。
4.如權(quán)利要求3所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑，浸漬48小時(shí)后，以1 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行 滲漉，收集藥材5 10倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲 漉提取物。
5.如權(quán)利要求3所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸漬36小時(shí)后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行 滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲 漉提取物。
6.如權(quán)利要求5所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸漬36小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉， 收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
7.如權(quán)利要求1所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸漬12小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行 滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲 漉提取物。
8.如權(quán)利要求1所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物，具體的滲漉提取方法如下取山香 圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸漬72小時(shí)后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉， 收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
9.權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā) 癥疾病的藥物的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其特征在于抑制流感病毒。
11.權(quán)利要求9的用途，其特征在于抑制流感病毒FM1。
12.權(quán)利要求9的用途，其特征在于抑制神經(jīng)氨酸酶。
13.權(quán)利要求9的用途，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。
14.權(quán)利要求9的用途，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。
15.一種山香圓葉乙醇滲漉提取物制劑，其特征在于，該制劑以權(quán)利要求1 8任一項(xiàng) 山香圓葉乙醇滲漉提取物為主要活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山香圓葉乙醇滲漉提取物，通過(guò)將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25-90％乙醇作為提取劑，浸漬12～72小時(shí)后，以1-8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4～14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物，該提取物可作神經(jīng)氨酸酶抑制劑用在預(yù)防和治療流感，制成藥學(xué)上可以接受的劑型。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101862358SQ20101014488
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者劉地發(fā), 呂武清, 唐春山, 張華敏, 李志勇, 楊小玲, 王燕平, 程帆, 謝寧 申請(qǐng)人:江西山香藥業(yè)有限公司