專利名稱：一種全人源抗her2單克隆抗體、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種全人源單克隆抗體、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一。全世界每年新增100萬以上的乳腺癌病例，而且每年近40萬人死于乳腺癌。近年來，乳腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯的上升趨勢。無論是在高流行區(qū)還是低流行區(qū)，乳腺癌發(fā)病率均已5 20%的速度上升。亞洲婦女的乳腺癌發(fā)病率的增長趨勢已明顯高于歐美國家。在中國，乳腺癌在一些城市已發(fā)展為女性惡性腫瘤發(fā)病的首位。乳腺癌通常的治療手段有手術(shù)治療，放化療和內(nèi)分泌治療等等， 這些常規(guī)治療手段雖然在很大程度上延長了病人生存期，然而它們副作用很大，其療效難以進(jìn)一步提高。腫瘤靶向治療是近年來興起的一種新的腫瘤治療方式，其中具有代表性的是抗腫瘤單克隆抗體。HER2(人表皮生長因子受體 2,human epidermal growth factor receptor 2)是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，分子量約為185KD?？笻ER2人源化單克隆抗體可以特異性的和HER2結(jié)合，其抗腫瘤機(jī)制包括以下幾點(diǎn)特異結(jié)合于HER2受體胞外段從而阻斷HER2同源二聚體的組成性激活并干擾HER2與其它ErbB家族成員形成異源二聚體。 介導(dǎo)HER2受體的內(nèi)吞和在溶酶體中的降解；活化PTEN(與tensin同源的磷酸酯酶)阻斷PI3K (磷酸肌醇3-激酶)信號通路；調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；抗腫瘤血管生成；ADCC(抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)作用；抑制DNA修復(fù)； 增加化療藥物的細(xì)胞毒性；逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對宿主細(xì)胞因子殺傷作用的抵抗等(Pergram M, Ngo D, Application and potential limitations of animal modelsutilized in the
development of trastuzumab(Herceptin )A case study. Adv DrugDeliv Rev. 2006 ；58 723-34.)?？笻ER2人源化單克隆抗體(Trastuzumab，商品名Here印tin)已被用于臨床試驗，作為單藥治療HER2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，這些患者曾接受過針對其轉(zhuǎn)移灶1 個或1個以上化療方案化療而失敗。本藥在臨床試驗中還與紫杉醇或蒽環(huán)類藥物(阿霉素或表阿霉素)加環(huán)磷酰胺合用作為一線藥物，治療HER2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌(Merlin JL, Barberi-Heyob Μ, Bachmann N, Invitro comparative evaluation of trastuzumab(Herceptin)combined with paclitaxel(Taxol) or docetaxel(Taxotere) in HER2_expressing human breast cancer cell lines. Ann Oncol. 2002 ;13 :1743-8.)。但 Trastuzumab是一個人源化抗體，保留了鼠源⑶R區(qū)和少量FR區(qū)鼠源殘基，仍未能達(dá)到全人源化，且存在著親和力不高的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建了大容量的天然人源噬菌體抗體庫，從中篩選獲得了一株全人源抗HER2 抗體 3E12。更具體地，本發(fā)明公開的全人源抗HER2抗體，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO 8所示；本發(fā)明公開的上述全人源抗HER2抗體，重鏈氨基酸序列為SEQ ID N0:10所示，輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 12所示；本發(fā)明還公開了一種核苷酸序列，編碼上述的全人源抗HER2抗體；本發(fā)明公開的上述核苷酸序列，其中編碼全人源抗HER2抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO 5所示，編碼全人源抗HER2抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO :7所示；本發(fā)明公開的上述核苷酸序列，其中編碼全人源抗HER2抗體重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 9所示，編碼全人源抗HER2抗體輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 11所示；本發(fā)明還公開了一種表達(dá)載體，含有上述的核苷酸序列，為PCDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)；本發(fā)明還公開了上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，為CHO-Kl細(xì)胞；本發(fā)明進(jìn)一步公開的上述全人源抗體的制備方法，包括從噬菌體人源抗體庫篩選獲得高親和力全人源抗HER2單鏈抗體；全人源抗HER2完整抗體分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建； 全人源抗HER2完整抗體分子在CHO細(xì)胞中的表達(dá)；全人源抗HER2完整抗體分子的純化。本發(fā)明最后公開的上述的全人源抗體在制備治療抗腫瘤藥物中的用途，所述的腫瘤為HER2高表達(dá)腫瘤，更具體的為乳腺癌。本發(fā)明利用得到的抗體進(jìn)行了一系列實驗，實驗結(jié)果表明與人源化抗體 Trastuzumab (rhumAb 4D5)和中國專利申請?zhí)?1132225. X申請日2001年11月16日發(fā)明名稱為《人源化抗HER2單克隆抗體及其制法和藥物組合物》中公開的人源化抗體hGHO/Ι相比，3E12具有更高的抗體親和力，更強(qiáng)的HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性；體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果表明，本發(fā)明得到的抗體可以明顯抑制腫瘤的增長。


圖1.抗HER2抗體的凋亡實驗結(jié)果(其中圖1-1為SK-BR3細(xì)胞，圖1-2為BT-474 細(xì)胞，圖1-3為MCF-7細(xì)胞)；圖2.抗HER2抗體的的生長抑制實驗結(jié)果(其中圖2-1為SK-BR3細(xì)胞，圖2-2為 BT-474細(xì)胞，圖2-3為MCF-7細(xì)胞)；圖3.抗HER2抗體的體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例、實驗例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例抗體的制備(1)人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆用淋巴細(xì)胞分離液(鼎國生物技術(shù)發(fā)展公司產(chǎn)品)分離健康人淋巴細(xì)胞，用 Trizol試劑anvitrogen公司產(chǎn)品)提取總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)(Cell，1980，22 :197-207)和文獻(xiàn)(NucleicAcids Research, 1982,10 :4071-4079)報道的序列分別設(shè)計引物采用 RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到 pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，測序驗證后確認(rèn)獲得了正確的克隆。SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(Ch)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CJ的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/Q。(2) cDNA 的制備收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴細(xì)胞分離液(醫(yī)科院天津血研所生產(chǎn))分離單個核細(xì)胞。用iTrizol試劑anvitrogen公司)從分離的人外周血淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞的總RNA。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄出 cDNA。以上步驟按照廠家提供的說明書進(jìn)行。(3)引物設(shè)計參考文獻(xiàn)(Immunotechnology，1998，3 :271-278)設(shè)計并合成克隆人抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)基因的 VHBack，VaFor, VJack 和 \For 引物。VHBack，VaFor, VLBack 和 VLFor 的序列見 Immunotechnology，1998,3 :271_278。其中在 V11Back 引物的 5，端加上含有Sfi I位點(diǎn)的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在V11For引物的5’端加上序 ^lJ gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VlBack 弓|物的 5，端力口上序列 tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VLFor 弓|物的 5，端力口上含有 Not I 位點(diǎn)的序列 atg egg ccg C。(4)噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選采用(2) 4^々cDNAfP (3)中的弓|物，利用 recombinant Phage antibodysystem 試劑盒(Amersham Biosciences公司)構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫，然后用特異性抗原對文庫進(jìn)行淘選?？贵w庫構(gòu)建和淘選方法參照recombinant Phageantibody system試劑盒說明書進(jìn)行，用于淘選的特異性抗原“人HER2膜外區(qū)蛋白”按照參考文獻(xiàn)(Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89 =4285-4289)的方法制備。經(jīng)多次淘選抗體庫后獲得了一株抗人HER2單鏈抗體3E12kFv，測序后獲得其基因序列。SEQ ID NO :5禾口 SEQ ID NO :6分別顯示了 3E12kFv 重鏈可變區(qū)Vh的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8分別顯示了 3E12ScFv輕鏈可變區(qū)\的核苷酸序列和氨基酸序列。(5)全人源抗體在真核細(xì)胞中的表達(dá)以3E12&FV基因和pGEM_T/CH為模版，通過重疊PCR合成全人源抗體重鏈基因，反應(yīng)條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。并使此全人源抗體重鏈基因的5'端含有限制酶位點(diǎn)HindIII和信號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點(diǎn)EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG CTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最后瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物， 回收目的條帶并克隆到PGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，篩選陽性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體重鏈片段 3E12VhCh,與用 HindIII 和 EcoR I 酶切的質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司)進(jìn)行連接， 構(gòu)建成全人源重鏈真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+) (3E12VhCh)。以3E12&FV基因和pGEM-T/Q載體為模板，通過重疊PCR合成全人源化抗體輕鏈基因，反應(yīng)條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘，得到PCR產(chǎn)物，其5'端含有限制酶位點(diǎn)HindIII和信號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點(diǎn)EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑選測序正確的克隆用 HindIII 和 EcoR I 酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體輕鏈片段3E 12VlCl,與用HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1/ZE0(+) anvitrogen公司)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成全人源輕鏈真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (3E12VLCL)。于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細(xì)胞(ATCC CRL-9618)，細(xì)胞培養(yǎng)至90% -95%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒101^(質(zhì)粒？(^嫩3.1(+) (3E 12VHCH) 4 μ g，質(zhì)粒 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (3E 12VLCL)6y g)和 20 μ lLipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司產(chǎn)品)按LipofectamindOOOReagent試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含 600 μ g/ml G418 (Invitrogen 公司產(chǎn)品)禾口 250 μ g/ml Zeocin (Invitrogen 公司產(chǎn)品)的 DMEM培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達(dá)克隆羊抗人IgG(Fe) (KPL公司)包被于ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉2h，加入待測的抗性克隆培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)品Human myeloma IgGl, κ (Sigma)，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人 IgG (κ) ((Southern Biotechnology Associates 公司)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37°C 溫育 lh，加入 TMB顯色液于37°C作用5min，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A45tl值。將篩選得到的高表達(dá)克隆用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用I^rotein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離純化全人源抗體3E12。 將純化抗體用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO :9和SEQ ID NO: 10分別顯示了全人源抗體3E12的重鏈核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQ ID N0 12 分別顯示了全人源抗體3E12的輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列。實驗例hGH0/l按中國專利申請?zhí)?1132225. X申請日2001年11月16日發(fā)明名稱為《人源化抗HER2單克隆抗體及其制法和藥物組合物》中公開的方法制備得到?？笻ER2抗體的凋亡實驗將人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3 (HER2 高表達(dá)，ATCC 號HTB_30)、BT-474 (HER2 中表達(dá)， ATCC號HTB-20)及MCF-7(HER2低表達(dá)，ATCC號HTB_22)分別與不同稀釋度的抗HER2抗體(包括！"rastuzumab，hGH0/l，3E 12)在37°C培養(yǎng)20小時，洗細(xì)胞后用AnnexinV/PI試劑盒(BD公司產(chǎn)品)按照產(chǎn)品說明書檢測早期凋亡細(xì)胞百分率?？沟蛲鰧嶒炄鐖D1所示3E12 抗體殺傷SK-BR3細(xì)胞的能力明顯強(qiáng)于Trastuzumab抗體和hGH0/l (在抗體濃度彡0. 025nM 的濃度的時候，P < 0. 05，t檢驗，同樣的結(jié)果也在BT-474細(xì)胞中得到證實(在抗體濃度彡0. 025nM的濃度的時候，P < 0. 05，t檢驗。然而，在HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中，3E12 抗體殺傷能力與Trastuzumab抗體和hGH0/l抗體差不多。這些結(jié)果顯示了 3E12抗體殺傷細(xì)胞的HER2特異性，且其殺傷HER2中高表達(dá)的細(xì)胞的能力要強(qiáng)于Trastuzumab抗體和 hGH0/l 抗體?？笻ER2抗體的的細(xì)胞生長抑制實驗將人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3、BT-474及MCF-7細(xì)胞分別與不同稀釋度的抗HER2抗體在37°C進(jìn)行孵育，第五日用MTT染色法染色讀數(shù)后計算生長抑制率。生長抑制實驗如圖2 所示3E12抗體對SK-BR3細(xì)胞的生長抑制能力明顯強(qiáng)于Trastuzumab抗體和hGH0/l (在抗體濃度> 0. InM的濃度的時候，P < 0. 05，t檢驗)，同樣的結(jié)果也在BT-474細(xì)胞中得到證實(在抗體濃度彡0. InM的濃度的時候，P <0.05，t檢驗)。然而，在HER2低表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞中，3E12抗體對細(xì)胞的抑制能力與Trastuzumab抗體和hGHO/Ι抗體差不多。這些結(jié)果顯示了 3E12抗體對細(xì)胞生長抑制的的HER2特異性，且其抑制HER2中高表達(dá)的細(xì)胞的能力要強(qiáng)于Trastuzumab抗體和hGHO/Ι抗體?？笻ER2抗體的體內(nèi)抗腫瘤實驗SCID小鼠(購自上海斯萊克公司)于0天時分別皮下接種高度表達(dá)表達(dá)HER2的人乳腺癌細(xì)胞BT-474，待腫瘤長至0. 3cm3時給荷瘤小鼠分別腹腔注射0. 5，5mg/kg的各種抗HER2抗體，每周2次，連續(xù)治療3周。定期觀測各組小鼠體重和腫瘤大小的變化，共觀察 120天。評價抗HER2抗體的抗腫瘤治療效果。體內(nèi)抗腫瘤實驗如圖3所示3E12抗體對高表達(dá)HER2的BT-474乳腺癌的的生長抑制能力明顯強(qiáng)于Trastuzumab抗體和hGHO/1 (在 25mg/kg 的劑量時，第 50、60、70、80、90、100、110、120 天的時候，P < 0. 05，Mann-Whitney 檢驗)。
權(quán)利要求
1.一種全人源抗HER2抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
2.權(quán)利要求1所述的全人源抗HER2抗體，其重鏈氨基酸序列如SEQIDNO 10所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示。
3.一種核苷酸序列，編碼權(quán)利要求1 2任一所述的全人源抗HER2抗體。
4.權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其中編碼全人源抗HER2抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，編碼全人源抗HER2抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO 7 所示。
5.權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其中編碼全人源抗HER2抗體重鏈的核苷酸序列如 SEQ ID NO :9所示，編碼全人源抗HER2抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示。
6.一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求3 5任一所述的核苷酸序列，為pcDNA3. 1/ZE0(+)或 pcDNA3. 1 (+)。
7.一種轉(zhuǎn)化權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，為CHO-Kl細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1 2任一所述的全人源抗HER2抗體制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
9.權(quán)利要求8所述的用途，其中腫瘤為HER2高表達(dá)腫瘤。
10.權(quán)利要求9所述的用途，其中HER2高表達(dá)腫瘤可為乳腺瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種全人源抗HER2單克隆抗體、其制備方法及用途。本發(fā)明構(gòu)建了大容量的天然人源噬菌體抗體庫，從中篩選獲得了一株全人源抗HER2抗體3E12，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO6所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO8所示。另外，本發(fā)明還公開了3E12抗體的制備方法以及編碼3E12抗體的核苷酸序列、含該核酸序列的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的3E12抗體與人源化抗HER2抗體Trastuzumab相比，具有更高的抗體親和力，更強(qiáng)的HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，可明顯抑制腫瘤的增長，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P15/14GK102167742SQ20101012524
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者仝昕, 李川, 闞穎 申請人:百邁博藥業(yè)有限公司