專利名稱：一種測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銀杏提取物中總銀杏酸的測定方法。
背景技術(shù)：
銀杏(Ginkgo Biloba)是現(xiàn)存種子植物中最古老的一種，也是可上溯到2億多年
前二世紀(jì)時的銀杏家族的唯一的幸存者。在中國，銀杏制劑用于治療已有5000多年了，也
就是說，從中草藥的最早起源就開始用于治療了。自六十年代以來，銀杏葉的植物提取物在
很多國家用于治療腦血管及周圍血管疾病，如德國、法國、日本和韓國。 銀杏葉的主要成分是黃酮類化合物，它包括至少14種不同的化合物，例如黃酮
醇、黃酮、黃烷酮和雙黃酮等等，在這些化合物中，黃酮苷和黃酮醇苷包括山奈素、槲皮素
和異鼠李素與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合物，是市場上用于治療目的的銀杏提取物(Tebonin、
Tanakan、 Roekan或EGb761)中最顯著的部分，實(shí)驗(yàn)表明黃酮苷和黃酮醇苷為有力的抗氧
劑，可清除氧自由基從而避免由于年齡老化而引起的細(xì)胞和組織損傷，它們會嚴(yán)重影響大
腦功能，包括記憶力和注意力。另外黃酮苷和黃酮醇苷也可以改善周圍血管循環(huán)。 另外，除銀杏黃酮外，銀杏葉中另一活性成分是帖內(nèi)酯，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M
和白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯為含內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的帖類。最近發(fā)現(xiàn)由于它們拮抗血小板活化因子(PAF)
的特性，銀杏內(nèi)酯A、 B、 C、 M特別是白果內(nèi)酯能有效地治療血小板活化因子誘發(fā)疾病如哮
喘、支氣管炎、老年性癡呆、過敏、心功能失調(diào)、風(fēng)濕病等等以及其它循環(huán)系統(tǒng)疾病。 除上述化合物外，銀杏葉至少含有12種烷基酚酸化合物，包括銀杏酸，它是6-烷
基水楊酸，烷基為正13碳到正19碳有0-3個雙鍵的烷基基團(tuán)。銀杏酸是銀杏提取物毒性
作用的因素，這些毒性作用包括胃腸道副作用、頭痛、皮膚剌激和水腫。六十年代以來，已有
多例接觸過銀杏葉和果實(shí)后出現(xiàn)過敏反應(yīng)的報告，因此對銀杏酚酸的準(zhǔn)確測定對銀杏類制
劑，尤其是注射劑的安全性顯得十分的重要?！吨袊幍洹?005版中對總銀杏酸含量測定，在供試品溶液的制備中，直接取銀杏 提取物粉末約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚(60 90°C )50ml，稱定重 量，回流提取2小時，放冷，再稱定重量，用石油醚(60 90°C)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾 過。精密量取續(xù)濾液25ml，減壓回收溶劑至干，精密加入甲醇2ml，密塞，搖勻，即得。色譜 分析條件色譜柱為十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇-1%冰醋酸(90 : 10);流 速lmL/min，檢測波長為310nm。本法取樣量大，測定結(jié)果受到樣品性狀的影響比較大，，如 果樣品吸潮，發(fā)粘測定的結(jié)果會明顯偏低，回流時間長?！端帉W(xué)學(xué)報》2003年第38巻第11期的論文"高效液相色譜法測定銀杏葉提取物及
其制劑中銀杏酸的含量"，報道了銀杏葉提取物及其制劑經(jīng)石油醚提取，提取液濃縮后用石
油醚定容，HPLC直接測定.色譜分析條件色譜柱為Inertsil 0DS_2，流動相為甲醇-3%
冰醋酸溶液(92 : 8)，流速1. OmL/min，柱溫40°C ，紫外檢測波長310nm?！斗治龌瘜W(xué)研究簡報》2004年第32巻第5期的論文"銀杏酸的分光光度法測定"，報
道了銀杏酸粗提物經(jīng)硅膠柱色譜一次預(yù)凈化處理后，分光光度法在242nm或310nm波長測銀杏酸，與在310nm波長處用HPLC法測量的結(jié)果相當(dāng)。色譜分析條件色譜柱為Inertsil 0DS-2，流動相為甲醇_3%冰醋酸溶液(92 : 8)，流速1. OmL/min，柱溫40°C ，紫外檢測波長 310nm。其間需要制成幾個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品經(jīng)硅膠柱色譜一 次預(yù)凈化處理；銀杏酸單體的制備及吸光系數(shù)的測定，操作比較復(fù)雜。 由于現(xiàn)有文獻(xiàn)對銀杏提取物總銀杏酸的提取測定缺乏系統(tǒng)的研究，而且分析樣品 制備的提取方法也存在樣品取樣量大、提取回流時間長、測定結(jié)果偏低的缺點(diǎn)，所以有必要 尋求更有效測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種取樣量小，分散均勻，比較準(zhǔn)
確的銀杏提取物中總銀杏酸的測定方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 —種測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，包括以下步驟 a、取白果新酸對照品，加甲醇制成定量用對照品溶液；另取總銀杏酸對照品，加甲 醇制成定位用對照品溶液； b、銀杏提取物加醇溶液，超聲，醇溶液用烷烴類溶劑萃取，收集烷烴類溶劑，減壓 回收溶劑至干，加甲醇定容，即得供試品溶液； c、依據(jù)高效液相色譜法測定，十八烷基鍵合硅膠填料的柱子，甲醇1%冰醋酸溶
液=90 : 10為流動相，檢測波長為310nm，流速lml/min. 取對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，得到色譜圖； d、計算供試品溶液中與總銀杏酸對照品相應(yīng)的色譜峰的總峰面積， 以白果新酸對照品外標(biāo)法計算總銀杏酸含量，即得。 在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b所述醇溶液優(yōu)選為甲醇溶 液。本發(fā)明在樣品制備過程中，采用了醇對銀杏提取物進(jìn)行溶解，優(yōu)選是甲醇溶液，對樣品 進(jìn)行溶解，這樣可以避免固體樣品進(jìn)行測定過程中由于酚酸成分包裹在固體中，容易導(dǎo)致 的不均勻，使到測定結(jié)果偏低。 在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b所述甲醇溶液的體積濃度優(yōu) 選為20 80 % ?？梢员苊馔闊N溶劑進(jìn)行萃取時候?qū)е碌娜榛F(xiàn)象，分層迅速，層界面清晰； 也避免了 2相的混溶，節(jié)省了操作時間及方便了萃取的操作。最佳體積濃度為70%。
在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b中銀杏提取物與醇溶液體積
比例為i : 6 i : 25，優(yōu)選為i : 18。 在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b中超聲時間為優(yōu)選20 60min。 在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b中所述烷烴類溶劑優(yōu)選為石 油醚。 在上述測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法中，步驟b中超聲后甲醇溶液用1 : 1 體積量的烷烴類溶劑的萃取4 6次，有助于充分將總銀杏酸萃取出來，提高了分析的準(zhǔn)確 度。優(yōu)選萃取的次數(shù)為5次。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1、在樣品制備過程中，采用了超聲提取的方法，利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng) 及熱效應(yīng)等增強(qiáng)溶劑對藥粉的穿透力，增加了提取物溶解和散的速度，有助于銀杏提取物 中總銀杏酸的溶出和分散均勻，對于物理性狀不好，粘稠，結(jié)塊的，難溶成分多的樣品也可 提高了分析的準(zhǔn)確度。 2、本發(fā)明的檢測方法的取樣量為5g，減少了取樣量，實(shí)驗(yàn)操作更方便。 3、本發(fā)明的檢測方法的樣品避免直接用甲醇或石油醚溶解，而是采用石油醚萃
取，祛除了部分雜質(zhì)，保護(hù)了 HPLC分析用柱子。 下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案
具體實(shí)施例方式
樣品為銀杏提取物，總銀杏酸含量為705卯m。 對比例1 :實(shí)施《中國藥典》2005年版本銀杏提取物中總銀杏酸的測定方案在供 試品溶液的制備中，直接取銀杏提取物粉末約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 石油醚(60 90°C )50ml，稱定重量，回流提取2小時，放冷，再稱定重量，用石油醚(60 90°C )補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，減壓回收溶劑至干，精密加入甲 醇2ml，密塞，搖勻，即得。色譜分析條件色譜柱為十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為 甲醇-1%冰醋酸(90 : 10);流速lmL/min，檢測波長為310nm。
表1、按《中國藥典》2005版測定總銀杏酸結(jié)果
序 號濾液測定總銀杏酸 (ppm)殘?jiān)倩亓鳒y 定總銀杏酸 (ppm)濾液測定 總銀杏酸RSD(%)
161370
254180
34527112.0
459720
560441 結(jié)果表明按上述方法，平行取5份樣品處理后，濾液測得總銀杏酸結(jié)果分別是 613卯m、541ppm、452卯m、597ppm、604卯m，且殘?jiān)俳?jīng)過回流處理，均含有總銀杏酸，且濾液 測定總銀杏酸結(jié)果的RSDX為12.0%。表明用此法樣品取樣量大，回流處理時間長，樣品總 銀杏酸分散不均勻，導(dǎo)致測量結(jié)果的RSDX達(dá)到12.0%，結(jié)果的準(zhǔn)確度不高。
實(shí)施例2 :實(shí)施本發(fā)明銀杏提取物中總銀杏酸的測定方案 取銀杏提取物粉末約5g，精密稱定，加40%甲醇溶液50ml，即銀杏提取物與溶劑
5比例為l : 10，超聲處理20min后，甲醇溶液用1 : l量的石油醚萃取3次，收集石油醚液， 減壓回收溶劑至干，精密加甲醇溶解，定容至5ml，即得供試品溶液。十八烷基鍵合硅膠柱， 甲醇1%冰醋酸溶液=90 : 10為流動相，檢測波長為310nm，流速lml/min。取對照品溶 液和供試品溶液分別進(jìn)樣，得到色譜圖。以外標(biāo)法計算得總銀杏酸含量。平行取3份樣品， 處理，測得總銀杏酸581卯m， RSDX為1. 7%。 實(shí)施例3 :同實(shí)施例2所示，不同的是加60%甲醇溶液，超聲處理20min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取4次。平行取3份樣品，處理，測得總銀杏酸620卯m， RSDX為 1. 4%。表明隨著超聲溶劑濃度升高到60%和萃取次數(shù)提到到4次，測量總銀杏酸含量有增 加的。 實(shí)施例4 :同實(shí)施例2所示，不同的是70%甲醇溶液，超聲處理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取4次，平行取3份樣品，處理，測得總銀杏酸677卯m， RSDX為 1. 4%。隨著超聲時間的增加，總銀杏酸的含量也有增加。 實(shí)施例5 :同實(shí)施例2所示，不同的是70%甲醇溶液，超聲處理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份樣品，處理，測得總銀杏酸697卯m， RSDX為 0. 98%。隨著萃取次數(shù)的增加，總銀杏酸的含量也有增加。 實(shí)施例6 :同實(shí)施例2所示，不同的是80%甲醇溶液，超聲處理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取6次，平行取3份樣品，處理，測得總銀杏酸693卯m， RSDX為 1.0%。超聲溶劑濃度增加到80%，萃取次數(shù)增加到6次，總銀杏酸反而有微量下降。
實(shí)施例7 :同實(shí)施例2所示，不同的是加70%甲醇溶液70ml，即銀杏提取物與溶 劑比例為l : 14，超聲處理30min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份樣 品，處理，測得總銀杏酸700卯m， RSD^為0眉。 實(shí)施例8 :同實(shí)施例2所示，不同的是加70X甲醇溶液90ml，即銀杏提取物與溶 劑比例為l : 18，超聲處理30min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份樣 品，處理，測得總銀杏酸705卯m， RSDX為0. 3%。 實(shí)施例9 :同實(shí)施例2所示，不同的是加70X甲醇溶液125ml，即銀杏提取物與溶 劑比例為l : 25，超聲處理60min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份樣 品，處理，測得總銀杏酸689卯m， RSDX為0. 7%。超聲所加溶劑125ml太大，一般分析用分 液漏斗最大用250ml。超聲60min，溶液溫度有明顯升高，容易導(dǎo)致結(jié)塊，影響總銀杏酸的分 布。
權(quán)利要求
一種測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，包括以下步驟a、取白果新酸對照品，加甲醇制成定量用對照品溶液；另取總銀杏酸對照品，加甲醇制成定位用對照品溶液；b、銀杏提取物加醇溶液，超聲，醇溶液用烷烴類溶劑萃取，收集烷烴類溶劑，減壓回收溶劑至干，加甲醇定容，即得供試品溶液；c、依據(jù)高效液相色譜法測定，十八烷基鍵合硅膠填料的柱子，甲醇∶1％冰醋酸溶液＝90∶10為流動相，檢測波長為310nm，流速1ml/min.取對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，得到色譜圖；d、計算供試品溶液中與總銀杏酸對照品相應(yīng)的色譜峰的總峰面積，以白果新酸對照品外標(biāo)法計算總銀杏酸含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b所述 醇溶液為甲醇溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b所述 醇溶液的體積濃度為20 80%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b所述 甲醇溶液的體積濃度為70%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b中，銀 杏提取物與醇溶液體積比例為1 : 6 1 : 25。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b中，銀 杏提取物與醇溶液體積比例為1 : 18。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b中，超 聲時間為20 60min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b中，所 述烷烴類溶劑為石油醚。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于步驟b 中，超聲后甲醇溶液用l:l體積量的烷烴類溶劑的萃取4 6次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，其特征在于所述萃取 的次數(shù)為5次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定銀杏提取物中總銀杏酸的方法，包括以下步驟將銀杏提取物用醇超聲溶解分散，用石油醚萃取，收集石油醚，回收溶劑至干，加甲醇定容，即得。本發(fā)明采用超聲提取方法，利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)等增強(qiáng)溶劑對藥粉的穿透力，增加了提取物溶解和散的速度，有助于銀杏提取物中總銀杏酸的溶出和分散均勻，對于物理性狀不好，粘稠，結(jié)塊的，難溶成分多的樣品也可提高了分析的準(zhǔn)確度。本發(fā)明的取樣量少，操作方便，樣品避免直接用甲醇或石油醚溶解，而是采用石油醚萃取，祛除了部分雜質(zhì)，保護(hù)了HPLC分析用柱子。
文檔編號A61K36/16GK101757050SQ201010117078
公開日2010年6月30日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者全一思, 劉翠紅, 李金華, 蔡鴻飛, 鐘鳴, 黃展平 申請人:廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司